一種s-雌馬酚產(chǎn)生工程菌及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌，所述工程菌是將來(lái)源于乳酸菌(Lactococcus?sp.)20-92的L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因克隆至大腸桿菌BL21(D3)，轉(zhuǎn)化得到S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌；本發(fā)明提供一種發(fā)酵條件簡(jiǎn)單、使用方便、體系穩(wěn)定、應(yīng)用廣泛的S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌，所述S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌無(wú)論是在厭氧還是有氧條件下，均具有將BHI和LB培養(yǎng)基中的大豆素轉(zhuǎn)化S-雌馬酚的能力；該工程菌具有將BHI和LB中的豆粕轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚的能力；該工程菌有利于BHI中豆粕的大豆苷原釋放。
【專利說(shuō)明】—種S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌及應(yīng)用(—)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用，特別涉及一種來(lái)源與乳酸菌的S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌及將大豆素或豆柏轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚的應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]大豆異黃酮具有多種生物學(xué)功能，從1980年起，大量醫(yī)學(xué)研究表明，大豆異黃酮除與雌激素受體結(jié)合，從而有效地預(yù)防骨質(zhì)疏松、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌外，還能與雄激素受體結(jié)合減少前列腺癌的發(fā)生，并具有抗氧化、抗溶血和抗真菌活性等。在動(dòng)物生產(chǎn)上，國(guó)內(nèi)外大量研究表明大豆異黃酮可以促進(jìn)雄性動(dòng)物生長(zhǎng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫，改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)，提高生產(chǎn)性能等。但大豆異黃酮的生物學(xué)作用在一定程度上歸因于其代謝產(chǎn)物雌馬酚，人體能否將大豆黃素代謝為雌馬酚是決定大豆異黃酮能否更有效地發(fā)揮其降低腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松以及更年期綜合癥等慢性疾病風(fēng)險(xiǎn)作用的關(guān)鍵因素。因此雌馬酚的作用受到普遍關(guān)注，成為目前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。雌馬酚是大豆異黃酮重要的代謝產(chǎn)物，人群中約有30%~50%的人能將大豆異黃酮轉(zhuǎn)化成雌馬酚進(jìn)而排泄，但影響其轉(zhuǎn)化的因素目前尚不完全清楚，其中腸道菌群可能是最重要的因素。
[0003]異黃酮類化合物在天然大豆中主要以結(jié)合了糖基的糖苷大豆異黃酮方式存在，即糖苷大豆黃酮(daidzin)和糖苷染料木素(genistin)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，糖苷形式的大豆異黃酮不能直接經(jīng)小腸壁吸收，因此沒(méi)有生理活性。而去除糖基配體后形成的中間代謝產(chǎn)物大豆黃酮苷元(daidzein)和染料木素苷元(genistein)等也只表現(xiàn)出弱雌激素樣活性。只有由腸道細(xì)菌特異性降解后產(chǎn)生的代謝終產(chǎn)物一雌馬酚才具有較高的生物學(xué)活性。與大豆黃酮苷元相比 ，雌馬酚與雌激素受體結(jié)合的親和力、抗氧化活性、抗前列腺癌作用更強(qiáng)，而在血漿中的清除速度更慢。因此大豆異黃酮的生物活性更多的是由其代謝終產(chǎn)物雌馬酚來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
[0004]目前生產(chǎn)雌馬酚的主要方法為化學(xué)合成，其存在的兩個(gè)問(wèn)題就是:(1)腸道菌代謝產(chǎn)生的雌馬酚都是S-型的，具有生物活性；而以大豆黃素為原料化學(xué)合成的雌馬酚是R-雌馬酚和S-雌馬酚混合的外消旋化合物，R-雌馬酚是沒(méi)有活性的；(2)化學(xué)合成需要金屬催化劑、氫氣、高壓高溫等，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求高，產(chǎn)量低，成本也比較高。所以能否采用生物法合成雌馬酚成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)。對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前與本發(fā)明密切相關(guān)的專利有“不動(dòng)桿菌AUH-JLM455及其轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚的方法”(申請(qǐng)?zhí)?200810147314.9)，“雌馬酚產(chǎn)生菌及利用”(申請(qǐng)?zhí)?201080007863.1)，“含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物”(申請(qǐng)?zhí)?200480020952.4)，“含有維持了雌馬酚產(chǎn)生能力的雌馬酚產(chǎn)生微生物的發(fā)酵制品及其制備方法”(申請(qǐng)?zhí)?200980136848.4)，“一種奇異變形桿菌菌株及其轉(zhuǎn)化大豆苷元生產(chǎn)S-雌馬酚的方法”(申請(qǐng)?zhí)?201210146746.4)，“一種屎腸球菌及其產(chǎn)生雌馬酚的方法與應(yīng)用”(申請(qǐng)?zhí)?201110086803.X)，和“一株降解大豆苷原產(chǎn)生雌馬酚的雙酶梭菌及其菌劑和應(yīng)用”(申請(qǐng)?zhí)?201010513344.4)。以上這些專利均是使用從腸道中分離獲得的單一或少數(shù)幾種細(xì)菌混合厭氧發(fā)酵生產(chǎn)雌馬酚，但研究發(fā)現(xiàn)分離到的這些細(xì)菌大部分是細(xì)菌新種，而且不同的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件會(huì)影響其是否能產(chǎn)生雌馬酚，再加上厭氧培養(yǎng)等要求較高，所以采用原始分離菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)雌馬酚的方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還有可能因?yàn)榕囵B(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的原因而影響雌馬酚產(chǎn)量和發(fā)酵成本。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)目前生物學(xué)方法生產(chǎn)S-雌馬酚的局限性，構(gòu)建了一種操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定有效、發(fā)酵條件簡(jiǎn)單的S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌。并利用此工程菌對(duì)S-雌馬酚的生產(chǎn)能力進(jìn)行了驗(yàn)證與應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]本發(fā)明提供一種S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌，所述工程菌是將來(lái)源于乳酸菌(Lactococcus sp.) 20-92 的 L-DDRC, L-DZNR、L-DHDR 和 L-THDR 基因克隆至大腸桿菌BL21 (D3)，轉(zhuǎn)化得到S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌；所述L-DDRC的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示、L-DZNR的核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示、L-DHDR的核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示，L-THDR的核苷酸序列為SEQ ID NO:4所示。
[0008]進(jìn)一步，本發(fā)明所述S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌按如下方法構(gòu)建:
[0009]在L-DDRC基因的N端和C端分別加上BamH I和Not I酶切位點(diǎn)，在L-DZNR基因的N端和C端分別加上Bgl II和Kpn I酶切位點(diǎn)，在L-DHDR基因的N端和C端分別加上BamH I和Not I酶切位點(diǎn)，在L-THDR基因的N端和C端分別加上EcoR V和Not I酶切位點(diǎn)；利用人工全基因合成的方法分別合成以上基因，人工合成時(shí)分別在以上基因的兩端加上EcoR V酶切位點(diǎn)，待全基因人工合成后，用EcoR V進(jìn)行酶切后分別將L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR 和 L-THDR 克隆至載體 pUC57，得到質(zhì)粒 pUC57_L_DDRC、pUC57_L_DZNR、PUC57-L-DHDR 和 pUC57_L_THDR ；用 BamH I 和 Not I 對(duì)質(zhì)粒 pUC57_L_DDRC 和 pETDuet-1分別進(jìn)行雙酶切后，膠回收酶切產(chǎn)物，然后利用連接試劑盒將酶切回收后的產(chǎn)物連接成一個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒 pETDuet-1-L-DDRC ;用 BamH I 和 Not I 對(duì)質(zhì)粒 pUC57_L_DHDR 和 pCDFDuet-1分別進(jìn)行雙酶切后，膠回收酶切產(chǎn)物，然后利用連接試劑盒將酶切回收后的產(chǎn)物連接成一個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒 pCDFDuet-1-L-DHDR ;用 Bgl II 和 Kpn I 對(duì)質(zhì)粒 pUC57_L_DZNR 和pETDuet-1 -L-DDRC分別進(jìn)行雙酶切后，膠回收酶切產(chǎn)物，然后利用連接試劑盒將酶切回收后的產(chǎn)物連接成一個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒pETDuet-1-L-DDRC-DZNR ；用EcoR V和Kpn I對(duì)質(zhì)粒PUC57-L-THDR和pCDFDuet-1-L-DHDR分別進(jìn)行雙酶切后，膠回收酶切產(chǎn)物，然后利用連接試劑盒將酶切回收后的產(chǎn)物連接成一個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒P⑶FDuet-1-L-DHDR-THDR ;然后將質(zhì)粒pETDuet-1-L-DDRC-DZNR和pCDFDuet-1-L-DHDR-THDR同時(shí)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 (D3)，獲得重組工程菌；將重組工程菌接種至含終濃度50 μ g/ml羧芐青霉素和終濃度50 μ g/ml鏈霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C好氧培養(yǎng)24h，篩選同時(shí)具有羧芐青霉素和鏈霉素抗性的克隆，獲得生產(chǎn)S-雌馬酚的工程菌。
[0010]本發(fā)明提供一種所述S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌在制備S-雌馬酚中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為:以大豆素或豆柏為底物，將S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的種子液以體積濃度5%的接種量接種至BHI培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基，在好氧或厭氧條件下，37°C培養(yǎng)24h，向培養(yǎng)液中加入終濃度25mg/L的IPTG，37°C繼續(xù)培養(yǎng)6~72h后，取培養(yǎng)液分離純化，獲得S-雌馬酚；所述BHI培養(yǎng)基終濃度組成為:蛋白胨10g/L、脫水小牛腦浸粉12.5g/L、脫水牛心浸粉5.0g/L、氯化鈉5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氫二鈉2.5g/L，溶劑為水，pH值為7.0 ;所述LB培養(yǎng)基終濃度組成:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化鈉10g/L，溶劑為水，pH值為 7.0。
[0011]所述大豆素的初始濃度為50μ g/ml。
[0012]所述豆柏的初始濃度為15g/L。
[0013]所述S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌在制備S-雌馬酚中的應(yīng)用按如下步驟進(jìn)行:(I)種子培養(yǎng):將S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌接種至含有終濃度50 μ g/ml羧芐青霉素和終濃度50 μ g/ml鏈霉素的BHI培養(yǎng)基中，37°C靜置，厭氧培養(yǎng)24h后，獲得種子液；(2)發(fā)酵培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化反應(yīng):將大豆素或豆柏加入BHI培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基，然后以體積濃度5%的接種量接種種子液，在好氧或厭氧條件下，37°C培養(yǎng)24h，向培養(yǎng)液中加入終濃度25mg/L的IPTG (以誘導(dǎo)外源插入基因的表達(dá))，37°C繼續(xù)培養(yǎng)6~72h后，取培養(yǎng)液分離純化，獲得S-雌馬酚；所述大豆素的初始濃度為50 μ g/ml，所述豆柏的初始濃度為15g/L。
[0014]所述培養(yǎng)液分離純化的方法為:取Iml的培養(yǎng)液，8000r/min離心3分鐘，獲得上清a ;取900 μ I上清a至另一干凈的2ml EP管中，然后向管中加入900 μ I乙酸乙酯，充分混勻后靜置5min，5000r/min離心5分鐘，獲得上清b和沉淀b ;取900 μ I上清b至另一干凈的2ml EP管中；取沉淀b加入等量的乙酸乙酯重復(fù)離心I次，獲得上清c ;將上清b和上清c混合在一起，移到2ml離心管中，45°C真空冷凍濃縮成粉末；加入200 μ I無(wú)水甲醇到該EP管溶解濃縮粉末，并經(jīng)0.22 μ m聚偏氟乙稀微孔濾膜過(guò)濾，濾液即為S-雌馬酚。
[0015]本發(fā)明所述上清a、上清b、上清c均為上清液，為了便于區(qū)分不同步驟獲得的上清液不同而命名，字母本身沒(méi)有含義。
[0016]本發(fā)明所構(gòu)建的生產(chǎn)S-雌馬酚的工程菌的驗(yàn)證包括:(I)使用PCR和雙酶切的方法驗(yàn)證雌馬酚產(chǎn)生基因L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR確實(shí)已經(jīng)同時(shí)克隆到同一宿主菌BL21 (D3) ； (2)使用HPLC方法證實(shí)本發(fā)明所構(gòu)建的生產(chǎn)S-雌馬酚的工程菌確實(shí)具有將大豆素或豆柏轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚的能力；(3)液-質(zhì)聯(lián)用進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明所構(gòu)建工程菌將大豆素轉(zhuǎn)化出的疑似S-雌馬酚光譜峰確實(shí)為S-雌馬酚。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:提供一種發(fā)酵條件簡(jiǎn)單、使用方便、體系穩(wěn)定、應(yīng)用廣泛的S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌，所述S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌無(wú)論是在厭氧還是有氧條件下，均具有將BHI和LB培養(yǎng)基中的大豆素轉(zhuǎn)化S-雌馬酚的能力；該工程菌具有將BHI和LB中的豆柏轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚的能力；該工程菌有利于BHI中豆柏的大豆苷原釋放。
(四)【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是實(shí)施例1中乳酸菌源S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌的構(gòu)建示意圖。
[0019]圖2是S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌的PCR鑒定結(jié)果圖。將工程菌質(zhì)粒和空載體分別使用 PCR 引物 pET Upl 和 pET Downl (泳道 1、5)、PCR 引物 DuetUP2 和 ITterminator (泳道 2、
4、6和 8)及PCR引物PCDFUpI和PCDF Downl (泳道3和7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)。
[0020]圖3是S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌的Western blot鑒定結(jié)果圖。泳道I和2分別代表這些蛋白樣品來(lái)源于含有空載體pETDuet-Ι和P⑶FDuet-1的大腸桿菌和含有工程菌質(zhì)粒pETDuet-1 -L-DDRC-DZNR 和 pCDFDuet-1-L-DHDR-THDR 的大腸桿菌。A 是使用抗 His 標(biāo)簽的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。B是使用抗S標(biāo)簽的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。[0021]圖4是高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)工程菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)S-雌馬酚的圖譜;A為S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品，B為S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌發(fā)酵液。
[0022]圖5是工程菌發(fā)酵液HPLC9.5分鐘時(shí)光譜吸收峰的質(zhì)譜鑒定圖譜，A為S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品的陽(yáng)離子掃描圖，B為S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品的負(fù)離子掃描圖，C為工程菌發(fā)酵液HPLC9.5分鐘時(shí)陽(yáng)離子掃描圖，D為工程菌發(fā)酵液HPLC9.5分鐘時(shí)負(fù)離子掃描圖。
[0023]圖6是工程菌在不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)條件下的生產(chǎn)S-雌馬酚的產(chǎn)量圖。
[0024]圖7是工程菌利用豆柏轉(zhuǎn)化生成S-雌馬酚的產(chǎn)量圖。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0026]實(shí)施例1:乳酸菌源雌馬酚產(chǎn)生工程菌的構(gòu)建
[0027]本發(fā)明通過(guò)使用基因人工合成和雙酶切連接的方法構(gòu)建了一種S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌，雌馬酚產(chǎn)生工程菌的構(gòu)建，主要包括以下步驟:
[0028]1.乳酸菌源雌馬酚產(chǎn)生基因的人工合成
[0029]采用全基因人工合成的方法分別將來(lái)源于乳酸菌菌株(Lactococcus sp.) 20-92的L-DDRC (核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示)、L-DZNR(核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示)、L-DHDR(核苷酸序列 為SEQ ID NO:3所示)和L-THDR(核苷酸序列為SEQ ID NO:4所示)基因克隆到PUC57載體(金斯瑞生物科技有限公司)的EcoR V酶切位點(diǎn)，并且在L-DDRC基因的N端和C端分別加上BamH I和Not I酶切位點(diǎn)，在L-DZNR基因的N端和C端分別加上Bgl 11和Kpn I酶切位點(diǎn)，在L-DHDR基因的N端和C端分別加上BamH I和Not I酶切位點(diǎn)，在L-THDR基因的N端和C端分別加上EcoR V和Not I酶切位點(diǎn)。DNA測(cè)序結(jié)果表明，本發(fā)明通過(guò)人工合成的這些基因與乳酸菌菌株20-92的雌馬酚產(chǎn)生L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因完全一致。
[0030]2.S-雌馬酚產(chǎn)生質(zhì)粒與工程菌的構(gòu)建
[0031]使用雙酶切后連接的方法分別將L-DDRC基因和L-DZNR基因克隆到大腸桿菌兼性表達(dá)載體PETDuet-1(購(gòu)自中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心)上，獲得質(zhì)粒PETDuet-1-L-DDRC-DZNR ；將L-DHDR基因和L-THDR基因克隆到大腸桿菌兼性表達(dá)載體PCDFDuet-1上(購(gòu)自中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心)(圖1)，獲得質(zhì)粒 PCDFDuet-1-L-DHDR-THDR。然后將質(zhì)粒 PETDuet-1-L-DDRC-DZNR 和PCDFDuet-1-L-DHDR-THDR利用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法同時(shí)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 (D3)(購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司)。然后在含有羧芐青霉素(50 μ g/ml)和鏈霉素(50 μ g/ml)的LB平板上篩選同時(shí)具有這兩種抗菌素抗性的克隆，獲得S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌。
[0032]LB平板終濃度組成為:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化鈉10g/L，溶劑為水，pH值為7.0。
[0033]具體操作步驟如下:用BamH I (寶生物工程(大連)有限公司)和Not I (寶生物工程(大連)有限公司)對(duì)質(zhì)粒PUC57-L-DDRC和pETDuet-Ι分別進(jìn)行雙酶切，利用膠回收試劑盒(購(gòu)自杭州博日科技有限公司)將酶切產(chǎn)物回收后，利用DNA片段連接試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)將酶切回收后的產(chǎn)物連接成一個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒pETDuet-1-L-DDRC ；用BamH I和Not I對(duì)質(zhì)粒pUC57-L_DHDR和p⑶FDuet-1分別進(jìn)行雙酶切后，膠回收酶切產(chǎn)物，然后利用連接試劑盒將酶切回收后的產(chǎn)物連接成一個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒P⑶FDuet-1-L-DHDR ；用Bgl II (寶生物工程(大連)有限公司)和Kpn I (寶生物工程(大連)有限公司)對(duì)質(zhì)粒pUC57-L-DZNR和pETDuet-1-L-DDRC分別進(jìn)行雙酶切后，膠回收酶切產(chǎn)物，然后利用連接試劑盒將酶切回收后的產(chǎn)物連接成一個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒pETDuet-1-L-DDRC-DZNR ;用EcoRV (寶生物工程(大連)有限公司)和Kpn I對(duì)質(zhì)粒pUC57-L-THDR和pCDFDuet-1-L-DHDR分別進(jìn)行雙酶切后，膠回收酶切產(chǎn)物，然后利用連接試劑盒將酶切回收后的產(chǎn)物連接成一個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒 pCDFDuet-1-L-DHDR-THDR ;然后將質(zhì)粒 pETDuet-1-L-DDRC-DZNR 和pCDFDuet-1-L-DHDR-THDR同時(shí)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 (D3)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，獲得重組工程菌；將重組工程菌接種至含終濃度50 μ g/ml羧芐青霉素和終濃度50 μ g/ml鏈霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37 °C好氧培養(yǎng)24h，篩選同時(shí)具有羧芐青霉素和鏈霉素抗性的克隆，獲得生產(chǎn)S-雌馬酚的工程菌。
[0034]3.S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌的驗(yàn)證
[0035]為了進(jìn)一步驗(yàn)證是否已經(jīng)成功地將質(zhì)粒PETDuet-1-L-DDRC-DZNR和PCDFDuet-1-L-DHDR-THDR轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 (D3)，將該工程菌接種至LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后，8000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘后收集菌體。一部分菌體用于細(xì)菌質(zhì)粒提取，另一部分用于細(xì)菌蛋白提取。使用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自杭州博日科技有限公司)提取該工程菌中的質(zhì)粒，并采用PCR電泳的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。采用細(xì)菌蛋白提取液(上海生工生物工程有限公司)提取該工程菌的全蛋白，并分別使用抗His標(biāo)簽和抗S蛋白標(biāo)簽的單克隆抗體進(jìn)行蛋白印跡檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。 [0036]PCR體系和條件:TaKaRa Ex Taq (5U/μ I)(寶生物工程(大連)有限公司)0.3μ I ；1XEx Taq Buffer (Mg2+Plus)5y I ;dNTP Mixture (各 2.5mM)4y I ;質(zhì)粒模板 2μ I ;引物 1:1OpM ;引物2:10ρΜ ;滅菌蒸懼水補(bǔ)足50 μ 10
[0037]PCR 引物
[0038]pET Upl:5- ‘ATGCGTCCGGCGTAGA-3’
[0039]pET Downl:5- ‘ GATTATGCGGCCGTGTACAA-3 ’
[0040]DuetUp2:5- ‘TTGTACACGGCCGCATAATC-3’
[0041]T7Terminator:5- ‘GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’
[0042]pCDFUpl:5- ‘GGATCTCGACGCTCTCCCT-3’
[0043]pCDF Downl:5- ‘ GATTATGCGGCCGTGTACAA-3 ’
[0044]PCR 條件:94°C，4 分鐘，I 個(gè)循環(huán)；94°C，I 分鐘，50。。，I 分鐘，72。。，1.5 分鐘，35 個(gè)循環(huán)；72°C，15分鐘，I個(gè)循環(huán)；
[0045]Western blot 檢測(cè)
[0046]細(xì)菌蛋白提取:使用細(xì)菌細(xì)胞蛋白裂解液(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取細(xì)菌全蛋白。蛋白質(zhì)電泳:使用15% Tris-HCl預(yù)制膠(生工生物工程(上海)股份有限公司)150V電泳70分鐘。
[0047]蛋白質(zhì)印跡:使用1XHigh molecules western transfer buffer (生工生物工程(上海)股份有限公司)100V轉(zhuǎn)膜60分鐘。然后使用新型一步法快速WB試劑盒和高靈敏ECL發(fā)光試劑進(jìn)行檢測(cè)。[0048]從圖2可以看出該工程菌中含有4條與L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因大小相一致的電泳條帶。說(shuō)明已經(jīng)成功的將這4個(gè)基因克隆至大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 (D3)中。從圖3可以看到我們利用蛋白印跡的方法檢測(cè)到了 4條蛋白大小與L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因編碼的蛋白大小基本一致的蛋白條帶，說(shuō)明這4個(gè)基因能同時(shí)在工程菌中表達(dá)。
[0049]實(shí)施例2:乳酸菌源S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌的功能驗(yàn)證
[0050]本發(fā)明通過(guò)使用HPLC和液-質(zhì)聯(lián)用對(duì)工程菌生產(chǎn)S-雌馬酚的能力進(jìn)行功能驗(yàn)證，S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌的功能驗(yàn)證主要包括以下步驟:
[0051]1.S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌的準(zhǔn)備
[0052]從-80°C冰箱中將50 μ I工程菌保存液接種到5ml含有羧芐青霉素(50 μ g/ml)和鏈霉素(50 μ g/ml)的腦心浸液液體培養(yǎng)基(BHI)中，放置在Electrotek厭氧工作站(購(gòu)自英國(guó)Electrotek公司)中，37°C靜置培養(yǎng)24h后，獲得種子液，用于接種。保存液制備方法:將2ml培養(yǎng)過(guò)夜的菌液8000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘后，棄上清，然后往管中加入lml20%的甘油，充分將菌重懸后放入_80°C冰箱保存。
[0053]BHI培養(yǎng)基終濃度組成為:蛋白胨10g/L、脫水小牛腦浸粉12.5g/L、脫水牛心浸粉
5.0g/L、氯化鈉5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氫二鈉2.5g/L，溶劑為水，pH值為7.0。
[0054]2.發(fā)酵用培養(yǎng)基和發(fā)酵條件
[0055]將250 μ g大豆 素加入5ml的BHI培養(yǎng)基(裝液量為30ml)中，然后將種子液以體積濃度5%的接種量進(jìn)行接種，37°C下于厭氧工作站中靜置培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵液。
[0056]3.工程菌發(fā)酵液中S-雌馬酚含量的HPLC檢測(cè)
[0057]向步驟2培養(yǎng)24h后的發(fā)酵液中加入5 μ L25mg/ml的IPTG水溶液，37°C繼續(xù)培養(yǎng)48h后，取Iml培養(yǎng)液至1.5ml EP管，8000轉(zhuǎn)每分鐘離心3分鐘后，將900 μ L上清a轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的2.0ml EP管，然后每管加入等量的乙酸乙酯，充分混勻后靜置5分鐘，5000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘后，取上清b至另一干凈的2mL EP管中；取上清b后剩下的下層液體用等量的乙酸乙酯再離心I次，獲得上清C，然后將上清b和上清c混合在一起，45°C冷凍離心濃縮成粉末，加入200 μ L無(wú)水甲醇溶解粉末，并經(jīng)0.22 μ m聚偏氟乙稀微孔濾膜(上海興亞凈化材料廠)過(guò)濾，濾液用于HPLC檢測(cè)。以S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)有限公司)為對(duì)照。
[0058]高效液相色譜條件:
[0059]液相色譜系統(tǒng):Waters2695;色譜柱:SunFireTM C185 μ m (4.6mm X 205mmcolumn)。流動(dòng)相:0.01%甲酸(50% )、甲醇(20% )和乙腈(30% );洗脫程序:等度洗脫15min ;流速0.8mL/min ;柱溫30±2°C，樣品溫度7°C ;檢測(cè)波長(zhǎng):S_雌馬酚205nm，大豆素254nm。
[0060]從圖4的HPLC檢測(cè)結(jié)果可以看出，與S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品相比，本發(fā)明構(gòu)建的工程菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵后在其發(fā)酵液中檢測(cè)到了 S-雌馬酚的產(chǎn)生。與S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品相比，工程菌發(fā)酵中在約9.5分鐘時(shí)也能檢測(cè)到相對(duì)應(yīng)的光譜吸收峰，說(shuō)明該工程菌具有將大豆素轉(zhuǎn)化生產(chǎn)為S-雌馬酚的能力。
[0061]4.工程菌發(fā)酵液中S-雌馬酚的液相色譜-質(zhì)譜鑒定。
[0062]將HPLC檢測(cè)表明含有S-雌馬酚的發(fā)酵樣品進(jìn)行進(jìn)一步液-質(zhì)鑒定。[0063]液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)條件
[0064]儀器型號(hào):Agilent6460三重串聯(lián)四級(jí)桿高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀
[0065]HPLC色譜條件:同上
[0066]質(zhì)譜條件:ESI離子源，正或負(fù)離子掃描，掃描范圍為100~lOOOamu，干燥氣溫度:325°C;干燥氣流量:5L/min ;霧化器壓力:45Psi ;鞘流氣溫度:350°C;鞘流氣流量:1lL/min;毛細(xì)管電壓:3000V(+), 3500(-);霧化氣壓力電壓:0(+), 500(-);裂解電壓:135V。
[0067]收集工程菌發(fā)酵液中HPLC9.5分鐘時(shí)出現(xiàn)的光譜峰樣品用于陽(yáng)離子和陰離子質(zhì)譜檢測(cè)分析。從圖5可以看出，發(fā)酵液中此峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)與S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品的分子量完全一致，由此可以斷定本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌其發(fā)酵液中在9.5分鐘時(shí)出現(xiàn)的光譜峰就是S-雌馬酚。進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌具有將大豆素轉(zhuǎn)化為雌馬酚的能力。
[0068]實(shí)施例3乳酸菌源S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌的應(yīng)用
[0069]1.S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌的準(zhǔn)備
[0070]種子培養(yǎng):
[0071]從-80°C冰箱中將50 μ I工程菌保存液接種到5ml含有羧芐青霉素(50 μ g/ml)和鏈霉素(SOμg/ml)的腦心浸液液體培養(yǎng)基中(BHI)，放置在厭氧工作站中，37°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜，獲得種子液，用于接種。
[0072]2.發(fā)酵用培 養(yǎng)基和發(fā)酵條件
[0073](I)將大豆素作為底物加入BHI培養(yǎng)基中，大豆素在BHI培養(yǎng)基終濃度為0.05g/L，然后以體積濃度5%的接種量將步驟I獲得的種子液進(jìn)行接種(裝液量為30ml)，37°C下于厭氧工作站中培養(yǎng)培養(yǎng)24h，加入5 μ L (占培養(yǎng)液體積的0.1 % ) 25mg/ml的IPTG水溶液，37°C繼續(xù)培養(yǎng)24、48h、72h和96h后，采用實(shí)施例2步驟3的方法進(jìn)行HPLC檢測(cè)。
[0074](2)同樣條件下，以大豆素為底物，以LB培養(yǎng)基為培養(yǎng)液，大豆素在LB培養(yǎng)基中的終濃度為0.05g/L,培養(yǎng)條件及檢測(cè)方法同步驟(1)。LB培養(yǎng)基終濃度組成:胰蛋白胨1g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化鈉10g/L，溶劑為水，pH值為7.0。
[0075](3)同樣條件下，以豆柏為底物，以BHI培養(yǎng)基為培養(yǎng)液，豆柏在BHI培養(yǎng)基中的終濃度為15g/L，培養(yǎng)條件及檢測(cè)方法同步驟(1)。
[0076](4)將步驟(1)-(3)的培養(yǎng)條件分別改為好氧條件下，37°C普通的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間。
[0077]3.工程菌發(fā)酵液中S-雌馬酚含量的HPLC檢測(cè)
[0078]發(fā)酵結(jié)果表明，本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌無(wú)論是在有氧還是厭氧條件下，均能將BHI培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的大豆素轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚(圖6)。從圖7可以看出，本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌也具有直接利用豆柏轉(zhuǎn)化生產(chǎn)S-雌馬酚的能力(圖7)。
【權(quán)利要求】
1.一種S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌，其特征在于所述工程菌是將來(lái)源于乳酸菌(Lactococcus sp.) 20-92 的 L-DDRC, L-DZNR、L-DHDR 和 L-THDR 基因克隆至大腸桿菌BL21 (D3)，轉(zhuǎn)化得到S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌；所述L-DDRC的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示、L-DZNR的核苷酸序列為SEQ ID NO: 2所示、L-DHDR的核苷酸序列為SEQ ID NO: 3所示，L-THDR的核苷酸序列為SEQ ID NO:4所示。
2.—種權(quán)利要求1所述S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌在制備S-雌馬酚中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為:以大豆素或豆柏為底物，將S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的種子液以體積濃度5%的接種量接種至BHI培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基，在好氧或厭氧條件下，37°C培養(yǎng)24h，向培養(yǎng)液中加入終濃度25mg/L的IPTG，37°C繼續(xù)培養(yǎng)6~72h后，取培養(yǎng)液分離純化，獲得S-雌馬酚；所述BHI培養(yǎng)基終濃度組成為:蛋白胨10g/L、脫水小牛腦浸粉12.5g/L、脫水牛心浸粉5.0g/L、氯化鈉5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氫二鈉2.5g/L，溶劑為水，pH值為7.0 ;所述LB培養(yǎng)基終濃度組成:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化鈉10g/L，溶劑為水，pH值為7.0。
3.如權(quán)利要求2所述S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌在制備S-雌馬酚中的應(yīng)用，其特征在于所述大豆素的初始濃度為50 μ g/mlo
4.如權(quán)利要求2所述S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌在制備S-雌馬酚中的應(yīng)用，其特征在于所述豆柏的初始濃度為15g/L。
5.如權(quán)利要求2所述S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌在制備S-雌馬酚中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用按如下步驟進(jìn)行:(I)種子培養(yǎng):將S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌接種至含有終濃度50 μ g/ml羧芐青霉素和終濃度50μ g/ml鏈霉素的BHI培養(yǎng)基中，37 °C靜置，厭氧培養(yǎng)24h后，獲得種子液；(2)發(fā)酵培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化反應(yīng):將大豆素或豆柏加入BHI培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基，然后以體積濃度5%的接種量接種種子液，在好氧或厭氧條件下，37°C培養(yǎng)24h，向培養(yǎng)液中加入終濃度25mg/L的IPTG，37°C繼續(xù)培養(yǎng)6~72h后，取培養(yǎng)液分離純化，獲得S-雌馬酚；所述大豆素的初始濃度為50 μ g/ml，所述豆柏的初始濃度為15g/L。
6.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述培養(yǎng)液分離純化的方法為:取Iml的培養(yǎng)液，8000r/min離心3分鐘，獲得上清a ;取900 μ I上清a至另一干凈的2ml EP管中，然后向管中加入900 μ I乙酸乙酯,充分混勻后靜置5min,5000r/min離心5分鐘,獲得上清b和沉淀b ;取900 μ I上清b至另一干凈的2ml EP管中；取沉淀b加入等量的乙酸乙酯重復(fù)離心I次，獲得上清c ;將上清b和上清c混合在一起，移到2ml離心管中，45°C真空冷凍濃縮成粉末；加入200 μ I無(wú)水甲醇到該EP管溶解濃縮粉末，并經(jīng)0.22 μ m聚偏氟乙稀微孔濾膜過(guò)濾，濾液即為S-雌馬酚。
【文檔編號(hào)】C12P17/06GK104031875SQ201410243148
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】尹業(yè)師, 王欣 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院