一種抗大豆疫霉根腐病基因及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗大豆疫霉根腐病基因及應用，屬于大豆遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起的一種嚴重危害大 豆生產(chǎn)的世界性病害之一，其危害面積非常之大，是程度很嚴重的土壤傳播性病害。到現(xiàn)在 為止，其在大豆一些主要產(chǎn)區(qū)的危害勢頭銳不可擋。因此，新抗疫霉根腐病基因的挖掘顯得 至關(guān)重要。針對大豆抗疫霉根腐病尋找大豆內(nèi)地基因，并同時比較抗感大豆資源在基因水 平的差異，對從分子水平了解大豆抗疫霉根腐病機制和培育抗病品種具有重要的理論和實 際意義。
[0003] 但是，雖然研究者已完成大豆全基因組測序，但仍未發(fā)現(xiàn)在大豆基因組中的能夠 起到抗大豆疫霉根腐病的基因。而沒有大豆抗疫霉根腐病的關(guān)鍵基因，對于農(nóng)業(yè)育種過程 的抗病大豆品種篩選十分不利，品種篩選的效率很低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種抗大豆疫霉根腐病基因及其應用，所采取的 技術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗大豆疫霉根腐病基因，該序列尚未公開基因是大豆 基因 GmDRR，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006] 所述基因在大豆育種過程中的應用。
[0007] 優(yōu)選地，所述基因在分子標記輔助選擇育種中的應用。
[0008] 進一步，所述應用是使用特異性引物GmDRRf和GmDRRr進行PCR擴增，其中，特異性 引物GmDRRf的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示，特異性引物GmDRRr的核苷酸序列如SEQID N0.3所示。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供一種利用所述基因鑒定或篩選抗大豆疫霉根腐病品種 的方法，該方法是以大豆GmUKNl基因或act in基因為內(nèi)參基因，利用PCR定量分析待鑒定品 種的GmDRR基因的表達量差異，分析待鑒定品種的大豆疫霉根腐病的抗性。
[0010] 優(yōu)選地，所述大豆疫霉根腐病的抗性，是對大豆疫霉根腐病菌1號和3號生理小種 的抗性。
[0011] 所述方法的步驟如下：
[0012] 1)利用大豆疫霉根腐病菌1號或3號生理小種感染待測品種，獲得感染品種；
[0013] 2)提取步驟1)所得的感染品種的CDNA，并以所得的CDNA為模板，以內(nèi)參基因 GmUKNl引物對和目的基因 GmDRR的特異性引物對為引物進行PCR擴增，并通過熒光定量PCR 儀實時檢測；
[0014] 3)根據(jù)步驟2)的檢測結(jié)果分析待測品種的大豆疫霉根腐病抗性。
[0015] 優(yōu)選地，步驟2)所述目的基因 GmDRR的特異性引物對，為引物GmDRRf和GmDRRr，核 苷酸序列分別如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示;所述內(nèi)參基因 GmUKNl引物對，分別如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
[0016] 優(yōu)選地，所述PCR擴增，擴增條件為:先在95 °C 30s的條件下進行一個循環(huán)，再在95 °C 5s; 60 °C 30s的條件下進行40個循環(huán)。
[0017] 優(yōu)選地，步驟3)所述分析待測品種的大豆疫霉根腐病抗性，是，如果在待測品種在 接種大豆疫霉根腐病菌6h后在根、莖和葉中基因 GmDRR的表達量快速增加，則待測品種為抗 性品種；如果在接種大豆疫霉根腐病菌6h后基因 GmDRR的表達量變化不明顯，則為感病品 種。
[0018] 本發(fā)明獲得的有益效果如下：
[0019] 目前，大豆抗疫霉根腐病關(guān)鍵基因還沒有克隆出來，本發(fā)明提供的基因首次被證 實可以直接指示大豆品種對大豆抗疫霉根腐病菌1號和3號生理小種的抗感性，對于深入研 究大豆抗病機理和指導分子輔助育種實際意義重要。
【附圖說明】
[0020] 圖1為接種疫霉菌1號后GmDRR在葉中隨時間的實時定量分析。
[0021] 圖2為接種疫霉菌1號后GmDRR在根中隨時間的實時定量分析。
[0022]圖3接種疫霉菌1號后GmDRR在莖中隨時間的實時定量分析。
[0023]圖4接種疫霉菌3號后GmDRR在葉中隨時間的實時定量分析。
[0024]圖5接種疫霉菌3號后GmDRR在根中隨時間的實時定量分析。
[0025]圖6接種疫霉菌3號后GmDRR在莖中隨時間的表達變化。
[0026] 圖7農(nóng)桿菌菌液和疫霉菌孢子懸浮液注射煙草葉片癥狀；
[0027] (圖中，左側(cè)葉子為局部注射疫霉菌孢子懸浮液后的表現(xiàn)型；右側(cè)葉子"+"部分為 同時注射疫霉菌孢子懸浮液和含pLeela-GmDRR質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液后的表現(xiàn)型，另一部分則 為僅注射疫霉菌孢子懸浮液后的表現(xiàn)癥狀）。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0029] 以下實施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī) 材料、試劑、儀器和方法，均可通過商業(yè)渠道獲得。
[0030] 在以下的實施方案中，除非特別說明，否則所有操作均按照《分子克隆實驗指南》 (第三版)（黃培堂等譯，北京:科學出版社，2002)所提供的方法進行。
[0031] 本發(fā)明選取大豆種優(yōu)質(zhì)資源20份(見表1)，針對品種對大豆疫霉根腐病1號和3號 生理小種的抗感性差異，明確6份大豆品種資源進行基因與大豆抗病性的關(guān)系鑒定。
[0032]表1 20份大豆種質(zhì)資源名稱
[0033]
[0034] 實施例1
[0035] 1實驗所用試劑 [0036] 1)提取大豆RNA的試劑
[0037] TRIzol Reagent，購自 Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，RNase-free DNasel， RNasin，Taq 酶，dNTP，01igo(dT)，DTT均購自TaKaRa公司；DEPC購自Sigma公司；電泳用瓊脂 糖（Agarose)為西班牙進口試劑；QuantiFast SYBR Green PCR Kit購自QIAGEN公司。
[0038] 2基因組RNA提取方法
[0039] 準備工作：
[0040] (l)DEPC(O.l%)水配制:將lmL DEPC加入1000mL去離子水中，磁力攪拌24h。
[0041 ] (2)將研缽、鑷子、燒杯、量筒、玻璃棒等放入烘箱，180 °C干熱滅菌6h以上。
[0042] (3)將離心管、槍頭等裝入已干熱滅菌的試劑瓶中，用配好的DEPC(0.1 % )水充分 浸泡，瓶□用封□膜和錫箱紙封好，室溫放置12小時以上，然后將DEPC水倒出，高壓滅菌40 分鐘。再將裝有離心管、槍頭的試劑瓶放入烘箱中烘干備用。
[0043] (4)將用于RNA電泳的電泳槽清洗干凈，用乙醇干燥，然后用3 %的H202溶液灌滿整 個電泳槽，室溫放置10分鐘，最后用高壓滅菌后的0.1 % DEPC水徹底沖洗電泳糟。
[0044] (5)RNA檢測時電泳緩沖液需用DEPC水配制，預先將電泳緩沖液放在冰箱中預冷， 電泳時將電泳槽置于冰盒上進行電泳效果會更好。
[0045]提取方法：
[0046] (1)取50-100mg新鮮大豆組織迅速放入預先加有液氮的研缽中，研磨成粉沫，快速 將粉沫轉(zhuǎn)入盛有l(wèi)mL TRIzol Reagent的DEPC處理過的1.5mL離心管中；
[0047] (2)15-30°C 溫浴 5min，加入 0.2mL 氯仿，劇烈震蕩 15sec;
[0048] (3)15-30°C 溫浴 2-3min，4°C 小于 12000g 離心 15min;
[0049] (4)將上清液轉(zhuǎn)入新離心管，加入0· 5mL異丙醇，15-30°C放置10min;
[0050] (5)4°C12000g 離心 15 分鐘；
[0051 ] (6)去上相，加 lmL 75%的乙醇渦懸洗滌沉淀；
[0052] (7)4°C7000g 離心 5min;
[0053] (8)自然干操（5min)，溶于50-100yL DEPC水。
[0054] 3反轉(zhuǎn)錄RNA方法
[0055] 反轉(zhuǎn)錄米用Takara公司的 PrimeScripUi'RT Master Mix(Perfect Real Time) (DRR036A)，操作方法按照其說明書進行，方法如下：
[0056] (1)按照下列組分制備RT反應(反應液配置請在冰上進行），反應體系如表2所示