與蕪菁抗根腫病基因連鎖的分子標(biāo)記及獲得方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與蕪菁抗根腫病基因相連鎖的分子標(biāo)記及其獲得方法。將抗根腫病蕪菁親本材料P1（‘077-03’）和感病親本材料P2（‘077-04’）雜交得到F1群體并構(gòu)建相應(yīng)的BC1、F2、F3群體；明確該病害的病原是蕓薹根腫菌；抗病性遺傳分析結(jié)果表明其抗性受顯性單基因控制；利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)和改良BSA法對(duì)蕪菁F2群體進(jìn)行根腫病抗性標(biāo)記的篩選，獲得與蕪菁抗根腫病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記BrSSR133，該SSR分子標(biāo)記與抗性基因的遺傳距離為5.02cm。研究結(jié)果為分離新的抗根腫病基因奠定了基礎(chǔ)，本發(fā)明對(duì)蕓薹種作物的育種實(shí)踐和抗病理論研究均有重要意義。
【專利說明】與蕪菁抗根腫病基因連鎖的分子標(biāo)記及獲得方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種與蕪菁抗根腫病基因相連鎖的分子標(biāo)記 及其獲得方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 十字花科作物根腫病也稱"根癌"，是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的世界性土傳病害。目前在世界范圍內(nèi)危害嚴(yán)重，我國絕大部分地區(qū)的十 字花科作物也正面臨著根腫病的嚴(yán)重威脅。十字花科作物受根腫菌侵染后會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量顯著 下降，甚至絕收。目前生產(chǎn)上一般采用化學(xué)藥劑防治，但在癥狀表現(xiàn)后再使用藥劑處理效果 并不明顯，這給防治帶來了很大困難。研究表明，根腫菌休眠孢子在土壤中的壽命長(zhǎng)達(dá)8? 10年，嚴(yán)重影響十字花科作物的可持續(xù)性生產(chǎn)。因此，在生產(chǎn)上培育具有根腫病抗性的十字 花科作物新品種是最安全而又經(jīng)濟(jì)的方法。
[0003] 為解決上述影響我國十字花科作物可持續(xù)發(fā)展的重大問題，挖掘新的抗原，以往 育種家們大多借助形態(tài)學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記來輔助育種，經(jīng)篩選已獲得一些優(yōu)良的抗根腫病 自交系，但在抗病轉(zhuǎn)育過程中應(yīng)用傳統(tǒng)的方法篩選抗性植株時(shí)存在選育時(shí)間較長(zhǎng)、操作程 序繁瑣等缺點(diǎn)；另一方面抗性表現(xiàn)易受環(huán)境條件的影響，難以適應(yīng)育種實(shí)踐的需要。近年 來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)開展十字花科抗病育種顯出巨大的潛 力。一類基于DNA變異的分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被國內(nèi)外許多學(xué)者應(yīng)用于十字花科抗病研究。 應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)，不但可以免除傳統(tǒng)育種中繁重的選擇過程，以及跟蹤、檢測(cè)外源基因， 還能把多個(gè)抗根腫病基因聚合到同一優(yōu)良品種中，使其獲得持久、廣泛的抗性。
[0004] 蕓薹種是十字花科蕓薹屬中一個(gè)重要的基本種，它包含有AA(2n = 20)基因組，可 分為中國白菜亞種（大白菜、小白菜、菜心、紫菜薹、薹菜和烏塌菜等6個(gè)變種）、蕪菁亞種和 日本水菜亞種等三個(gè)亞種，是一種重要的蔬菜和油料作物。前人的研究結(jié)果顯示，蕪菁是蕓 薹種中唯一發(fā)現(xiàn)含有對(duì)根腫病抗性基因的變種，通過雜交與回交技術(shù)，可以將蕪菁中的抗 性基因轉(zhuǎn)移到同種的大白菜、小白菜、菜心和紫菜薹等變種中，從而為抗根腫病的新品種選 育提供創(chuàng)新種質(zhì)。因此，尋找與根腫病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記不僅可應(yīng)用到分子輔 助育種中，提高蕓薹種作物抗病育種效率，在農(nóng)業(yè)上有重要的應(yīng)用價(jià)值，而且還可以為進(jìn)一 步克隆相關(guān)的抗病基因并分析其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種與蕪菁抗根腫病基因相連鎖的 分子標(biāo)記及其獲得方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種與蕪菁抗根腫病基因相連鎖的分 子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記（BrSSR133)的序列為SEQ ID N0. 3,其上游引物為SEQ ID N0. 1，下 游引物為SEQ ID NO. 2。
[0007] 本發(fā)明一種與蕪菁抗根腫病基因相連鎖的分子標(biāo)記BrSSR133的獲得方法，包括 以下步驟：
[0008] 1)利用經(jīng)過多代自交選育出的抗根腫病蕪菁親本材料'077-03'和感病親本材料 '077-04'，將所述抗病親本'077-03'和感病親本'077-04'進(jìn)行雜交得到Fi群體，并構(gòu)建 相應(yīng)的BCi、F 2、F3群體；
[0009] 2)根據(jù)田間自然發(fā)病材料的病害癥狀，以及病原休眠孢子鏡檢，明確該病害的病 原是蕓薹根腫菌；
[0010] 3)對(duì)群體進(jìn)行人工接種鑒定，發(fā)現(xiàn)'077-03'的根腫病抗性是由一對(duì)顯 性核基因控制；
[0011] 4)利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，運(yùn)用改良BSA法進(jìn)行與蕪菁根腫病抗性分子標(biāo)記的篩 選；
[0012] 5)篩選出一個(gè)SSR分子標(biāo)記BrSSR133,經(jīng)單株驗(yàn)證分析，該分子標(biāo)記與根腫病抗 性基因的遺傳距離為5. 02cm。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：根腫病是目前影響十字花科生產(chǎn)的一 種嚴(yán)重病害。本發(fā)明利用SSR分子標(biāo)記方法，結(jié)合改良的BSA法得到一個(gè)與蕪菁根腫病抗 性相關(guān)的SSR分子標(biāo)記，可直接用于蕓薹種作物的抗根腫病分子標(biāo)記的輔助選擇育種。利 用該分子標(biāo)記，不僅克服了常規(guī)育種方法所需時(shí)間周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，還可以有目的地聚合多 個(gè)抗根腫病基因，培育出具有穩(wěn)定的多抗性的蕓薹種作物品種。同時(shí)也可利用這個(gè)新根腫 病抗性基因的分子標(biāo)記克隆抗根腫病基因，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，這對(duì)于進(jìn)一步了 解蕪菁抗根腫病的分子遺傳機(jī)理有積極意義。因此，本發(fā)明在蕓薹種作物育種實(shí)踐及抗病 理論研究上均具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是蕓薹根腫菌休眠孢子在600倍光學(xué)顯微鏡下的觀察結(jié)果（標(biāo)尺長(zhǎng)為 50 μ m)。A圖：從根瘤組織分離；B圖：從土壤中分離圖；
[0015] 圖2是BrSSR133對(duì)兩個(gè)親本的驗(yàn)證結(jié)果圖；
[0016] 圖3是BrSSR133對(duì)抗（感）基因池的擴(kuò)增結(jié)果圖。1和2 :正交F2代抗病池；3和 4 :正交F2代感病池；
[0017] 圖4是BrSSR133的F2代單株驗(yàn)證結(jié)果圖；
[0018] 圖5是BrSSR133的匕代單株驗(yàn)證結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 與蕪菁抗根腫病分子標(biāo)記BrSSR133的獲得方法主要包括以下步驟：
[0020] 1.利用經(jīng)過多代自交選育出的抗根腫病蕪菁親本材料Pi ( '077-03'）和感病親本 材料P2( '077-04'），將所述抗病親本'077-03'和感病親本'077-04'進(jìn)行雜交得到Fi群 體,并通過測(cè)交和自交途徑構(gòu)建相應(yīng)的BQ、F 2和F3群體。
[0021] 2.根據(jù)田間自然發(fā)病材料的病害癥狀，以及病原休眠孢子鏡檢，明確該病害的病 原是蕓薹根腫菌。
[0022] 具體做法為：觀察田間自然發(fā)病材料的病害癥狀，從病根和病土中分離病原的休 眠孢子，在600倍光學(xué)顯微鏡下觀察休眠孢子的形態(tài)特征。圖1所示：從病根和病土中分離 的休眠孢子的大小、形態(tài)特征與十字花科根腫菌相一致。
[0023] 根腫組織中根腫菌休眠孢子的分離：
[0024] (1)取根腫組織10g，在研缽中磨碎，加 50mL滅菌水，用4層紗布過濾。
[0025] (2)濾液移入5〇mL離心管，3100rpm離心Ιδη?η。
[0026] (3)棄上清液，沉淀溶于50mL滅菌水，移入50mL離心管，3100rpm離心15min。
[0027] (4)重復(fù)步驟（3) 2?3次。
[0028] (5)棄上清液，在步驟⑷得到的沉淀中加入5mL質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為50%蔗糖溶液，混 勻后，移入50mL離心管，3100rpm離心lOmin。
[0029] (6)用移液槍把離心后的上清液小心移入50mL離心管，加入30mL滅菌水，3100rpm 離心lOmin。
[0030] (7)棄步驟（6)離心后的上清液，將得到的沉淀重溶于30mL滅菌水，移入50mL離 心管中，3100rpm離心lOmin，此步操作重復(fù)2?3次。
[0031] (8)最后沉淀溶于5mL滅菌水中備用。
[0032] 土壤中根腫菌休眠孢子的分離：
[0033] (1)取10g病土，溶于20mL質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.05 % tween-80 (聚山梨酯）水溶液中， 置于搖床上搖2?3h。
[0034] (2)將步驟⑴得到的混合液用4層紗布過濾。
[0035] (3)濾液移入5〇mL離心管，3100rpm離心Ιδη?η。
[0036] (4)棄上清液，沉淀重溶于50mL滅菌水，移入50mL離心管，3100rpm離心15min。
[0037] (5)重復(fù)步驟（4) 2?3次。
[0038] (6)棄上清液，在步驟（5)得到的沉淀中加入5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 %蔗糖溶液，混勻 后，移入50mL離心管，3100rpm離心lOmin。
[0039] (7)用移液槍把上清液小心移入50mL離心管，加入30mL滅菌水，3100rpm離心 10min〇
[0040] (8)棄上清液，沉淀重溶于30mL滅菌水，3100rpm離心lOmin，此步操作可重復(fù)2? 3次。
[0041] (9)最后沉淀溶于5mL滅菌水中備用。
[0042] 3.對(duì)BQ、F2、F3群體進(jìn)行人工接種鑒定，發(fā)現(xiàn)Pi ( '077-03'）的根腫病抗性是由 一對(duì)顯性核基因控制的。
[0043] 具體做法為：對(duì)？^^、正交匕和反交匕、正交F2和反交F2、正交F 3和反交匕^心這 六個(gè)世代的種子進(jìn)行根腫病抗性試驗(yàn)，在適宜的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，播種6周后記錄每個(gè)世 代的感病情況，根據(jù)病情嚴(yán)重度劃分為四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，并計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)、發(fā)病指數(shù)（表 1)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，表2的檢驗(yàn)結(jié)果顯示？" '077-03'）的根腫病抗性是由一對(duì)顯性 核基因控制的。
[0044] 表1根腫病抗性試驗(yàn)結(jié)果
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種與蕪菁抗根腫病基因相連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記為 序列為 SEQ ID NO. 3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種與蕪菁抗根腫病基因相連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于， 所述分子標(biāo)記的上游引物為SEQ ID NO. 1，下游引物為SEQ ID NO. 2。
3. -種權(quán)利要求1所述的與蕪菁抗根腫病基因相連鎖的分子標(biāo)記的獲得方法，其特征 在于，主要包括以下步驟： (1) 利用經(jīng)過多代自交選育出的抗根腫病蕪菁親本材料'077-03'和感病親本材料 '077-04'，將所述抗病親本'077-03'和感病親本'077-04'進(jìn)行雜交得到Fi群體，并構(gòu)建 相應(yīng)的BCi、F 2、F3群體； (2) 根據(jù)田間自然發(fā)病材料的病害癥狀，以及病原休眠孢子鏡檢，明確該病害的病原是 蕓薹根腫菌； (3) 對(duì)BQ、Fp匕群體進(jìn)行人工接種鑒定，發(fā)現(xiàn)'077-03'的根腫病抗性是由一對(duì)顯性 核基因控制； (4) 利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，運(yùn)用改良BSA法進(jìn)行與蕪菁根腫病抗性分子標(biāo)記的篩選； (5) 篩選出一個(gè)SSR分子標(biāo)記經(jīng)單株驗(yàn)證分析，該分子標(biāo)記與根腫病抗性基 因的遺傳距離為5. 02 cm。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104152443SQ201410338727
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】余小林, 王芳展, 劉亞培, 劉振寧 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)