專利名稱：一種檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法。
背景技術(shù)：
聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織將大白菜定位為最重要的二十種蔬菜之一，是重要的食物來源。蕓苔根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)是鞭毛菌亞門(Mastigomycotina)中的專性寄生菌，可導致油菜、青菜、芥菜、榨菜等十字花科植物病害-根腫病的產(chǎn)生，蕓苔根腫菌也可侵染大白菜，引起大白菜根腫病。根腫病是十字花科作物重要的土傳病害，可在植物主根和側(cè)根上形成大小不同、形狀不一的腫瘤。根部受害后可影響植物地上部分的生長，使葉色變淡，生長遲緩，矮化，發(fā)病嚴重時可造成植株成片萎蔫和死亡。該病原菌以休眠孢子在土壤中越冬，能夠存活10年以上，可經(jīng)土壤、水流、種子傳播，以游動孢子侵入植物的根毛。近年來，根腫病危害逐年加重，我國西南、華中、東北和華東各大種植區(qū)都出現(xiàn)過較大規(guī)模的流行。根腫病已成為十字花科作物主要病害，危害面積約6000萬畝，平均產(chǎn)量損失達209Γ30%，嚴重田塊產(chǎn)量 損失達60%以上，甚至絕收。每年導致油菜經(jīng)濟損失約10億元、蔬菜經(jīng)濟損失約200億，極大地制約了油料和蔬菜產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展及農(nóng)民增收。對于根腫病的防治，目前尚缺乏高效、低毒、低殘留、低成本的化學藥劑，而有效控制根腫病的生防制劑數(shù)量也很少，并容易受環(huán)境條件的影響；在農(nóng)業(yè)防治方面，對根腫病的研究不夠系統(tǒng)、全面，存在不少弊端。因此，及早發(fā)現(xiàn)病原，掌握根腫病的發(fā)病情況對于根腫病的預防、監(jiān)測、防治至關(guān)重要。目前，蕓苔根腫菌的檢測仍主要依賴于傳統(tǒng)的癥狀觀察、病原鑒別，不僅耗時耗力，且常常依賴于人的經(jīng)驗判斷，若需準確識別病害并非易事，并且所需的離體植物組織樣本量大。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)可對植物樣本和土壤樣本中的病原菌進行檢測,操作方便，在一定程度上簡化了蕓苔根腫菌的檢測，但是需要核酸提取過程，時間較長，且常規(guī)PCR診斷常受假陽性和假陰性的影響，重復性和準確性較差，因此，有必要找到一種替代方法來準確判斷病原菌存在與否。傅里葉變換紅外光譜技術(shù)(FT-1R)作為一種測定樣品分子結(jié)構(gòu)的工具已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用在化學、農(nóng)業(yè)、生物科學、醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域，是分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的有效手段，自20世紀70年代興起后得到了迅猛的發(fā)展。90年代以來，利用FT-1R技術(shù)對微生物進行分類、鑒定和檢測的研究也悄然興起。核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物等細胞大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成信息可以反映在紅外光譜圖上。雖然，組成細菌細胞的生化物質(zhì)基本相同，但是其中的某些功能基團的差異可以成為區(qū)分和鑒定不同菌株的基礎(chǔ)，以此作為一種鑒定檢測微生物的快速無損的新型方法(代群威，董發(fā)勤.FTIR技術(shù)在幾株細菌鑒定的應(yīng)用[J].西南科技大學學報，2009，24(I):114-117) 0劉剛等利用FT-1R技術(shù)成功地鑒別了食用菌的不同種類(劉剛，劉建宏，等.食用菌的傅里葉變換紅外光譜鑒定[J].光譜學與分析光譜.2004，24(8):941-945)，區(qū)分了同一種食用菌的不同部位以及不同產(chǎn)地，慈云祥等對幾種微生物紅外光譜進行了比較(慈云祥，臧凱賽，等.幾種微生物的紅外光譜研究[J].高等學?；瘜W學報，2002,23 ):1047-1049)。目前尚未針對有FT-1R應(yīng)用于蕓苔根腫菌檢測的相關(guān)報道，

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)，實現(xiàn)了大白菜中蕓苔根腫菌的快速、無損、準確的檢測。一種檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，包括:(I)取大白菜的根或葉，制成壓片；(2)采集所述壓片的紅外光 譜圖；(3)對紅外光譜圖進行分析:若由根制成壓片的紅外光譜圖在1748.16±0.75cm^\2851.24±0.ΟδαιΓ1和3013.23±0.28cm-1范圍中至少一處出現(xiàn)特征峰，則說明大白菜的根感染蕓苔根腫菌；若由葉制成壓片的紅外光譜圖在1252.54±0.δΟαιΓ1和1051.98±4.23cm_1范圍中至少一處出現(xiàn)特征峰，則說明大白菜的葉感染蕓苔根腫菌。病原菌侵染寄主植物后，寄主植物的核酸、蛋白的代謝發(fā)生變化，并合成積累一些次生代謝物質(zhì)、相關(guān)酶類等，同時，病原菌自身的物質(zhì)組成也與寄主植物有差別，這些差別物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成信息可以反映在紅外光譜圖上，形成特征峰。被蕓苔根腫菌侵染大白菜的根在1748.16 ±0.75CHT1 (指在1748.16cm_1處左右浮動±0.75CHT1，其他依次類推)、2851.24±0.05cm—1和3013.23±0.28cm—1范圍具有特征峰，被蕓苔根腫菌侵染大白菜的葉在1252.54±0.50cm_\l051.98±4.23cm_1具有特征峰，而健康大白菜的根或葉在上述任一波段范圍并沒有特征峰。因此，根據(jù)待檢測大白菜的根或葉的紅外光譜圖，觀察特征峰，即可確定大白菜的根或葉是否感染蕓苔根腫菌。在對由根或葉制成的壓片進行紅外光譜圖的采集時，采集波段范圍可以為4000"400cm_1o為使檢測速度更快，優(yōu)選的，若由根制成壓片，紅外光譜圖的采集波段為HOOllOOcnT1 ；若由葉制成壓片，紅外光譜圖的采集波段為ΚΚΚΤΠΟΟαιΓ1。所述紅外光譜圖可由傅里葉變換紅外光譜分析儀進行采集。在紅外光譜圖采集前，需先制備用于光譜分析的大白菜的根或葉的壓片，具體方法為:將大白菜的根或葉冷凍干燥后研磨成粉末，與溴化鉀混勻，壓制成壓片。大白菜的根或葉粉末的粒徑影響紅外光譜圖質(zhì)量，所述大白菜的根或葉粉末的粒徑為小于2 μ m。粒徑過大，制備的壓片透光性差，散射作用強，易造成紅外光譜圖基線的漂移，譜帶發(fā)生畸變。顯然的，溴化鉀的粒徑小于2 μ m。為避免水分對紅外光譜分析的影響，混勻前，溴化鉀應(yīng)干燥除水。
所述大白菜的根或葉粉末與溴化鉀的重量比為1:10(Γ3:100，優(yōu)選為1:100。溴化鉀可以稀釋大白菜的根或葉粉末，并易于壓片的壓制成型。大白菜的根或葉粉末與溴化鉀的重量比維持在適宜的范圍，有利于全面的采集特征峰信號，既可防止大白菜的根或葉粉末過多導致的吸收飽和現(xiàn)象，也能避免大白菜的根或葉粉末過少所導致的弱信號的特征峰的丟失。為得到高質(zhì)量的紅外光譜圖，所述壓片的厚度要均勻一致，一般，所述壓片的厚度為 0.5 Imm0采集紅外光譜圖時，掃描次數(shù)為32 128次，優(yōu)選的，所述掃描次數(shù)為32次。適宜的掃描次數(shù)可以增強待檢測樣品在紅外區(qū)的信息，減弱背景噪聲，提高光譜信噪比。采集紅外光譜圖時，掃描分辨率為0.12512(3!^1,優(yōu)選的，所述掃描分辨率為4cm-10分辨率過高，掃描速度慢，影響檢測速度；分辨率過低，會導致待檢測樣品信息的丟失，影響檢測的準確性。所述紅外光譜圖的采集過程中，通常需向所述傅里葉變換紅外光譜分析儀的樣品區(qū)連續(xù)通入干燥空氣，用以驅(qū)除水蒸氣，避免水蒸氣的干擾。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)，可快速、無損、準確的檢測大白菜中蕓苔根腫菌，操作方便，不依賴于人的經(jīng)驗，且安全性、重復性高，為有效的預防和控制大白菜根腫病提供了新的技術(shù)手段`。


圖1為被蕓苔根腫菌感染的大白菜的根在^OO^OOcnT1波段范圍的紅外光譜圖；圖2為健康大白菜的根在4000^00(^-1波段范圍的紅外光譜圖；圖3為被蕓苔根腫菌感染的大白菜的葉在4000300(31^1波段范圍的紅外光譜圖；圖4為健康大白菜的葉在4000 50001^波段范圍的紅外光譜圖；圖5為大白菜樣品Dl、W1、S1和S2基因組PCR擴增電泳圖；其中，Marker(DL2000)的大小依次為 IOObp、250bp、500bp、750bp、IOOObp 和2000bp圖6為大白菜的根樣品Dl在^(ΚΓδΟΟαιΓ1波段范圍的紅外光譜圖；圖7為大白菜的根樣品Wl在4000^00(^-1波段范圍的紅外光譜圖；圖8為大白菜的根樣品SI在^(ΚΓδΟΟαιΓ1波段范圍的紅外光譜圖；圖9為大白菜的葉樣品S2在^(ΚΓδΟΟοπΓ1波段范圍的紅外光譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。實施例1樣品的制備大白菜樣品采集自中國遼寧省沈陽市下屬的新民市。大白菜樣品:感染蕓苔根腫菌的大白菜的根；健康大白菜的根(指未感染蕓苔根腫菌)；
感染蕓苔根腫菌的大白菜的葉；健康大白菜的葉(指未感染蕓苔根腫菌)。被蕓苔根腫菌侵染的大白菜的基本鑒別和判定基于常規(guī)的癥狀觀察和特異性PCR實驗技術(shù)的應(yīng)用(R.Faggian S.Parsons.Arapid diagnostic test for clubroot [J].Horticulture Australia)。(I)將大白菜樣品于_70°C冰凍干燥后，置于研缽中，用研杵研磨成粒徑小于2μπι的粉末；(2)將分裝在離心管中的溴化鉀置于凍干機內(nèi)干燥，干燥后，取IOOmg溴化鉀與Img大白菜樣品粉末置于離心管中，混合均勻；(3)將上述的混合物以100kg/cm2 (1200psi)的壓力壓制約8分鐘，制成厚度為
0.5 lmm的薄盤狀的壓片。實施例2傅里葉變換紅外光譜(FTIR)的采集及數(shù)據(jù)分析用傅里葉變換紅外光譜分析儀對實施例1制備的壓片進行掃描，獲取大白菜樣品的紅外光譜，比較分析蕓苔根腫菌感染的大白菜樣品與健康大白菜樣品的紅外光譜。掃描過程中，向傅里葉紅外光譜分析儀內(nèi)的樣品區(qū)連續(xù)的通入干燥空氣，以驅(qū)趕水蒸氣。紅外光譜掃描條件如下:溫度:室溫(25°C )；掃描范圍:4000 50001 1-1；

分辨率McnT1 ;掃描次數(shù):100次。紅外光譜數(shù)據(jù)的分析由Grams32@ 軟件(Galactic Industries, Salem, NH, USA)分析后獲得，分析光譜范圍即4000100(^-1區(qū)段。吸收峰的位置由樣品重量的中心點確定，光譜分析得到的平均值是基于平行性試驗、基線校準、數(shù)據(jù)正?；诖嘶A(chǔ)上通過同一軟件可測得吸收峰的光譜范圍。光譜分析的均值以及正常化的調(diào)整雖然只能從視覺表征上給出差異，但是光譜的各項參數(shù)、均值的計算、統(tǒng)計分析、基線校準等因素均會被考慮在內(nèi)。表I受蕓苔根腫菌感染與健康大白菜的根樣品(n=3)的主要吸收峰比較
權(quán)利要求
1.一種檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，其特征在于，包括: (1)取大白菜的根或葉，制成壓片； (2)采集所述壓片的紅外光譜圖； (3)對紅外光譜圖進行分析: 若由根制成壓片的紅外光譜圖在1748.16±0.75cm^\2851.24±0.ΟδαιΓ1和3013.23±0.28cm-1范圍中至少一處出現(xiàn)特征峰，則說明大白菜的根感染蕓苔根腫菌； 若由葉制成壓片的紅外光譜圖在1252.54±0.50CHT1和1051.98±4.23CHT1范圍中至少一處出現(xiàn)特征峰，則說明大白菜的葉感染蕓苔根腫菌。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，其特征在于，所述壓片的制備方法為:將大白菜的根或葉冷凍干燥后研磨成粉末，與溴化鉀混勻，壓制成壓片。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，其特征在于，所述大白菜的根或葉粉末的粒徑小于2 μ m。
4.如權(quán)利要求2所述的檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，其特征在于，所述大白菜的根或葉粉末與溴化鉀的重量比為1:100~3:100。
5.如權(quán)利要求2所述的檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，其特征在于，所述壓片的厚度為0.5 1mm。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，其特征在于，所述紅外光譜圖的采集波段為4000~400-1'
7.如權(quán)利要求6所述的檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，其特征在于， 若由根制成壓片，紅外光譜圖的采集波段為HOOllOOcm-1 ； 若由葉制成壓片，紅外光譜圖的采集波段為lOOCTlSOOcm-1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，包括取大白菜的根或葉，制成壓片；采集所述壓片的紅外光譜圖；對紅外光譜圖進行分析；若由根制成壓片在1748.16±0.75cm-1、2851.24±0.05cm-1和3013.23±0.28cm-1范圍中至少一處出現(xiàn)特征峰，則大白菜的根感染蕓苔根腫菌；若由葉制成壓片在1252.54±0.50cm-1和1051.98±4.23cm-1范圍中至少一處出現(xiàn)特征峰，則大白菜的葉感染蕓苔根腫菌。本發(fā)明檢測大白菜中蕓苔根腫菌的方法，應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)，可快速、無損、準確的檢測大白菜中蕓苔根腫菌，操作方便，不依賴于人的經(jīng)驗，且安全性、重復性高。
文檔編號G01N21/35GK103115891SQ20131001918
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者李斌, 單長林, 黃潔瓊, 葛夢禹, 石雨, 謝關(guān)林 申請人:浙江大學