細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片及其試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片，其特征在于所述芯片上蓋、細(xì)胞捕獲框架、濾過網(wǎng)和芯片底座從上到下依次連接，所述芯片上蓋上設(shè)有流入通道，所述芯片上蓋與所述細(xì)胞捕獲框架連接的側(cè)面上設(shè)有若干通孔，所述細(xì)胞捕獲框架內(nèi)設(shè)有若干細(xì)胞捕獲蜂巢，所述細(xì)胞捕獲框架上設(shè)有流出通道、流入通道，所述芯片底座上設(shè)有流出通道，檢測(cè)試劑A：10mmol/L-100mmol/LpH8.4磷酸鹽緩沖液，B：5mmol/L–50mmol/L硫磺酸鹽，試劑進(jìn)入次序?yàn)锳：B，流速比例為A∶B=2∶1-10∶1。在利用芯片技術(shù)測(cè)定細(xì)胞淀粉樣變過程中由于血液中存在淀粉樣變前蛋白，需要鑒別細(xì)胞上存在淀粉樣變成分，利用免疫標(biāo)記技術(shù)難以測(cè)定細(xì)胞淀粉樣變，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)非器官組織內(nèi)沉積淀粉樣變的方法。
【專利說明】細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片及其試劑
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及利用芯片測(cè)定細(xì)胞淀粉樣變的芯片及其試劑。體現(xiàn)在本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種細(xì)胞芯片可捕獲細(xì)胞，同時(shí)淀粉樣變?cè)噭┡c淀粉樣變成分相互作用，實(shí)現(xiàn)測(cè)定細(xì)胞的淀粉樣變成分。
技術(shù)背景
[0003]淀粉樣變amyloidosis —種無定形蛋白纖維物質(zhì)沉積于器官組織細(xì)胞間質(zhì)成分，經(jīng)蘇木精一伊紅(H&E)染色呈現(xiàn)粉色，過碘酸-希夫(PAS)染色呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。剛果紅染色呈橘紅色， 在偏振光顯微鏡觀察為蘋果綠色熒光。組織內(nèi)淀粉樣變可以利用剛果紅染色，結(jié)合顯微鏡確定淀粉樣變沉積，而血液、漿膜腔積液、腦脊液等體液中的淀粉樣變?nèi)鄙傧鄳?yīng)檢查方法。開發(fā)芯片及淀粉樣變特異性標(biāo)本熒光探針能夠檢查淀粉樣變成分。
[0004]細(xì)胞芯片是以細(xì)胞作為研究對(duì)象的一種生物芯片技術(shù)，它是為適應(yīng)基因、分子時(shí)代對(duì)于探索生命科學(xué)需求而產(chǎn)生的新興技術(shù)。細(xì)胞芯片即保持傳統(tǒng)研究細(xì)胞方法的優(yōu)點(diǎn)如又滿足了高通量、大樣本及快速獲取細(xì)胞信息等特點(diǎn)?？捎糜谘芯刻囟ɑ蚣氨磉_(dá)蛋白質(zhì)與疾病之間的相互關(guān)系，對(duì)于疾病診斷、藥物治療靶點(diǎn)篩選、細(xì)胞定位、抗體藥物篩選等方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0005]在2013年4月24日公開的黃曉波等發(fā)明專利“一種細(xì)胞微陣列芯片及其制備方法”，公開專利號(hào)CN103060175A，本專利公開了一種細(xì)胞微陣列芯片及其制備方法屬于細(xì)胞芯片【技術(shù)領(lǐng)域】。其特征是由海藻酸凝膠制備的海藻酸凝膠細(xì)胞微陣列芯片，操作簡便可用于細(xì)胞組織化培養(yǎng)、化合物或藥物的高通量篩選、新基因的發(fā)現(xiàn)、以及蛋白質(zhì)組學(xué)研究等。制備方法:
(I)在玻璃板上涂敷一層海藻酸鈉溶液，快速浸入氯化鈣溶液中，浸泡5~30分鐘形成凝膠模板。
[0006](2)制備一個(gè)上面排布有多個(gè)圓柱體的點(diǎn)陣模板，將圓柱體頂端浸泡在殼聚糖或聚賴氨酸溶液中5~30分鐘后取出。
[0007](3)將圓柱體頂端壓印在海藻酸凝膠模板上，通過靜電絡(luò)合反應(yīng)形成絡(luò)合物點(diǎn)陣模板。
[0008](4)將絡(luò)合物點(diǎn)陣模板浸泡在細(xì)胞濃度為I X IO5~I X IO7的培養(yǎng)液中培養(yǎng)4~16小時(shí)，形成海藻酸凝膠細(xì)胞微陣列芯片。
[0009]細(xì)胞可以表達(dá)淀粉樣變前蛋白，相關(guān)蛋白在機(jī)體內(nèi)逐漸形成淀粉樣變，可以沉積于組織器官細(xì)胞間質(zhì)或存在于細(xì)胞。測(cè)定淀粉樣變的方法有組織病理染色法、免疫組織化學(xué)法、淀粉樣變熒光探針法等檢測(cè)方法，而這些方法只能夠測(cè)定組織沉積淀粉樣變的方法而不能測(cè)定細(xì)胞淀粉樣變。由于血液中存在10余種類型細(xì)胞，能夠測(cè)定不同類型細(xì)胞淀粉樣變具有臨床意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是，在利用芯片技術(shù)測(cè)定細(xì)胞淀粉樣變過程中由于血液中存在淀粉樣變前蛋白，需要鑒別細(xì)胞上存在淀粉樣變成分，利用免疫標(biāo)記技術(shù)難以測(cè)定細(xì)胞淀粉樣變，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)非器官組織內(nèi)沉積淀粉樣變的方法。發(fā)明提出解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是:本發(fā)明的配套試劑包括A:微流控溶液為lOmmol/L - 100 mmol/L pH8.4磷酸鹽緩沖液PBS，B:淀粉樣變測(cè)定溶液，5mmol/L - 50mmol/L硫磺酸鈉溶液。
[0011]細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片部分包括芯片上蓋、細(xì)胞捕獲框架、濾過網(wǎng)和芯片底座。芯片上蓋、底座、細(xì)胞捕獲框架、濾過網(wǎng)框架材料為玻璃、高分子聚合材料、纖維素膜、石英玻片，濾過網(wǎng)為高分子聚合網(wǎng)篩。
[0012]芯片上蓋(I)為雙層，中間可以通過微流控液體，在與芯片細(xì)胞捕獲框架側(cè)面含有液體流出小孔，孔徑大小在5-40nm之間，保障微流控液體順利通過，在上蓋的一側(cè)含有一個(gè)微流控液體流入通道5，在另一側(cè)不配有輸出通道，但是在芯片上蓋與細(xì)胞捕獲芯片框架側(cè)面，均勻分布大小相等的通孔，通孔外形可為圓形、方形、菱形，保障流入通道進(jìn)入液體的流出。輸入微流控通道可以為圓形、方形的口徑不同的通道。
[0013]芯片細(xì)胞捕獲峰巢框架2高度為40nm-320nm，在細(xì)胞捕獲蜂巢列條上排列細(xì)胞捕獲蜂巢，數(shù)量控制在4-100個(gè)之間，形態(tài)為圓球錐形凹陷巢，口徑為圓形，細(xì)胞捕獲峰巢列條與芯片底座之間成平行排列，各個(gè)細(xì)胞捕獲蜂巢列條之間保持特定距離。
[0014]在芯片細(xì)胞捕獲框架2和芯片底座4之間具有濾過網(wǎng)3，濾過網(wǎng)框架為塑料結(jié)構(gòu)，利用粘合劑將芯片粘合在上述兩框架之間粘合，濾過網(wǎng)為高分子聚合材料。
[0015]芯片底座4為開口長方體收集器結(jié)構(gòu)，連接一個(gè)微流體輸出通道8，不含有微流控液體輸入通道，其框架與芯片濾過網(wǎng)框架3緊密相連，收集由濾過網(wǎng)濾過液體，收集液體通過液體輸出通道排除，輸出通道可為圓形、方形通道，有利于排除洗脫液體成分。
[0016]本發(fā)明的目的在于提供了一種檢測(cè)細(xì)胞淀粉樣變的微流控細(xì)胞芯片及其測(cè)定試劑，利用一種有效的芯片捕獲細(xì)胞的芯片技術(shù)和測(cè)定淀粉樣變?cè)噭?，?shí)現(xiàn)測(cè)定細(xì)胞的淀粉樣變信息，用于淀粉樣變的診斷和評(píng)價(jià)淀粉樣變的治療效果。
[0017]本發(fā)明試劑能夠有利于與細(xì)胞的淀粉樣變成分發(fā)生反應(yīng)。上述試劑類型限定為二種，分別通過兩個(gè)微流控通道5，7進(jìn)入芯片，其中A試劑通過微流控通道5進(jìn)入，通道8流出芯片，而試劑B通過微流控通道7進(jìn)入芯片，通過通道6流出芯片。A、B兩種試劑輸入的比例為A:B=2:1-10:1。整體試劑輸入速度為200ul/min。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為芯片綜合結(jié)構(gòu)主視圖；
圖2芯片表蓋透視示意圖；
圖3芯片細(xì)胞捕獲結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4芯片濾過網(wǎng)透視示意圖 圖5芯片底座透視不意圖。
【具體實(shí)施方式】[0019]參見附圖1-5，本發(fā)明的細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片主要由芯片上蓋1、芯片細(xì)胞捕獲蜂巢框架2、芯片濾過網(wǎng)框架3和芯片底座4構(gòu)成，配有兩個(gè)微流控液體輸入通道5，7，微流控輸出通道6，8。芯片上蓋、芯片底座、芯片細(xì)胞捕獲蜂巢和濾過網(wǎng)框架可采用有機(jī)材料，高分子聚合物，玻璃及石英材料等。下面以具體實(shí)施例進(jìn)一步解釋發(fā)明，但不限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明提供的一種細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片及其測(cè)定試劑。
[0020]芯片上蓋1、細(xì)胞捕獲芯片框架2、濾過網(wǎng)框架3和芯片底座4相互之間由粘合劑緊密連接，形成整體防止液體漏出。在細(xì)胞捕獲框架上分別連接一個(gè)微流控流通輸入通道
7,一個(gè)微流控液體輸出通道6。其中所述細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片的細(xì)胞捕獲蜂巢框架2、濾過網(wǎng)框架3為塑料材料。
[0021]所述細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯上蓋I結(jié)構(gòu)為雙層結(jié)構(gòu)，中間可以通過微流控液體，在與芯片細(xì)胞捕獲框架側(cè)面，含有液體流出小孔，孔徑或邊長大小在5-40nm之間，保障微流控液體順利通過，在上蓋的一次含有一個(gè)微流控液體流入通道5。芯片上蓋I 一側(cè)附有一個(gè)微流控液體輸入通道5，在另一側(cè)不配有輸出通道，但是在芯片上蓋與細(xì)胞捕獲芯片框架側(cè)面，均勻分布大小相等的通孔，保障流入通道進(jìn)入液體的流出。輸入微流控通道可以為圓形、方形的口徑不同的通道。
[0022]芯片細(xì)胞捕獲框架2高度為60nm，在細(xì)胞捕獲框架上排列細(xì)胞捕獲蜂巢，數(shù)量控制在4-100個(gè)之間，形態(tài)為方形陷巢，邊長20-40nm，細(xì)胞捕獲巢列條與芯片底座之間成平行排列，各個(gè)細(xì)胞捕獲巢列條之間保持特定距離。 [0023]在芯片細(xì)胞捕獲框架2和芯片底座4之間具有濾過網(wǎng)3，濾過網(wǎng)框架為塑料結(jié)構(gòu)，利用粘合劑將芯片粘合在上述兩框架之間粘合，濾過網(wǎng)為高分子聚合材料。
[0024]芯片底座4為開口長方體收集器結(jié)構(gòu)，連接一個(gè)微流體輸出通道8，不含有微流控液體輸入通道，其框架與芯片濾過網(wǎng)框架3緊密相連，收集由濾過網(wǎng)濾過液體，收集液體通過液體輸出通道排除，輸出通道可為圓形、方形通道，有利于排除洗脫液體成分。
[0025]本發(fā)明試劑能夠有利于與細(xì)胞的淀粉樣變成分發(fā)生反應(yīng)。上述試劑類型限定為二種，分別通過兩個(gè)微流控通道5，7進(jìn)入芯片，其中A試劑通過微流控通道5進(jìn)入，通道8流出芯片，而試劑B通過微流控通道7進(jìn)入芯片，通過通道6流出芯片。A、B兩種試劑輸入的比例為A:B=2:1-10:1。整體試劑輸入速度為200ul/min。
[0026]首先使細(xì)胞樣本與測(cè)定試劑B作用啟動(dòng)檢測(cè)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行3min-15min時(shí)，開啟試劑A進(jìn)入通道5?？刂圃噭〢與試劑B的流速，流速控制在A:B=2:1-10:1。
實(shí)施例
[0027]1.準(zhǔn)備細(xì)胞控芯片，首先將細(xì)胞樣本與測(cè)定試劑B進(jìn)行混合，通過通道7進(jìn)入芯片細(xì)胞捕獲蜂巢，使細(xì)胞淀粉樣變與試劑作用，應(yīng)時(shí)間3min-15min。
[0028]2.開啟試劑A通道，試劑A通過通道5進(jìn)入細(xì)胞芯片頂蓋，試劑再通過芯片頂蓋側(cè)面進(jìn)入細(xì)胞捕獲蜂巢2。試劑A開啟一定控制在試劑細(xì)胞樣本與試劑B作用在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)。測(cè)試整體試劑的開啟順序?yàn)?，第一步開啟試劑B，第二步開啟試劑A。
[0029]3.當(dāng)啟動(dòng)試劑A通道的同時(shí)，首先調(diào)控試劑A與試劑B流入芯片的比例，控制在A:B=2:1-10:1范圍，整體調(diào)節(jié)流速，整體流速為100ul/min-600ul/min，總進(jìn)樣量控制在1800ul至3600ul，所需時(shí)間為3-6分鐘。[0030]4.測(cè)定芯片內(nèi)細(xì)胞的淀粉樣變成分，整體信號(hào)采集與分析所用時(shí)間在3分鐘以內(nèi)，全過程分析所需時(shí)間為9min - 24min，與病理組織檢測(cè)淀粉樣變所需2-3天時(shí)間相比，在檢測(cè) 速度方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。
【權(quán)利要求】
1.細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片，其特征在于包括芯片上蓋(1)、細(xì)胞捕獲框架(2)、濾過網(wǎng)(3)和芯片底座(4)，所述芯片上蓋(1)、細(xì)胞捕獲框架(2)、濾過網(wǎng)(3)和芯片底座(4)從上到下依次連接，所述芯片上蓋(1)上設(shè)有流入通道(5)，所述芯片上蓋(I)與所述細(xì)胞捕獲框架(2)連接的側(cè)面上設(shè)有若干通孔，所述細(xì)胞捕獲框架(2)內(nèi)設(shè)有若干細(xì)胞捕獲蜂巢，所述細(xì)胞捕獲框架(2)上設(shè)有流出通道(6)、流入通道(7)，所述芯片底座(4)上設(shè)有流出通道(8)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片，其特征在于所述芯片上蓋(I)的結(jié)構(gòu)為雙層結(jié)構(gòu)，溶液通過所述輸入通道(5)流入，所述通孔外形可為方形、圓形。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片，其特征在于所述細(xì)胞捕獲蜂巢為方形凹陷結(jié)構(gòu)形、蜂巢高為40nm-320nm，數(shù)量控制在4-100個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片，其特征在于所述芯片底座(4)為收集輸出溶液，在一側(cè)配有溶液流出通道(8)，可收集流出溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片，其特征在于所述濾過網(wǎng)(3)的外周為框架結(jié)構(gòu)、中間為網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)。
6.用于上述細(xì)胞淀粉樣變檢測(cè)芯片的檢測(cè)試劑，其特征在于檢測(cè)試劑A:1OmmoI/L -.100 mmol/L ρΗ8.4磷酸鹽緩沖液,B:5mmol/L - 50mmol/L硫磺酸鹽，試劑進(jìn)入次序?yàn)锳:B，流速比例為A:B=2:1-10:1。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK103981082SQ201410246012
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月4日
【發(fā)明者】孫續(xù)國, 孫朝, 宋敬, 蘭杰, 鄭芳 申請(qǐng)人:天津祿浩科技有限公司