冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶c、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種來自冬蟲夏草中國(guó)被毛孢參與生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲基-2-氧代戊酸的3-異丙基蘋果酸脫氫酶C、編碼基因及其應(yīng)用，所述3-異丙基蘋果酸脫氫酶C氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，編碼基因如SEQ?ID?No.1所示；本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過調(diào)節(jié)3-異丙基蘋果酸脫氫酶C基因的表達(dá)，賦予宿主3-異丙基蘋果酸脫氫酶C的高表達(dá)性，為擴(kuò)大3-異丙基蘋果酸脫氫酶C的生物應(yīng)用提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
【專利說明】冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶C、編碼基因及其應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及來自"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢的3-異丙基蘋果酸脫氫酶 C(3_isopropylmalate dehydrogenase)、編碼基因及其應(yīng)用。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草（Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目 (Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲（Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸 體上的復(fù)合體（包括子座和蟲體）。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn) 物和生物活性多樣的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其 多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲夏草入肺腎 二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽(yáng)，主治腎虛，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳 痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)，冬蟲夏 草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物 活性。
[0003] 冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段（無性型）和子囊孢 子階段（有性型）。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實(shí)際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草 菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無性型確證、 活性成分分離分析和作用機(jī)理、開發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國(guó)被毛孢已被證 明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。
[0004] 但是，對(duì)冬蟲夏草中國(guó)被毛孢中3-異丙基蘋果酸脫氫酶C的研究幾乎為空白， 以及對(duì)3-異丙基蘋果酸脫氫酶C在中國(guó)被毛孢中生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲 基-2-氧代戊酸的作用的研究。
[0005] 3-異丙基蘋果酸脫氫酶（IPMDH，EC:1. 1. 1.85)是生物合成亮氨酸中的一個(gè)關(guān)鍵 酶，是一種以NAD+或NADP+為受體、作用于供體CH-0H基團(tuán)上的氧化還原酶。這種酶能催化 以下酶促反應(yīng)：（2R，3S) -3-異丙基蘋果酸+NAD+ # 4-甲基-2-氧代戊酸+C02+NADH+H+，此 反應(yīng)實(shí)際上由兩步組成：（2R, 3S) _3_異丙基蘋果酸+NAD+(2S) _2_異丙基_3_氧代玻拍 酸+NADH+H+和（2S)-2-異丙基-3-氧代琥珀酸P 4-甲基-2-氧代戊酸+C02，亦即上述第 一步反應(yīng)的產(chǎn)物可通過第二步反應(yīng)自發(fā)脫羧產(chǎn)生4-甲基-2-氧代戊酸。
[0006] 1981年，Tanaka等人從極端嗜熱菌Thermus thermophilus HB8中克隆到了一個(gè) 3_異丙基蘋果酸脫氫酶，并且用PBR322作為載體克隆到大腸桿菌中。攜帶重組質(zhì)粒的大腸 桿菌的3-異丙基蘋果酸脫氫酶酶活是野生型菌株的7倍。
[0007] 1986年，Kazuhiro Hamasawa等人從產(chǎn)朊假絲的基因文庫(kù)中克隆到一個(gè)3-異丙基 蘋果酸脫氫酶基因，利用質(zhì)粒PYKL30克隆到大腸桿菌和釀酒酵母中。這個(gè)基因的開放讀碼 框大小為l〇89bp，編碼363個(gè)氨基酸殘基。Southern雜交證實(shí)，該片段是從三產(chǎn)朊假絲而 得。
[0008] 1991年，H Kirino等人從極端嗜熱菌Thermus aquaticus YT-1中克隆到了一個(gè) 3_異丙基蘋果酸脫氫酶leuB，并且在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，它包含1035bp，編碼344個(gè)氨 基酸殘基的開放閱讀框。和嗜熱菌T. thermophilus HB8的3-異丙基蘋果酸脫氫酶的核苷 酸序列具有87. 0 %同源性，氨基酸序列具有91. 3 %同源性。
[0009] 1992年，Mats Elierstrdm等人從互補(bǔ)的酵母突變株leu2中克隆到了一個(gè)3-異丙 基蘋果酸脫氫酶基因，這個(gè)基因編碼一個(gè)52kDa大小的蛋白，其具有推定的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。 在體外由蛋白質(zhì)導(dǎo)入到葉綠體中，與之同時(shí)蛋白裂解。
[0010] 2011年，Sikdar等人從水稻的基因組中克隆得到了一個(gè)3-異丙基蘋果酸脫氫酶 基因，該基因的開放讀碼框能編碼389個(gè)氨基酸，對(duì)應(yīng)于約41. 2kD的蛋白質(zhì)。這個(gè)水稻來 源的3-異丙基蘋果酸脫氫酶的氨基酸序列與植物和細(xì)菌來源的3-異丙基蘋果酸脫氫酶氨 基酸序列高度同源。
[0011] 但是，目前NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中目前還檢索不到中國(guó)被毛孢中3-異丙基蘋果酸脫氫酶 C的基因相關(guān)信息。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明目的是針對(duì)以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問題，對(duì)"百令"生產(chǎn)菌冬蟲 夏草中國(guó)被毛孢3-異丙基蘋果酸脫氫酶C在生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲基-2-氧 代戊酸進(jìn)行深入研究，提供了"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢的一種3-異丙基蘋果酸 脫氫酶C、編碼基因及其應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0014] 本發(fā)明提供一種來自冬蟲夏草中國(guó)被毛孢3-異丙基蘋果酸脫氫酶C，其氨基酸序 列如SEQ ID No. 1所示（記為isoC蛋白）。該酶可催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲基-2-氧 代戊酸。
[0015] SEQ ID No. 1 序列如下：LPSYLNLRFD FVNLGAGFET FEQTGTALPD ATLDVLRNDC DGALFGAVSS PTHAVRGYSS PIVALRKRLD LYANVRPVKS VQSVMTASKP IDMVIVRENT EDLYVKQEMT YDGPDGKVAE AIKRISDKAS FRIAAMAGDI AVRRQAIRQS GAQSIHAEPT VTITHKSNVL SQTDGLFREA SKRALADPKY ATVKIEEQIV DSMVYKLFRQ PEDYDVIVAP NLYGDILSDG AAALVGSLGL VPSANVGDGF AI⑶PCPGSA PDMGK
[0016] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的肽蛋白的片 段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體 與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的所述改變可包 括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對(duì)于變體的保守性改變，所替換的氨基 酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保 守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0017] 本發(fā)明還涉及所述的3-異丙基蘋果酸脫氫酶C在生物催化3-異丙基蘋果酸制備 4_甲基-2-氧代戊酸中的應(yīng)用。由3-異丙基蘋果酸經(jīng)過3-異丙基蘋果酸脫氫酶C的催化 獲得對(duì)應(yīng)4-甲基-2-氧代戊酸的路徑如下所示：
[0018]

【權(quán)利要求】
1. 一種冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶C，其特征在于所述脫氫酶C的氨基酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶C在生物催化3-異丙基蘋果 酸制備4-甲基-2-氧代戊酸中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：將含冬蟲夏草3-異丙基蘋果 酸脫氫酶C重組工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體用pH8. 0磷酸鹽緩沖液懸浮，超聲破碎，將 破碎混合液離心，取上清液為催化劑，以3-異丙基蘋果酸水溶液為底物，以輔酶I為輔助 底物，于Tris-HCl緩沖液中，37°C、150rpm條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，取上清 液即獲得含有4-甲基-2-氧代戊酸的混合液，將混合液分離純化，即獲得4-甲基-2-氧代 戊酸。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述底物3-異丙基蘋果酸水溶液的濃度為 〇. 1M，所述底物的初始濃度為0. 02M，所述催化劑的體積用量以超聲破碎前濕菌體質(zhì)量計(jì)為 0. 01g/L，所述輔酶I的終濃度為10g/L。
5. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備：將含3-異丙 基蘋果酸脫氫酶C的重組工程菌接種于含終濃度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基 中，371：、25〇1'/1^11培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)物以體積濃度2%的接種量轉(zhuǎn)接于5〇1^含有終濃度 50μ g/ml Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)至菌體濃度0D600為0. 6? 〇. 8,向培養(yǎng)物中加入終濃度0. 05mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集濕菌體，將濕菌體在功率 40%、破Is停Is條件下超聲破碎，取細(xì)胞破碎混合液離心，取上清液即為催化劑。
6. -種編碼權(quán)利要求1所述3-異丙基蘋果酸脫氫酶C的基因。
7. 如權(quán)利要求6所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的編碼基因在構(gòu)建能夠生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲 基-2-氧代戊酸的基因工程菌中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：構(gòu)建含有所述3-異丙基蘋果 酸脫氫酶C基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離純化獲得含有3-異丙基蘋果酸脫氫酶C基因的菌體細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104120113SQ201410306498
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】柳志強(qiáng), 鄭裕國(guó), 林善, 薛亞平, 吳暉, 李邦良, 許靜, 許峰, 王鴻艷 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué), 杭州中美華東制藥有限公司