一種測(cè)定藥劑對(duì)大豆疫霉根腐病室內(nèi)防效的實(shí)驗(yàn)方法
【專利摘要】大豆疫霉根腐病是我國(guó)對(duì)外檢疫性一類有害生物，屬于典型的土傳病害。文獻(xiàn)報(bào)道，大豆疫霉根腐病正在以每年3倍的速度發(fā)展，威脅我國(guó)的大豆生產(chǎn)。目前，實(shí)驗(yàn)室測(cè)定藥劑對(duì)大豆疫霉根腐病的盆栽活體測(cè)定多采用澆灌菌液接菌法、下胚軸創(chuàng)傷接種法、下胚軸游動(dòng)孢子接種法、菌層接種法，但這四種試驗(yàn)方法都存在一定的缺陷，如所獲得的游動(dòng)孢子懸浮液濃度不能保持濃度一致；接種速度慢、工作量大，容易造成感病植株大批死亡；不同的大豆疫霉菌株產(chǎn)生的游動(dòng)孢子數(shù)量和大小不一致；豆種發(fā)芽率低，容易造成豆種腐爛、死苗等。本發(fā)明所采用的試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單，可以使大豆疫霉根腐病菌均勻的侵染大豆，對(duì)照發(fā)病均勻穩(wěn)定，發(fā)病率保持在85%~95%，能夠很好的區(qū)分施藥區(qū)與對(duì)照的差別，能夠簡(jiǎn)單快捷的觀察病癥。
【專利說(shuō)明】一種測(cè)定藥劑對(duì)大豆疫霉根腐病室內(nèi)防效的實(shí)驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病害防治試驗(yàn)方法領(lǐng)域，具體涉及一種測(cè)定藥劑對(duì)大豆疫霉根腐病室內(nèi)防效的試驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆疫霉根腐病(Soybean Phytophthora Root Rot)是由大豆疫霉菌(Phytophothora )侵染大豆引起的典型的土傳病害，是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，所造成的損失極為嚴(yán)重，在感病品種上可造成損失25%~50%以上，被害種子的蛋白質(zhì)含量明顯降低。該病害是我國(guó)對(duì)外檢疫性一類有害生物，也被列入全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單。
[0003]該病菌在大豆的各個(gè)生育階段均可造成危害，包括幼苗出土前的爛種、爛苗和出土后幼苗的猝死，造成幼苗斷壟和成熟前的侵染，或植株矮化甚至枯萎死亡。
[0004]一般苗期是大豆最易感病的時(shí)期。苗期癥狀表現(xiàn)為近地表植株莖部出現(xiàn)水浸狀病斑，漸變?yōu)楹稚?，?xì)縮，子葉上出現(xiàn)褐色略凹陷的病斑。葉片開(kāi)始也表現(xiàn)為水潰狀病斑，后變黃萎蔫，葉柄下垂不脫落，感病嚴(yán)重時(shí)碎倒死亡。成株期植株受侵染后往往在分枝基部發(fā)病，出現(xiàn)黑褐色病斑，并不同程度地延至主莖和側(cè)枝并向上擴(kuò)展，可延伸至?0-ιι節(jié)位，莖的皮層及髓變褐，中空易折斷。發(fā)病植株下部葉一片變黃，隨后上部葉片逐漸變黃并很快萎蔫，根腐爛，根系極少；未死亡病株莢數(shù)明顯減少，空莢、癟莢較多，籽粒皺縮，豆莢基部初呈水潰狀，逐漸向端部擴(kuò)展，致使整個(gè)豆莢變褐干枯，空氣濕度較大時(shí)，莢皮出現(xiàn)黑色霉層，此為腐生菌二次侵染。 成株期感病植株的病莖節(jié)位也有病莢產(chǎn)生，其癥狀為綠色，豆莢基部初期出現(xiàn)水潰狀病斑，病斑逐漸變褐并從莢柄向上蔓延至莢尖，最后整個(gè)豆莢變枯呈黃褐色，種子失水干癟，種皮、胚和子葉均可帶菌，完全失去使用價(jià)值。這種病癥一般成條或成塊發(fā)病，很少單株發(fā)病。
[0005]大豆疫霉病原菌在LBA (利馬豆培養(yǎng)基)、V8培養(yǎng)液或無(wú)菌水中可形成大量孢子囊，孢囊梗單生，少有分枝，內(nèi)生層出型。孢子囊頂生，橢圓形，無(wú)乳突，孢子囊不脫落，大小42飛5*32~53ΜΠ1。孢子囊萌發(fā)時(shí)先形成泡囊，并很快破裂，游動(dòng)孢子通過(guò)裂口釋放。游動(dòng)孢子卵圓形，雙鞭毛，尾鞭長(zhǎng)度為茸鞭的4飛倍，其運(yùn)動(dòng)期可持續(xù)幾天。游動(dòng)孢子可直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管，在接觸固體表面時(shí)易膨大形成附著孢，很快就會(huì)從附著孢長(zhǎng)出菌絲。有時(shí)游動(dòng)孢子萌發(fā)可產(chǎn)生第二代游動(dòng)孢子。游動(dòng)孢子產(chǎn)生的最適溫度為20°C，最低溫度為5°C，直接萌發(fā)的最適溫度為25°C,間接萌發(fā)的最適溫度為14°C。
[0006]大豆疫霉病原菌的有性生殖為同宗配合。雄器多為長(zhǎng)形，側(cè)生，偶爾圍生。藏卵器球形或亞球形，壁薄，直徑2iT58Mffl;藏卵器受精后發(fā)育成卵孢子，卵孢子球形，壁厚光滑，直徑26~40Mffl，卵孢子在適宜的條件下萌發(fā)產(chǎn)生芽管，芽管隨后形成菌絲或發(fā)育成游動(dòng)孢子囊。卵孢子產(chǎn)生的最適溫度為18~23°C，27°C時(shí)萌發(fā)最快。
[0007]大豆疫霉只能以抗逆性很強(qiáng)的卵孢子在土壤和土壤中的病殘?bào)w內(nèi)越冬并長(zhǎng)期生存，其菌絲、孢子囊、游動(dòng)孢子和休止抱等無(wú)性繁殖器官則不能在土壤中長(zhǎng)期存活。當(dāng)春季溫濕度適宜時(shí)，卵孢子即打破休眠萌發(fā)，產(chǎn)生孢子囊。雨后或灌溉后，孢子囊釋放出大量游動(dòng)孢子，游動(dòng)孢子隨流水在田間作較遠(yuǎn)距離的傳播，成為初次侵染源。游動(dòng)孢子受寄主根系分泌物的吸引，朝根系游動(dòng)并在根組織上休止、萌發(fā)，產(chǎn)生壓力胞穿透寄主表皮，在寄主細(xì)胞間通過(guò)吸器吸取營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)在受侵染根系的表面形成大量孢子囊，并將游動(dòng)孢子釋放到土壤中，隨流水傳播，成為二次侵染源。一旦發(fā)病后，由于土壤中始終存在卵孢子，只要條件合適，卵孢子即可萌發(fā)形成飽子囊和游動(dòng)孢子，造成侵染發(fā)病。大豆疫霉可通過(guò)病殘?bào)w，土壤及種子表面粘附的卵孢子，甚至種皮內(nèi)的卵孢子作遠(yuǎn)距離傳播。
[0008]在我國(guó)，黑龍江、吉林、遼寧、北京、新疆、安徽、山東、河南、江蘇、浙江、福建等地區(qū)均有分離到大豆疫霉病原菌的相關(guān)報(bào)道。近年來(lái)，在我國(guó)大豆主產(chǎn)區(qū)由大豆疫霉引起的根腐病發(fā)生范圍逐漸擴(kuò)大，平均每年以3倍的速度發(fā)展，大豆疫霉根腐病正在嚴(yán)重威脅我國(guó)的大豆生產(chǎn)。
[0009]綜合文獻(xiàn)及報(bào)道材料，實(shí)驗(yàn)室測(cè)定藥劑對(duì)大豆疫霉根腐病的盆栽活體測(cè)定多采用(O澆灌菌液接菌法；(2)下胚軸創(chuàng)傷接種法；(3)下胚軸游動(dòng)孢子接種法；(4)菌層接種法。具體方法步驟介紹如下:
(I)澆灌菌液接菌法
按鄭小波的方法誘發(fā)發(fā)生孢子囊得到游動(dòng)孢子懸浮液。主要步驟如下:將在利馬豆培養(yǎng)基上培養(yǎng)的大豆疫霉根腐病菌疒10天后，在培養(yǎng)皿內(nèi)注入定量無(wú)菌水，24 h后重新注入無(wú)菌水，48h后收集菌液， 將所得菌液對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行澆灌，大豆子葉展開(kāi)后觀察大豆根腐病發(fā)生情況。
[0010]大豆根腐病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照韓慶新、辛惠普的方法 O級(jí):幼苗莖基部和主根上均無(wú)病斑。
[0011]I級(jí):莖基部和主根上有少量病斑，病斑而積在1/4以下。
[0012]2級(jí):?基部和王根上病斑面積占莖基和王根總面積的1/4 1/2左右。
[0013]3級(jí):莖基部和主根上病斑面積占1/2~3/4左右。
[0014]4級(jí):莖基部和主根上病斑連片，形成繞莖現(xiàn)象，但根系并未壞死。
[0015]5級(jí):根系壞死，地上部萎蔫或死亡。
[0016]該方法操作簡(jiǎn)單，但工作量大，培養(yǎng)皿所獲得的游動(dòng)孢子懸浮液濃度不能保持濃度一致，這會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響。
[0017](2)下胚軸創(chuàng)傷接種法
即將培養(yǎng)7d的大豆疫霉菌絲塊接種在大豆寄主幼苗下胚軸的傷口上，接種后25°C保濕48h。藥劑處理種子播種后7、10、15、20、25 d分別運(yùn)用下胚軸傷口接種菌株，以同一播期未進(jìn)行處理種子的植株為對(duì)照，接種后保濕2 d，然后正常管理，6 d調(diào)查發(fā)病情況。病級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)為:O級(jí)，沒(méi)有病斑擴(kuò)展；I級(jí)，病斑擴(kuò)展5 mm; 2級(jí)，病斑擴(kuò)展10 mm; 3級(jí)，病斑擴(kuò)展15 mm; 4級(jí)，病斑擴(kuò)展大于15 mm，植株存活；5級(jí)，植株死亡。試驗(yàn)重復(fù)2次。
[0018]該方法主要步驟如下:用消毒后的刀片在生長(zhǎng)ClOd的大豆子葉節(jié)下約Icm處劃一斜口，傷口深度不超過(guò)大豆莖粗的三分之一，在培養(yǎng)菌株菌落外緣割取帶有菌絲體的培養(yǎng)基(邊長(zhǎng)為3rnrn的方塊)嵌入傷口中，接種后在保濕箱中保濕48h，然后移到溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，接種后5飛d進(jìn)行病情調(diào)查。
[0019]此方法的優(yōu)點(diǎn)是接種方法簡(jiǎn)單易行，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，缺點(diǎn)是接種速度慢、工作量大，容易造成感病植株大批死亡，無(wú)法評(píng)價(jià)效果。
[0020]( 3 )下胚軸游動(dòng)孢子接種法
將游動(dòng)孢子懸浮液注射接種到大豆幼苗下胚軸處，其接種流程和病情調(diào)查與下胚軸創(chuàng)傷菌絲體接種法幾乎一致，該接種方法的接種時(shí)間短，工作效率提高了 3~4倍，但要求懸浮液中大豆疫霉的游動(dòng)飽子要達(dá)到一定的濃度，因?yàn)椴煌拇蠖挂呙咕戤a(chǎn)生的游動(dòng)孢子數(shù)量和大小也不一致，這往往給孢子注射帶來(lái)難度。
[0021](4)菌層接種法
將長(zhǎng)有病原菌菌絲體的瓊脂片接種到營(yíng)養(yǎng)缽或塑料盆中，然后在菌絲體上方播種，或?qū)⒂蝿?dòng)孢子接種到種有大豆幼苗的蛭石或土壤中，待大豆植株子葉展開(kāi)后，調(diào)查發(fā)病情況。根腐病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)與澆灌菌液接菌法一致。
[0022]具體方法如下:底部帶孔的大小為9 cm*12.5 cm*12.5 cm (底徑X高X 口徑)的標(biāo)準(zhǔn)塑料花盆用吸水紙封蓋底眼，加6 cm高的新蛭石并加水浸透，將在直徑為9 cm的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)10 d的菌株接種體圓片置于蛭石中央，上面加2.5 cm高的蛭石，加水充分浸透后播種。每個(gè)藥劑處理10粒種子，均勻播于花盆 中央，保證每粒種子都垂直于接種體層以便根直接穿過(guò)接種體層。播種后覆蓋2 cm的蛭石，澆水浸透。每處理設(shè)接菌對(duì)照(未處理種子加接種體層)和空白對(duì)照(未處理種子不加接種體層)。溫室溫度控制在18~28°C，出苗后每天澆水f 2次并根據(jù)需要輔以光照，25 d后調(diào)查出苗后植株死亡率和病級(jí)，計(jì)算防治效果。
[0023]大豆根腐病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照韓慶新、辛惠普的方法。
[0024]此方法的優(yōu)點(diǎn)是接種發(fā)病條件與自然發(fā)病條件非常接近，鑒定周期較短，實(shí)驗(yàn)條件一致性較好，但菌層接種后豆種發(fā)芽率低，容易造成豆種腐爛、死苗，結(jié)果難以評(píng)價(jià)。
[0025]結(jié)合大豆疫霉根腐病菌絲的生長(zhǎng)特點(diǎn)及室內(nèi)生測(cè)的條件要求，本發(fā)明所涉及的試驗(yàn)方法可以使大豆疫霉根腐病菌均勻的侵染大豆，對(duì)照發(fā)病均勻穩(wěn)定，且發(fā)病率高，能夠很好的區(qū)分施藥區(qū)與對(duì)照的差別，操作簡(jiǎn)單易行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0026]本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定藥劑對(duì)大豆疫霉根腐病防效的試驗(yàn)方法，該方法可以使大豆疫霉根腐病菌均勻的侵染大豆，能夠很好的區(qū)分施藥區(qū)與對(duì)照的差別，對(duì)照發(fā)病均勻穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單。
[0027]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種測(cè)定藥劑對(duì)大豆疫霉根腐病防效的試驗(yàn)方法，其特征在于:將培養(yǎng)7~10 d的大豆疫霉培養(yǎng)基(培養(yǎng)基以剛好覆蓋培養(yǎng)皿底為準(zhǔn))剪碎成0.1-1 cm2的小塊，與沙土或蛭石按比例進(jìn)行混合，其中比例范圍為IOkg沙土或蛭石混合25到40皿培養(yǎng)基小塊，沙土的比例為(1.5: 1~ 1: 1.5)，將菌絲塊與沙土或蛭石充分混合均勻后，放入塑料花盆或其他容器內(nèi)，用自來(lái)水充分澆灌，播種大豆種子，放入溫室內(nèi)(2(T25°C)觀察，記錄出苗時(shí)間及出苗率，待豆苗第二片真葉長(zhǎng)出，對(duì)照區(qū)豆苗莖基部出現(xiàn)病斑時(shí)，調(diào)查各處理根腐病發(fā)生情況，比較不同處理間差異。
【具體實(shí)施方式】[0028](I)測(cè)定了不同大小菌絲塊對(duì)大豆根腐病的發(fā)病影響。
[0029]試驗(yàn)方法如下:將培養(yǎng)8 d的大豆疫霉培養(yǎng)基(利馬豆培養(yǎng)基)分別剪碎成0.05cm2、0.1 cm2、0.5 cm2、I cm2大小的菌絲塊,菌絲塊厚度、大小均一,各大小菌絲塊分別剪取30皿培養(yǎng)基，將剪碎的菌絲塊與10 kg沙土(比例為沙1:土 I)充分混勻，定量分裝入塑料盆(Φ15 cm,h:10 cm)內(nèi)，將未經(jīng)處理的大豆種子(中黃13，安徽農(nóng)科院作物所提供)播種于塑料盆內(nèi)，播種深度為4 cm，每盆播種10粒豆種，重復(fù)10次,播種后用自來(lái)水充分浸透,放入22°C溫箱內(nèi)，保持土壤濕度，待第二片真葉長(zhǎng)出時(shí)，調(diào)查出苗率，豆苗莖基部出現(xiàn)病斑時(shí)，調(diào)查各重復(fù)根腐病發(fā)生情況。
[0030]大豆根腐病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照韓慶新、辛惠普的方法(如上所示)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0031]表1不同菌絲塊大小對(duì)出苗率、發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)的影響
【權(quán)利要求】
1.一種室內(nèi)測(cè)定藥劑對(duì)大豆疫霉根腐病防效的試驗(yàn)方法，其特征在于:該方法操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件更接近于田間，可以使大豆疫霉根腐病菌均勻的侵染大豆，使大豆發(fā)病率保持在85%~95%之間，發(fā)病均勻穩(wěn)定，能夠很好的區(qū)分施藥區(qū)與對(duì)照區(qū)的差別，能夠簡(jiǎn)便快捷的觀察病癥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的要求,該方法為將大豆疫霉根腐病菌菌絲塊剪碎成小塊與沙土或蛭石混合，其特征在于菌絲塊與沙土或蛭石的比例為25~40皿(90 mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)基混合IOkg沙土或蛭石。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的要求，培養(yǎng)基菌絲塊的大小范圍為0.1cnTlcm2，最適合的菌絲塊大小為0.1 Cm2，沙土或蛭石的比例不限。
4.根據(jù)權(quán)利要求 1的要求，該試驗(yàn)方法的最適溫度為18~25°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104004816SQ201410254683
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】任學(xué)祥, 葉正和, 蘇賢巖, 趙偉, 鄭雪松 申請(qǐng)人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所