一株防治十字花科根腫病的多粘類芽孢桿菌n3-4及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生防菌劑，其中有效活性成分由多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus?polymyxa)N3-4組成。其特征在于：該生防菌劑是水劑或可濕性粉劑。水劑其組成與重量百分含量為：5億多粘類芽孢桿菌水劑：94.4％；NNO：0.5％、十二烷基苯磺酸鈉：5％、苯甲酸鈉：0.1％?？蓾裥苑蹌┢浣M成與重量百分含量為：50億多粘類芽孢桿菌N3-4可濕性粉劑：40％；NNO：7％；聚乙二醇：3％；十二烷基苯磺酸鈉：5％；輕質(zhì)碳酸鈣：45％。應(yīng)用時(shí)，將上述水劑灌根或可濕性粉劑根部撒施，用于防治十字花科根腫病。其優(yōu)點(diǎn)是：通過(guò)引進(jìn)對(duì)人畜安全、對(duì)十字花科蔬菜根腫病具有較強(qiáng)抑制作用的多粘類芽孢桿菌N3-4，達(dá)到利用生防菌劑防治十字花科根腫病；減少化學(xué)藥劑用藥量、降低用藥成本；同時(shí)改善生態(tài)環(huán)境、減少了化學(xué)藥劑在十字花科蔬菜中殘留量的目的。
【專利說(shuō)明】一株防治十字花科根腫病的多粘類芽孢桿菌N3-4及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生防菌劑及其應(yīng)用，尤其是一株多粘類芽孢桿菌N3-4及其在防治十字花科根腫病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]十字花科根腫病俗稱根癌病，是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicaeWoronin)侵染引起的一種世界性土傳病害，寄主范圍很廣，可危害大白菜、小白菜、甘藍(lán)、蘿卜、薺菜、花椰菜、芥菜和油菜等100多種栽培的和野生的十字花科植物。近年來(lái)我國(guó)十字花科根腫病的發(fā)生面積逐年擴(kuò)大，嚴(yán)重程度逐年加重。在我國(guó)，根腫病常年危害面積約320-400萬(wàn)hm2，占十字花科作物種植面積的I / 3以上，大流行年份發(fā)生與危害面積可達(dá)900萬(wàn)hm2，平均產(chǎn)量損失達(dá)20% -30%，嚴(yán)重田塊直接產(chǎn)量損失達(dá)60%以上。根腫病休眠孢子在無(wú)感病寄主植物的土壤中存活可達(dá)20年之久。
[0003]由于引起根腫病的病原菌一蕓薹根腫菌是專性寄生，傳染性強(qiáng)、傳播速度快、傳播途徑多，所以根腫病防治較為困難。近年來(lái)各國(guó)學(xué)者非常重視該病并進(jìn)行了大量研究，主要防控措施有抗病育種、農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治。目前十字花科蔬菜抗根腫病品種較少；農(nóng)業(yè)防治主要是通過(guò)施用石灰調(diào)節(jié)土壤PH來(lái)降低根腫病發(fā)病率，雖有一定的防治效果，但成本高，且長(zhǎng)期使用石灰對(duì)土壤結(jié)構(gòu)、生理生化性狀都會(huì)造成不良影響，因此不可長(zhǎng)期使用；化學(xué)藥劑防治用量大，同時(shí)長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥增加了十字花科蔬菜(尤其是食根部蔬菜，如蘿卜、蕪菁、榨菜等)有毒物質(zhì)的積累和殘留，給人類健康帶來(lái)隱患。
[0004]解決這個(gè)問(wèn)題的根本途徑之一是運(yùn)用生物防治方法防治十字花科根腫病。生物防治對(duì)人畜安全、環(huán)境兼容性 好、病原菌不易產(chǎn)生抗藥性，因而越來(lái)越引起人們的重視，并已初見(jiàn)成效。已文獻(xiàn)報(bào)道的根腫病生防微生物主要有:根殖真菌(Narisawa等,2000年，Plant Pathology)、木霉(Cheah 等，2000 年，New Zealand Plant Protection)、鏈霉菌(王靖等，2011 年，中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)；Joo 等,2004, Korean Journal of Microbiology andBiotechnology)和枯草芽孢桿菌等(熊國(guó)如等，2009年，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))。目前已申請(qǐng)專利的根腫病生防微生物有:鏈霉菌(專利申請(qǐng)?zhí)?201310049744.8 ；201310272882.2)、解淀粉芽孢桿菌(專利申請(qǐng)?zhí)?201110284741.3 ;201210254827.6)、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(專利申請(qǐng)?zhí)?201010561580.3 ；201010561580.3)、成團(tuán)泛菌(專利申請(qǐng)?zhí)?201210241051.4)等。
[0005]江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從北京市、山西省、江蘇省、浙江省以及湖北省下屬縣市等地采集土樣，分離純化獲得367個(gè)細(xì)菌分離物。篩選后獲得一株能很好防治十字花科根腫病的
生防菌-多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)N3-4。經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
檢測(cè)鑒定，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征、16SrRNA基因序列、gyrB基因序列、ropB基因序列等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)綜合分析，菌株N3-4鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) ?同時(shí)多粘類芽孢桿菌N3-4已于2013年8月28日在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心登記入冊(cè)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8084，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。
[0006]多粘類芽孢桿菌是一類具有許多優(yōu)良性能的生防菌，如:生長(zhǎng)速度快:適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng):能在土壤和植物表面定殖，形成優(yōu)勢(shì)種群；誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性；分泌產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)；產(chǎn)生植物激素促生作用等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多粘類芽孢桿菌能防治西瓜枯萎病(宋順華等，2011年，植物保護(hù)學(xué)報(bào))、番茄早疫病(馬桂珍等，2010年，中國(guó)蔬菜)、棉花黃萎病(王笑穎等，2011年，湖北農(nóng)業(yè)科學(xué))、大豆根腐病(王光華等，2004年，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))等真菌病害。目前，多粘類芽孢桿菌防治植物病害申報(bào)專利的有:防治水稻紋枯病和稻曲病(專利申請(qǐng)?zhí)?200810019537.7)，防治植物青枯病(專利申請(qǐng)?zhí)?200910153984.6)，防治煙草黑脛病(專利申請(qǐng)?zhí)?201210348067.5)等病害。目前，多粘類芽孢桿菌用于防治十字花科根腫病國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一株防治十字花科根腫病的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)N3-4,該菌株已于2013年8月28日在中國(guó)微生物菌種保藏中心登記入冊(cè)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8084。
[0008]本發(fā)明提供了一種生防菌劑，其中有效活性成分由多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)N3-4 組成。
[0009]本發(fā)明所述的生防菌劑，其中多粘類芽孢桿菌N3-4分泌的代謝產(chǎn)物中包括蛋白酶和纖維素酶兩種抗菌相關(guān)物質(zhì)。
[0010]本發(fā)明所述的生防菌劑，它是水劑或可濕性粉劑。
[0011]本發(fā)明所述的水劑或可濕性粉劑，其特征在于:其組成與重量百分含量如下:活性成分10%-99% ;助劑0.5-20% ;粘合劑2-20% ;表面活性劑0.5 %-20 % ;防腐劑
`0.1% -0.5% ;填充劑10% -90% ;其中活性成分由多粘類芽孢桿菌N3-4組成；其中助劑選自ΝΝ0、氮酮、噻酮中的一種或多種；粘合劑選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇中的一種或多種；表面活性劑選自十二烷基磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、茶枯粉、皂角粉中的一種或多種；防腐劑選自苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、丙酸鈣、雙乙酸鈉中的一種或多種；填充劑選自輕質(zhì)碳酸鈣、硅藻土、高嶺土、絹云母粉、白碳黑中的一種或多種。
[0012]本發(fā)明所述的水劑，其組成與重量百分含量為:5億多粘類芽孢桿菌水劑:94.4%；NNO:0.5%、十二烷基苯磺酸鈉:5%、苯甲酸鈉:0.1%.[0013]本發(fā)明所述的可濕性粉劑，其組成與重量百分含量為:50億多粘類芽孢桿菌N3-4可濕性粉劑:40% ；NN0 -J% ;聚乙二醇:3% ;十二烷基苯磺酸鈉:5% ;輕質(zhì)碳酸鈣:45%。
[0014]本發(fā)明所述的水劑灌根或可濕性粉劑根部撒施，可有效防治十字花科根腫病。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:通過(guò)引進(jìn)對(duì)人畜安全、對(duì)十字花科根腫病具有較強(qiáng)抑制作用的多粘類芽孢桿菌N3-4，達(dá)到利用一種生防菌劑防治十字花科根腫病；減少化學(xué)藥劑用藥量、降低用藥成本；同時(shí)改善生態(tài)環(huán)境、減少了化學(xué)藥劑在蔬菜中的殘留量的目的。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0016]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)一步說(shuō)明。
[0017]圖1是多粘類芽孢桿菌N3-4對(duì)病原細(xì)菌的抑制作用
[0018]圖2是多粘類芽孢桿菌N3-4對(duì)病原真菌的抑制作用。
[0019]圖3是多粘類芽孢桿菌N3-4產(chǎn)生蛋白酶。
[0020]圖4是多粘類芽孢桿菌N3-4產(chǎn)生纖維素酶。
[0021]圖中A:多粘類芽孢桿菌N3-4 ；B:番茄青枯病菌；C:水稻細(xì)菌性條斑病菌；D:梨火疫病菌；E:番茄枯萎病菌；F:水稻紋枯病菌；G:番茄灰霉病菌；H:油菜菌核病菌；1:甘藍(lán)黑斑病菌
【具體實(shí)施方式】:
[0022]實(shí)施例1、 [0023]多粘類芽孢桿菌N3-4對(duì)多種病原細(xì)菌和病原真菌的抑制作用
[0024]由于蕓薹根腫菌無(wú)法室內(nèi)培養(yǎng)，因此根腫病生防菌的篩選主要采用以多種病原細(xì)菌和病原真菌作為指示菌，獲得較好的生防細(xì)菌后，再去評(píng)價(jià)該生防細(xì)菌對(duì)根腫病菌的拮抗效果和生防能力
[0025]A、供試病原細(xì)菌和病原真菌:
[0026]病原細(xì)菌包括番茄青枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌和梨火疫病菌，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。用LB培養(yǎng)液(蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g, NaCllOg，蒸餾水1000mL)28°C、150rpm振蕩培養(yǎng)2d，用無(wú)菌水稀釋至106cfu / mL，備用。
[0027]病原真菌包括番茄枯萎病菌、水稻紋枯病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌和甘藍(lán)黑斑病菌，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。用PDA培養(yǎng)基(200g馬鈴薯、20g葡萄糖、20g瓊脂和1000mL蒸餾水，pH5.6~6.6)28°C培養(yǎng)5d，備用。
[0028]B、試驗(yàn)方法:
[0029]將江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院篩選獲得的多粘類芽孢桿菌N3-4在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，然后移入50mL LB培養(yǎng)液中，于28°C、150rpm振蕩培養(yǎng)2d，備用。
[0030]取多粘類芽孢桿菌N3-4菌液5 μ L點(diǎn)接在LB平板中央，28°C培養(yǎng)48h后用各病原細(xì)菌稀釋液噴霧后，28°C培養(yǎng)過(guò)夜，調(diào)查抑菌圈直徑。每處理重復(fù)3皿，取平均值。設(shè)清水對(duì)照。
[0031 ] 將病原真菌菌餅(直徑為6mm)置于空白PDA平板一側(cè),距平板邊緣30mm。平板另一側(cè)，距平板邊緣30mm，點(diǎn)接多粘類芽孢桿菌N3-4菌液5 μ L。28°C恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照平板菌落長(zhǎng)滿時(shí)測(cè)量調(diào)查病原菌菌落直徑，并計(jì)算抑制率。每處理重復(fù)3皿，取平均值。設(shè)清水對(duì)照。
[0032]病原真菌抑制率=[(對(duì)照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑)/對(duì)照病原菌菌落直徑]X 100%。
[0033]C、試驗(yàn)結(jié)果:
[0034]試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、圖1-2。試驗(yàn)結(jié)果表明多粘類芽孢桿菌N3-4菌液對(duì)供試病原細(xì)菌和病原真菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。
[0035]表1多粘類芽孢桿菌N3-4對(duì)供試病原細(xì)菌和病原真菌的抑制作用
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種生防菌劑的用途，其特征在于:所述生防菌劑中有效活性成分由多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polynyxa)N3-4組成；所述多粘類芽孢桿菌N3_4分泌的代謝產(chǎn)物中包括蛋白酶和纖維素酶兩種抗菌相關(guān)物質(zhì)；所述生防菌劑為水劑或可濕性粉劑；所述生防菌劑可用于防治十字花科根腫病。
2.一種防治十字花科根腫病的水劑或可濕性粉劑，其特征在于:各組成及其重量百分含量如下:活性成分10% -99% ;助劑0.5% -20% ;粘合劑2% -20% ;表面活性劑0.5% -20% ;防腐劑0.1% -0.5% ;填充劑10% -90%。其中活性成分為多粘類芽孢桿菌N3-4 ;其中助劑選自NN0、氮酮、噻酮中的一種或多種；粘合劑選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇中的一種或多種；表面活性劑選自十二烷基磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、茶枯粉、皂角粉中的一種或多種；防腐劑選自苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、丙酸鈣、雙乙酸鈉中的一種或多種；填充劑選自輕質(zhì)碳酸鈣、硅藻土、高嶺土、絹云母粉、白碳黑中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多粘類芽孢桿菌N3-4水劑，其特征在于:各組成及其重量百分含量為:多粘類芽孢桿菌N3-4菌含量:5 X IO8Cfu / mL ；NN0:0.5% ;十二烷基苯磺酸鈉:5% ;苯甲酸鈉:0.1% ;水余量；pH6.0-7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多粘類芽孢桿菌N3-4可濕性粉劑，其特征在于:各組成及其重量百分含量為:多粘類芽孢桿菌N3-4活菌原粉:40% ；NN0:7% ;聚乙二醇:3% ;十二烷基苯磺酸鈉:5% ;輕質(zhì) 碳酸韓:45%。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103667134SQ201310660199
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】劉郵洲, 梁雪杰, 喬俊卿, 杜艷 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院