一種副溶血性弧菌分子檢測(cè)方法及使用的引物對(duì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種副溶血性弧菌分子檢測(cè)方法及使用的引物對(duì)。一對(duì)用于副溶血性弧菌分子檢測(cè)的特異性引物對(duì)，上游引物toxRS-F為SEQ?ID?NO.1，下游引物toxRS-R為SEQ?ID?NO.2。種副溶血性弧菌分子檢測(cè)方法，使用所述的特異性引物PCR擴(kuò)增待檢樣品的DNA，如果能夠擴(kuò)增得到679bp的片段，則說(shuō)明待檢樣品中含有副溶血性弧菌。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短，特異性好，檢出限低，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，適應(yīng)食品微生物檢驗(yàn)發(fā)展的需要，具有較高的使用推廣價(jià)值。
【專利說(shuō)明】—種副溶血性弧菌分子檢測(cè)方法及使用的引物對(duì)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種副溶血性弧菌分子檢測(cè)方法及使用的引物對(duì)。
【背景技術(shù)】
[0002]副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus,Vp)是一種革蘭氏陰性嗜鹽性細(xì)菌,屬弧菌科(Vibrio)弧菌屬，主要存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚類、蝦類、貝類、牡蠣等海產(chǎn)品中。人多因食用被本菌污染而又未煮熟的海產(chǎn)品而引起中毒。我國(guó)每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的報(bào)道，近年來(lái)世界發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。目前，對(duì)于副溶血弧菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法大多要經(jīng)過(guò)前增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定、神奈川現(xiàn)象和血清學(xué)反應(yīng)等過(guò)程。這些實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，需耗時(shí)5-6天，給海產(chǎn)品生產(chǎn)、出入境檢驗(yàn)檢疫、食品衛(wèi)生監(jiān)督等帶來(lái)困難，影響經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前，學(xué)者對(duì)副溶血弧菌的分子檢測(cè)的方法大多基于tlh、tdh、gyrb、pr72H等基因,但大多方法被后來(lái)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)否定,而現(xiàn)在缺乏可被公眾認(rèn)可的分子檢測(cè)方法。故建立一種簡(jiǎn)便、快速特異而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆肿訖z測(cè)技術(shù)迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一對(duì)用于副溶血性弧菌分子檢測(cè)的特異性引物對(duì)。
[0004]本發(fā)明的另一目 的是提供該引物對(duì)的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的又一目的是提供一種副溶血性弧菌分子檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]本發(fā)明引物設(shè)計(jì)和分子檢測(cè)方法的建立基于副溶血性弧菌的toxRS基因。ToxRS，即toxR和toxS，為弧菌的毒素操縱子基因，toxS基因序列位于toxR下游，兩者的連續(xù)基因合稱為toxRS?；谠摶虻目勺儏^(qū)設(shè)計(jì)引物，建立副溶血弧菌的分子檢測(cè)方法。
[0008]一對(duì)用于副溶血性弧菌分子檢測(cè)的特異性引物對(duì)，上游引物toxRS-F為SEQ IDN0.1，下游引物 toxRS-R 為 SEQ ID N0.2。
[0009]本發(fā)明所述的引物對(duì)在制備檢測(cè)副溶血性弧菌的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0010]一種用于副溶血性弧菌分子檢測(cè)的試劑盒，包含本發(fā)明所述的特異性引物對(duì)。
[0011]本發(fā)明所述的試劑盒，還包含Taq PCR Master Mix。
[0012]本發(fā)明所述的引物對(duì)在檢測(cè)副溶血性弧菌中的應(yīng)用。
[0013]一種副溶血性弧菌分子檢測(cè)方法，使用所述的特異性引物PCR擴(kuò)增待檢樣品的DNA，如果能夠擴(kuò)增得到679bp的片段，則說(shuō)明待檢樣品中含有副溶血性弧菌。
[0014]所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μ I:2XTaq PCR Master Mixl2.5 μ l,dd H209.5 μ 1，上游、下游引物各I μ 1，DNA模板I μ I ;反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，59°C退火30s，72。。延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
[0015]有益效果:[0016]副溶血性弧菌PCR檢測(cè)方法的建立，要求既不能出現(xiàn)假陽(yáng)性一即嚴(yán)格的種特異性，也不能出現(xiàn)漏檢——即重復(fù)性良好，故要選擇種特異性的靶基因，并排除特異血清型、亞型以及毒力基因序列。本發(fā)明在參考大量文獻(xiàn)以及分析基因序列的基礎(chǔ)上，排除毒力基因、亞型以及血清型特異基因，鎖定副溶血弧菌可能存在的種特異性序列。引物的特異性與靶基因的特異性的起著同等重要的作用，對(duì)于副溶血性弧菌的檢測(cè)特異性和靈敏度具有著重大的影響。本發(fā)明經(jīng)過(guò)反復(fù)比對(duì)和篩選，確定了以toxRS基因(GenBank編號(hào)LI 1929.1)的第579—1258個(gè)堿基作為靶序列，并設(shè)計(jì)了特異性引物對(duì)toxRS-F/toxRS-R，從理論層面保證本方法具有很高的特異性。
[0017]本試驗(yàn)用2XTaq PCR Master Mix 替代傳統(tǒng) PCR 體系中的 lOXbuffer、MgC12、dNTP、Taq酶，省時(shí)省力且減小操作誤差。PCR程序中，較高的退火溫度能在一定程度上能提高引物的特異性，但并不代表越高越好。故應(yīng)在能遵循特異性、重復(fù)性、靈敏性良好的基礎(chǔ)上，選擇最高的退火溫度。試驗(yàn)結(jié)果證明，59°C為最適退火溫度。最終確定的PCR程序參數(shù)為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，59。。退火30s，72。。延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸IOmin0
[0018]經(jīng)51株副溶血性弧菌、10株親緣相近細(xì)菌以及9株食源性致病細(xì)菌的檢測(cè)表明，本發(fā)明引物對(duì)PCR擴(kuò)增具有良好的副溶血弧菌特異性和重復(fù)性，未發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌、河流弧菌等親緣相近菌以及大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌等食源性致病菌擴(kuò)增出任何條帶。經(jīng)試驗(yàn)，本方法的檢測(cè)極限可達(dá)到2pg/y 1，即有極其微量的陽(yáng)性基因組即可檢出陽(yáng)性結(jié)果。純培養(yǎng)的細(xì)菌 ，鑒定時(shí)間僅需3-4h，明顯短于常規(guī)檢驗(yàn)方法。由此表明，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短，特異性好，檢出限低，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，適應(yīng)食品微生物檢驗(yàn)發(fā)展的需要，具有較高的使用推廣價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1GB4789.7-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》副溶血性弧菌分離鑒定基本流程。
[0020]圖2溫度梯度PCR結(jié)果
[0021]M:Marker, I:58°C,2:59°C,3:60°C,4:61°C,5:62°C,6:63°C,7:64°C。
[0022]圖3親緣相近菌PCR擴(kuò)增結(jié)果
[0023]M:Marker, 1:副溶血性弧菌(ATCC33847)，2:溶藻弧菌，3:霍亂弧菌，4:創(chuàng)傷弧菌，
5:擬態(tài)弧菌，6:哈維弧菌，7:河流弧菌，8:弗氏弧菌，9:嗜水氣單胞菌，10:熒光假單胞菌，
11:銅綠假單胞菌，12:陰性對(duì)照(無(wú)模板)
[0024]圖4食源性致病菌對(duì)比試驗(yàn)
[0025]MiMarker, 1:副溶血性弧菌(ATCC33847)，2:產(chǎn)單核李氏桿菌，3:大腸桿菌，4:沙門氏菌，5:糞腸球菌，6:福氏志賀菌，7:金黃色葡萄球菌，8:奇異變形桿菌，9:產(chǎn)氣莢膜梭菌，
[0026]10:多殺性巴氏桿菌，11:陰性對(duì)照(無(wú)模板)
[0027]圖5副溶血弧菌分離株的PCR擴(kuò)增
[0028]M: Marker, 1:副溶血性弧菌(ATCC33847)，2:Vpl,3:Vp2,4:Vp3,5:Vp4,6:Vp5,7:Vp6,8:Vp7,9:Vp8,10:Vp9,llVplO,12:Vpll7,13:Vpl2,14:Vpl3,15:Vpl4,16:Vpl5,17:Vpl6,18:Vpl7,19:Vpl8,20:Vpl9,21:Vp20,22:Vp21,23:Vp22,24:Vp23,25:Vp24,26:Vp27 ；27:Vp26,28:Vp27,29:Vp28,30:Vp29,31:Vp30,32:Vp31,33:Vp32,34:Vp33,35:Vp34,36:Vp35,37:Vp36,38:Vp37,39:Vp38,40:Vp39,41:Vp40,42:Vp41,43:Vp42,44:Vp43,45:Vp44,46:Vp45,47:Vp46,48:Vp47,49:Vp48,50:Vp49,51:Vp50,52:Vp51,53:陰性對(duì)照(無(wú)模板)
[0029]圖6不同模板量的PCR擴(kuò)增
[0030]M:Marker, I:20ng, 2:2ng, 3:200pg, 4:20pg, 5:2pg, 6:陰性對(duì)照(無(wú)模板)
【具體實(shí)施方式】
[0031]I試驗(yàn)材料
[0032]1.1 菌株
[0033]本試驗(yàn)使用菌株:副溶血性弧菌參考株ATCC33847，副溶血性弧菌樣品分離株51株(詳情見表1)，溶藻弧菌(ATCC17749)、河流弧菌(ATCC33809)、弗氏弧菌(ATCC33841)、熒光假單胞(ATCC17571)、福氏志賀菌購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏中心，創(chuàng)傷弧菌(ATCC27562)、擬態(tài)弧菌購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，非01霍亂弧菌、銅綠假單胞菌(ATCC27853)購(gòu)于廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，產(chǎn)單核李氏桿菌，金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、大腸桿菌、糞腸球菌(ATCC29212)、奇異變形桿菌、腸炎沙門氏菌、哈維弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、嗜水氣單胞菌、多殺性巴氏桿。
[0034]1.2主要試劑及 儀器
[0035]細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司，2 X Taq PCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司，dd H2O, DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，引物由北京鼎國(guó)引物合成部合成，瓊脂糖粉、TAE緩沖液、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(TCBS)培養(yǎng)基、科瑪嘉弧菌培養(yǎng)基購(gòu)自上海科瑪嘉公司，梅里埃全自動(dòng)生化試驗(yàn)板購(gòu)自梅里埃中國(guó)公司，GoldView核酸染色劑等購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。儀器主要有S1000TMThermalCycler基因擴(kuò)增儀,凝膠成像系統(tǒng)(biorad)、梅里埃全自動(dòng)生物鑒定系統(tǒng)等。
[0036]2 方法
[0037]2.1副溶血性弧菌的分離
[0038]本試驗(yàn)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789.7-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血弧菌檢驗(yàn)》和GB4789.7-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》(如圖1)對(duì)樣品中的副溶血弧菌進(jìn)行分離鑒定。該檢測(cè)方法需要經(jīng)過(guò)前增菌、增菌、選擇平板分離、生化試驗(yàn)、神奈川試驗(yàn)和血清學(xué)分型等步驟。以下實(shí)施例中涉及的副溶血弧菌樣品分離株見表1。
[0039]表1副溶血弧菌樣品分離株
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)用于副溶血性弧菌分子檢測(cè)的特異性引物對(duì)，其特征在于上游引物t0XRS-F為SEQ ID N0.1，下游引物 toxRS-R 為 SEQ ID N0.2。
2.權(quán)利要求1所述的引物對(duì)在制備檢測(cè)副溶血性弧菌的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
3.一種用于副溶血性弧菌分子檢測(cè)的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的特異性引物對(duì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒,其特征在于還包含TaqPCR Master Mix。
5.權(quán)利要求1所述的引物對(duì)在檢測(cè)副溶血性弧菌中的應(yīng)用。
6.一種副溶血性弧菌分子檢測(cè)方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的特異性引物PCR擴(kuò)增待檢樣品的DNA，如果能夠擴(kuò)增得到679bp的片段，則說(shuō)明待檢樣品中含有副溶血性弧菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分子檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μ I:2XTaq PCR Master Mixl2.5μ 1，dd Η209.5 μ 1，上游、下游引物各 I μ 1，DNA 模板1μ I ;反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，59°C退火30s，72°C延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104017877SQ201410262381
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】姚火春, 慕艷娟, 潘子豪 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)