一種小麥粒重分子標(biāo)記及其在育種中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】可應(yīng)用于小麥育種領(lǐng)域，具體提供了一種小麥粒重分子標(biāo)記，該標(biāo)記位于小麥6A染色體RFL_CONTIG4632_1512和TaGW2-CAPS之間；通過該分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測小麥品種或品系中是否具有增加千粒重的QGW6A-232，以加快小麥高產(chǎn)品種的選育進程，由于采用了專用的粒重分子標(biāo)記不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提高了高產(chǎn)小麥品種或品系的選擇效率和質(zhì)量。
【專利說明】一種小麥粒重分子標(biāo)記及其在育種中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，可應(yīng)用于小麥育種領(lǐng)域，具體提供了一種小 麥粒重分子標(biāo)記。

【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)俏覈?0-60%人口的主要口糧，目前，我國人均耕地只有0.093公頃，隨著 生產(chǎn)糧食的土地和淡水資源的減少，糧食供應(yīng)安全問題日益凸顯，提高千粒重是培育高產(chǎn) 小麥的重要途徑之一，田紀(jì)春等研究表明在穗數(shù)和穗粒數(shù)相對固定的前提下，千粒重每增 加1克，每公頃產(chǎn)量可增加157 kg。
[0003] 粒重由主基因和微效基因共同控制，基因數(shù)目多且效應(yīng)較低，易受環(huán)境影響。在傳 統(tǒng)育種中需要大規(guī)模的田間選擇，工作量大，效率低難以滿足現(xiàn)在的需要。而分子標(biāo)記輔助 選擇不受環(huán)境影響，可以進行程序化早代選擇和預(yù)測，可顯著提高目標(biāo)性狀選擇的準(zhǔn)確性， 對加快提高小麥單產(chǎn)及保障我國糧食安全具有重要的現(xiàn)實意義和理論價值。目前，在水稻 中已鑒定并克隆了 GS3、qSW5、GW2和GS5等與粒重有關(guān)的基因/QTL，在分子標(biāo)記輔助選擇 中發(fā)揮了作用。但是小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，與粒重有關(guān)的基因鑒定較少，缺乏分子標(biāo)記輔助選 擇的有效標(biāo)記。
[0004] 目前小麥粒重分子標(biāo)記輔助選擇瓶頸效應(yīng)主要表現(xiàn)在：
[0005] ①絕大多數(shù)QTLs不是功能性標(biāo)記：從理論上講，實效性分子標(biāo)記經(jīng)驗證優(yōu)化后可 用于所有育種材料的檢測。它的發(fā)掘是以被克隆的基因序列為前提，并需建立位點/標(biāo)記 與性狀的關(guān)系。按照這一標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)發(fā)表的QTLs位點都沒有經(jīng)過育種過程或品種進行有效 性驗證。
[0006] ②QTLs實用性差：單一遺傳群體定位的基因位點，準(zhǔn)確度差，而且由于置信區(qū)間 大，QTLs過多或存在假陽性QTLs，降低了分子輔助選擇的實際效率，甚至沒法有效應(yīng)用到 小麥育種中。
[0007] 因此需要提供一種針對于小麥粒重的實用性分子標(biāo)記以利于小麥的育種。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，結(jié)合長期研究和探索，提供了一種小 麥粒重分子標(biāo)記，該標(biāo)記位于小麥6A染色體RFL_C0NTIG4632_1512和TaGW2-CAPS之間；通 過該分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測小麥品種或品系中是否具有增加千粒重的QGW6A-232,以加 快小麥高產(chǎn)品種的選育進程，由于采用了專用的粒重分子標(biāo)記不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán) 境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提高了高產(chǎn)小麥品種或品系的選擇效率 和質(zhì)量。
[0009] 發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下：
[0010] 一種小麥粒重分子標(biāo)記，該標(biāo)記位于小麥6A染色體RFL_C0NTIG4632_1512和 TaGW2-CAPS之間；其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述，長度為303bp。 toon] 通過該分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測小麥品種或品系中是否具有增加千粒重效應(yīng)基 因位點QGW6A-232,具體方法如下：
[0012] 利用特異性引物擴增目標(biāo)植株的葉片DNA，獲得668bp片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，之后利用Haelll專一酶酶切后凝膠電泳檢測是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述的片段；
[0013] 具體判定標(biāo)準(zhǔn)是：不具有增大千粒重基因的品種或品系（低粒重）中出現(xiàn)303bp 的電泳帶。而具有增大千粒重基因的品種或品系中該片段被切碎，該片段缺失。
[0014] 為了配合該分子標(biāo)記，發(fā)明人設(shè)計了其特異性引物，其
[0015] 正向引物序列：5/-CCTTCCATATGTTTTTTAATGAGCCGCC-3/(如SEQIDNO: 3所示）
[0016] 反向引物序列：5' -GCTTCTTTTCCAACTCAATAMTGAGCC-3'(如SEQ ID N0:4所示）
[0017] 通過特異性引物的擴增，以及對產(chǎn)物的酶切結(jié)果進行判定，主要原因在于：通過這 種方法可以判定該位點是否含有大粒增效基因位點，雖然小麥粒重受多個基因位點控制， 但是由于本發(fā)明所判定的位點為主效基因位點，其對于小麥的增重有著十分重要的增效效 果，故而即可獲知待測小麥品種是否具有粒重增效效果的相關(guān)基因；為粒重基因聚合、進而 增加產(chǎn)量提供分子基礎(chǔ)，從而可以更好的育種并應(yīng)用于品種改良中去。
[0018] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人首次提供了一種小麥粒重分子標(biāo)記，該標(biāo)記位于小麥 6A染色體RFL_C0NTIG4632_1512和TaGW2-CAPS之間；通過該分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測小 麥品種或品系中是否具有增加千粒重的QGW6A-232,以加快小麥高產(chǎn)品種的選育進程，由于 采用了專用的粒重分子標(biāo)記不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了 生廣成本，大大提商了商廣小麥品種或品系的選擇效率和質(zhì)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為利用本發(fā)明所述的分子標(biāo)記和判定方法對大粒體系和小粒體系的酶切驗 證結(jié)果電泳圖，通過圖中可知，小粒體系經(jīng)過酶切后出現(xiàn)了 303bp的電泳帶，而大粒體系中 則沒有出現(xiàn)；
[0020] 圖中A為大粒品系和親本01-35 ;B為小粒品系和親本9411。

【具體實施方式】
[0021] 下述實施例中除特殊說明之外，所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0022] 實施例1小麥的葉片DNA提取
[0023] (1)取約0· 3-0. 5 g葉片入5mL離心管，液氮速凍后研成粉末；
[0024] (2)加入約1600 μ L已預(yù)熱至65°C的緩沖液S，多次倒置混勻，水浴0. 5-lh，其間 輕搖幾次以充分混勻；
[0025] (3)降溫至室溫，等待10分鐘，加10-15 μ L RNA酶（10mg/mL) 37°C水浴30鐘，其 間輕搖幾次以充分混勻，約1次/10 min ;
[0026] (4)取出離心管，加入等體積1600yL，4°C苯酚（Tris-平衡酚）：氯仿：異戊醇 (25 :24 :1(體積比）抽提，輕輕混勻10 min，4°C冰箱靜置5 min，然后8000 rpm離心10 min ；
[0027] (5)取上清液于另一管，約1300 μ L，加入等體積冷氯仿（4°C冰箱放置），輕搖10 min 混勻，8000 rpm 離心 10 min ;
[0028] (6)取上清液于另一管，加100 μ L 3M NaAC(醋酸鈉），加入1000 μ L的冷異丙醇 (或2倍體積的冷乙醇），充分混勻后于-20°C冰箱靜置20 min ;
[0029] (7)用槍頭挑出絮狀的DNA，用70%乙醇清洗2-3次，稍離心5分鐘，去掉乙醇，氣 干后（無乙醇氣味即可），溶于200yL 1XTE，輕輕混勻，-20°C儲存；
[0030] (8)用微量可見/紫外分光光度計NanoDrop2000,測定DNA濃度，稀釋DNA濃度為 200ng/ μ L做為工作液。
[0031] 附錄：溶液配制：
[0032] (1)3 M NaAc(pH 5. 2)
[0033] 600 mL H20中加408. 24 g NaAc-3H20,（或者246. 24g無水醋酸鈉）溶解后用冰 醋酸（冰乙酸）調(diào)pH值至5. 2,定容至1 L，滅菌，備用。
[0034] (2) 1 X TE (pH 8. 0)
[0035] 800 mL H20 中加 1.211 g Tris、0.3723 g Na2EDTA-2H20,用 HCL 調(diào) pH值至 8.0,定 容至1 L，滅菌，備用。
[0036] (3) RNA酶：（若商業(yè)化配置好的lmL處理好的分裝RNA酶，可以直接使用。）
[0037] 將固體RNA酶溶于0· 01 M NaAc，使酶濃度為10 mg/mL，加熱至100°C處理15 - 20 1^11，慢慢冷卻至室溫，然后加入0.1倍體積111^8-!〇^(?!17.4)，分裝后于-201：冰箱 保存。
[0038] (4)緩沖液 S
[0039] 按照如下配方配制后，定容至1 L。
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種小麥粒重分子標(biāo)記，其特征在于：該標(biāo)記位于小麥6A染色體RFL_ C0NTIG4632_1512和TaGW2-CAPS之間；其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述。
2. 權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記在育種中的應(yīng)用，其特征在于：利用其判定植株是否含有 增加千粒重效應(yīng)基因位點QGW6A-232,具體步驟為： 利用特異性引物擴增目標(biāo)植株的的葉片DNA，獲得668bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，之后利用Haelll專一酶酶切后檢測是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 述的片段； 判定標(biāo)準(zhǔn)為：不具有增大千粒重基因的品種或品系中出現(xiàn)如SEQ ID N0:1所述的 303bp的電泳帶；具有增大千粒重基因的品種或品系中該片段被切碎，該片段缺失。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的小麥粒重分子標(biāo)記，其特征在于：其特異性引物， 正向引物序列-CCTTCCATATGTTTTTTAATGAGCCGCC-3'，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:3所示； 反向引物序列：5 ^ -GCTTCTTTTCCAACTCAATAAATGAGCC-3 ^ 其核苷酸序列如 SEQ ID NO :4所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087586SQ201410356641
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】田紀(jì)春, 李青芳, 陳建省, 張瑩, 鄧志英, 陳廣鳳, 孫彩鈴 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)