一種固定化的藻毒素降解酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固定化的藻毒素降解酶的制備方法，該方法包括：(1)在第一溶劑存在下，用羧基活化劑將氧化石墨烯活化后固液分離，得到活化后的氧化石墨烯；(2)在第二溶劑存在下，將步驟(1)中得到的活化后的氧化石墨烯與功能化的四氧化三鐵納米粒子進(jìn)行接觸后固液分離，得到固相載體；(3)將藻毒素降解酶負(fù)載在固相載體上。本發(fā)明還提供了由上述方法制得的固定化的藻毒素降解酶，以及上述固定化的藻毒素降解酶在藻毒素降解中的應(yīng)用。通過本發(fā)明的方法，能夠低成本地將藻毒素降解酶制備成固定化的藻毒素降解酶，提高藻毒素降解酶的重復(fù)利用次數(shù)以及該酶的環(huán)境耐受性，且其反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制、藻毒素的降解率高。
【專利說明】一種固定化的藻毒素降解酶及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種固定化的藻毒素降解酶及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 藻毒素（Microcystins，MCs)是一類環(huán)狀七肽化合物，其結(jié)構(gòu)如下述式（1)所示。 目前已發(fā)現(xiàn)有67種藻毒素，這些藻毒素是根據(jù)環(huán)狀結(jié)構(gòu)中2、3、4和7位的氨基酸殘基不同 來劃分的。藍(lán)藻門中的浮絲藻屬（Planktothrix)、束絲藻屬（Aphanizomenon)、微囊藻屬 (Microcystis)中的某些種類都能產(chǎn)生此類毒素。
[0003] MCs污染會(huì)導(dǎo)致水體動(dòng)物的死亡，飲用被藻毒素污染的水可誘發(fā)人、畜、禽等肝 損傷、導(dǎo)致肝癌等，可見，MCs危害嚴(yán)重，直接威脅人類的健康和生存。最常見的MCs包括 MC-LR、MC-RR、MC-YR等，其中MC-LR的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中2和4位的氨基酸殘基分別為賴氨酸殘 基（L)和精氨酸殘基（R)，MC-RR的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中2和4位的氨基酸殘基都為精氨酸殘基（R)， MC-YR的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中2和4位的氨基酸殘基分別為酪氨酸殘基（L)和精氨酸殘基（R)。
[0004]

【權(quán)利要求】
1. 一種固定化的藻毒素降解酶的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 在第一溶劑存在下，用羧基活化劑將氧化石墨烯活化后固液分離，得到活化后的氧 化石墨烯； (2) 在第二溶劑存在下，將步驟（1)中得到的活化后的氧化石墨烯與功能化的四氧化 三鐵納米粒子進(jìn)行接觸后固液分離，得到固相載體； (3) 將藻毒素降解酶負(fù)載在所述固相載體上， 其中，所述功能化的四氧化三鐵納米粒子為氨基功能化的四氧化三鐵納米粒子、羧基 功能化的四氧化三鐵納米粒子、疊氮基功能化的四氧化三鐵納米粒子和巰基功能化的四氧 化三鐵納米粒子中的一種或多種；所述氧化石墨烯和所述功能化的四氧化三鐵納米粒子的 重量比為1-20 :1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述氧化石墨烯和功能化的四氧化三鐵納米粒 子的重量比為2-10 :1，更優(yōu)選為3-6 :1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟（1)中，所述氧化石墨烯和羧基活化劑的重 量比為1 :1〇-1〇〇,優(yōu)選為1 :30-40。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述羧基活化劑為N-羥基琥珀酰 亞胺與1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺和/或Ν，Ν' -二環(huán)己基碳二亞胺的組 合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述羧基活性劑由30-50重量％的Ν-羥基琥珀 酰亞胺與50-70重量％的1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺和/或Ν，Ν' -二環(huán) 己基碳二亞胺組成；優(yōu)選地，所述石墨烯功能基團(tuán)活性劑由30-50重量％的Ν-羥基琥珀酰 亞胺和50-70重量％的1-乙基-3- (3_二甲基氛基丙基）碳醜二亞胺或Ν, Ν' -二環(huán)己基碳 二亞胺組成；更優(yōu)選地，所述羧基活性劑由30-50重量％的Ν-羥基琥珀酰亞胺和50-70重 量％的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺組成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟（1)中，所述第一溶劑為磷酸鈉緩沖溶液、磷 酸緩沖溶液或2-嗎啉乙磺酸緩沖溶液；所述活化的條件包括：pH為3-7,溫度為20-80°C， 時(shí)間為20-60min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的方法，其中，步驟（2)中，所述第二溶劑為磷酸鈉緩沖溶 液或磷酸緩沖溶液；所述接觸的條件包括：pH為5-8,溫度為20-80°C，時(shí)間為3-20h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述功能化的四氧化三鐵納米粒子為氨基功能 化的四氧化三鐵納米粒子和/或羧基功能化的四氧化三鐵納米粒子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其中，所述功能化的四氧化三鐵納米粒子的粒度為 50-300nm，優(yōu)選為 90-200nm。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述氧化石墨烯的粒度為1-10 μ m，優(yōu)選為 1-5 μ m〇
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藻毒素降解酶為MlrA、MlrB、MlrC和MlrD 中一種或多種。
12. -種由權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的方法制得的固定化的藻毒素降解酶。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的固定化的藻毒素降解酶，其中，以所述固定化的藻毒素降 解酶的總量為基準(zhǔn)，所述藻毒素降解酶的含量為1重量％以上，優(yōu)選為1-6重量％。
14. 一種權(quán)利要求12或13所述的固定化的藻毒素降解酶在降解藻毒素中的應(yīng)用。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，所述降解的條件包括：pH為6. 5-8,溫度為 20-80°C，時(shí)間為2-120min ;優(yōu)選地，所述降解的條件包括：pH為6. 5-7. 5,溫度為30-60°C， 時(shí)間為10_60min ;更優(yōu)選地，所述降解的條件包括：pH為7-7. 5,溫度為30-60°C，時(shí)間為 30_60min。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，所述藻毒素為MC-LR、MC-YR和MC-RR中一種 或多種。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK104195129SQ201410364753
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】馮玲玲, 杜丹, 萬堅(jiān), 李俊, 肖閃, 白柳 申請(qǐng)人:華中師范大學(xué)