水牛產(chǎn)奶性狀mc4r基因的克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了水牛產(chǎn)奶性狀MC4R基因的克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。特征是克隆得到的序列如SEQ?ID?NO：1所示，檢測到3個(gè)影響水牛產(chǎn)奶性狀的堿基突變，分別是第226bp處的C226-T226、1104bp處的C1104-T1104和1525bp處的A1525-G1525。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明公開了水?；騇C4R序列、影響水牛產(chǎn)奶性狀的3個(gè)堿基突變位點(diǎn)和獲得上述基因的獲取方法及其應(yīng)用，為水牛產(chǎn)奶性狀標(biāo)記輔助選擇提供了新的分子標(biāo)記。
【專利說明】水牛產(chǎn)奶性狀MC4R基因的克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及水牛產(chǎn)奶性狀MC4R基因的克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水牛是我國南方特有的種畜資源，而較低的產(chǎn)奶量和繁殖性能已成為了影響其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的兩大科學(xué)問題。顯然，利用先進(jìn)的分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于優(yōu)良奶水牛種質(zhì)資源的選育將會(huì)有效的提聞選種效率。
[0003]產(chǎn)奶性狀是奶水牛的一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀，由多種微效基因決定，是一種典型的由多基因控制的數(shù)量性狀。克隆奶水牛泌乳性能相關(guān)基因并探討其遺傳特性，以提高奶水牛生產(chǎn)性能，為選育具有高產(chǎn)奶量的優(yōu)良的奶水牛品種提供技術(shù)支撐和奠定理論基礎(chǔ)。
[0004]黑素皮質(zhì)素受體(Melanoeortin Receptors, MCRs)家族是目前所知的最小的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor, GPCR)亞家族，它們均屬于A類7個(gè)跨膜α螺旋G蛋白受體，是一系列小基因的產(chǎn)物。到目前為止，共有5個(gè)黑素皮質(zhì)素受體基因(MC1R-MC5R)被克隆、鑒 定和定位，其中MC3R和MC4R在控制食欲和體重穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，且MC4R在動(dòng)物體重、采食量和能量穩(wěn)態(tài)的控制中具有重要作用，在人、豬和馬等哺乳動(dòng)物中主要影響機(jī)體脂肪、增重、采食等性狀(仇雪梅等，2002)。根據(jù)MC4R基因功能，該基因可作為影響水牛產(chǎn)奶性狀的候選基因，用于分子標(biāo)記的開發(fā)和利用，為建立分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
[0005]迄今為止，尚無有關(guān)水牛MC4R基因作為水牛產(chǎn)奶性狀的分子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于圍繞我國水牛品種產(chǎn)奶量較低的問題，提供水牛產(chǎn)奶性狀MC4R基因的克隆及作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。通過克隆獲得水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)基因MC4R，對該基因進(jìn)行多態(tài)性分析，為水牛的標(biāo)記輔助選擇提供分子標(biāo)記。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
[0008]1.水牛產(chǎn)奶性狀基因MC4R作為分子標(biāo)記，所述MC4R基因的核酸序列如SEQ IDNO:1所示。
[0009]2.SEQ ID NO:1第226bp處C226-T226的堿基突變，與水牛產(chǎn)奶量極顯著相關(guān)(ρ〈0.01)，第1104bp處的C1104-T1104和1525bp處的A1525-G1525堿基突變，與水牛產(chǎn)奶
量顯著相關(guān)(P〈0.05)。
[0010]3.本發(fā)明水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)基因MC4R獲取的具體步驟如下:
[0011](I)利用RNAiso試劑盒(Takara, Daliang, China)從成年的水牛脂肪組織中提取總RNA，并進(jìn)行質(zhì)控以及于_20°C保存。
[0012](2)根據(jù)已報(bào)道的牛MC4R基因序列(GenBank:FJ430565.1)，利用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件，經(jīng)Oligo軟件檢測，確定引物，并委托大連寶生物技術(shù)有限公司合成。其中用于擴(kuò)增所述基因的正反向引物的DNA序列如下所示:
[0013] 正向引物:
[0014]5 ‘-GCTCGACGGAGAAGAAGCAT-3，；
[0015]5 ‘-GGCCATGAGGAACATGTGGA-3，；
[0016]5 ‘-TTGCCCAGTCTCGGTGTATT-3’ ；
[0017]反向引物:
[0018]5 ^-CTGCCTCATCACCGTGTTCT-3?；
[0019]5 ‘-AGACTGGGCACTGTTTCACA-3，；
[0020]5 ‘-CAACTTCTGCACAGGAAGAATGA-3，；
[0021]并委托大連寶生物技術(shù)有限公司合成。
[0022]3.將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)產(chǎn)物大小判定結(jié)果；將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至PMD-18T，挑取陽性克隆委托深圳華大科技有限公司測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析獲取水牛MC4R基因核苷酸序列。
[0023]4.本發(fā)明水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)基因MC4R作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，具體步驟如下:
[0024](I)對待選育水牛進(jìn)行靜脈采取提取總DNA ;根據(jù)水牛家族系譜和產(chǎn)奶記錄，選取5頭高產(chǎn)水牛O 2000kg/泌乳期)和5頭低產(chǎn)水牛(< 1000kg/泌乳期)，用于下一步驟水牛MC4R基因SNP位點(diǎn)的篩選；
[0025](2)根據(jù)水牛MC4R基因序列，利用SEQ ID NO: 2~7所示的引物，對上述10頭水牛DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余樣品送至深圳華大科技有限公司測序。
[0026](3)利用DNAStar7.0Seqman生物信息分析軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對,獲取候選的SNP位點(diǎn)。
[0027](4)根據(jù)候選的SNP位點(diǎn)信息，針對剩余的水牛血液總DNA樣品委托廣州英濰捷基生物有限公司開展飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測基因分型試驗(yàn)，利用Typer4.0軟件檢測質(zhì)譜峰，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本位點(diǎn)基因型。根據(jù)SNP基因分型檢測結(jié)果與水牛產(chǎn)奶性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0029](I)本發(fā)明所述的分子標(biāo)記為水牛分子標(biāo)記輔助育種提供了新的分子標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了 MC4R基因有3個(gè)SNP位點(diǎn)與水牛的產(chǎn)奶量相關(guān)。
[0030](2)本發(fā)明采用了飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測法開展了水牛MC4R基因SNP分型檢測，該法具有檢測樣品高通量，快速和準(zhǔn)確等優(yōu)勢，為開展水牛分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的建立等研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是用水牛MC4R基因PCR反應(yīng)瓊脂糖電泳檢測圖。瓊脂糖凝膠電泳濃度為
1.5%。圖中，M是DL2000marker，l、2和3分別代表3個(gè)基因片段，其大小分別為894bp、592bp 和 38 Ibp ；
[0032]圖2是MC4R C226T位點(diǎn)飛行質(zhì)譜檢測結(jié)果圖。圖中，倒三角形CC為野生型，正方形TC為雜合子個(gè)體，尚未檢測到突變純合子個(gè)體。【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0034]實(shí)施例1
[0035]水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)基因MC4R的獲取
[0036]1、水?；蚪M總DNA的制備
[0037]采用血液基因組DNA提取試劑盒制備水牛基因組總DNA (天根，北京)，
[0038]具體操作步驟如下:
[0039](I)取全血500yL置于1.5mL離心管，加入等體積的細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻，12000rpm離心lmin，吸取上清，留下沉淀；加入等體積的細(xì)胞裂解液CL，重復(fù)此步驟一次；加入 4 μ L RNAase (100mg/mL),振蕩 15sec,室溫靜置 5min ；
[0040](2)加入20 μ L Proteinase K溶液，混勻，加入200 μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻，56°C放置lOmin，期間顛倒混勻數(shù)次，溶液應(yīng)變清亮；
[0041](3)加入200 μ L無水乙醇，充分顛倒混勻；此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀；
[0042](4)將上述所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12，OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0043](5)向吸附柱CB3中加入500 μ L緩沖液⑶，12，OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0044](6)向吸附柱CB3中加入600 μ L漂洗液PW，12，OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中
的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；重復(fù)此操作一次；
[0045](7)12，OOOrpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；
[0046](8)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200 μ L洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，12，OOOrpm離心2min，將溶液收集到離心管中；
[0047](9)存放于_20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0048]2、引物設(shè)計(jì)
[0049]以報(bào)道的牛MC4R基因序列(GenBank:FJ430565.1)為模板，利用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件，經(jīng)Olig0軟件檢測，確定用于擴(kuò)增水牛MC4R基因的正方向引物，并委托大連寶生物技術(shù)有限公司合成，其中用于擴(kuò)增所述基因的正反向引物的DNA序列如下所示:
[0050]正向引物:
[0051]5 ‘-GCTCGACGGAGAAGAAGCAT-3，；
[0052]5 ‘-GGCCATGAGGAACATGTGGA-3，；
[0053]5 ‘-TTGCCCAGTCTCGGTGTATT-3’ ；
[0054]反向引物:
[0055]5 ‘-CTGCCTCATCACCGTGTTCT-3，；
[0056]5 ‘-AGACTGGGCACTGTTTCACA-3，；
[0057]5 ‘-CAACTTCTGCACAGGAAGAATGA-3’ ；[0058]3、反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0059]利用RNAiso試劑盒(Takara, Daliang, China)從成年的水牛脂肪組織中提取總RNA,具體操作方法參照RNAiso試劑盒說明書進(jìn)行。
[0060]cDNA第一鏈的合成:反應(yīng)總體積為20 μ L，首先將總RNAl μ g與Oligo dT Primer(50 μ Μ)1 μ L, dNTP Mixture (IOmM each) I μ L 以及 RNase free dH208 yL混合一離心管中，于65°C保溫5min后,冰上迅速冷卻，接著將上述離心管短暫離心后加入5X PrimerScriptII Buffer4 μ L, RNase Inhibitor(40U/μ L)0.5 μ L, PrimerScript II RTase (200U/μ L)I μ L以及RNase free dH204.5 μ L,緩慢混勻，于42°C溫育60min后95°C滅活5min，冰上冷卻，之后置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0061 ] PCR反應(yīng):反應(yīng)總體積為20 μ L，其中水牛cDNA模板I μ L，IOX PCR Buffer112 μ L，dNTP MixturedOmM each) 2 μ L，Takara Ex Taq HS (5U/μ L) 0.5 μ L 以及 RNasefree dH2014.5μ L。反應(yīng)條件為:94°C /3min ；94°C /30sec,60°C /30sec,72°C /1-1.5min,30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0062]4、PCR產(chǎn)物的檢測、純化、克隆和測序
[0063]將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)產(chǎn)物大小判定結(jié)果，其擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖1所示；PCR產(chǎn)物的純 、克隆和測序等步驟均為常規(guī)方法。
[0064]5、DNA序列同源性檢索與鑒定
[0065]利用NCBI (http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站的 BLAST 工具對測序結(jié)果進(jìn)行分析，判定結(jié)果的真實(shí)性。以基因片段I為例，根據(jù)牛與水牛的親緣進(jìn)化關(guān)系，BLAST nr/nt比對結(jié)果顯示，查詢序列(基因片段I)與Bos Taurus MC4R基因mRNA序列具有高度同源性，比對值達(dá)98%。故，查詢序列(基因片段I)可鑒定為水牛的MC4R基因的部分序列。
[0066]實(shí)施例2
[0067]水牛MC4R基因分子標(biāo)記的篩選與檢測
[0068]1、水牛MC4R基因分子標(biāo)記的初篩
[0069]根據(jù)水牛家族系譜和產(chǎn)奶記錄，選取5頭高產(chǎn)水牛O 2000kg/泌乳期)和5頭低產(chǎn)水牛(≤1000kg/泌乳期)為分子標(biāo)記初篩對象；利用SEQ ID NO:2~7所示的引物序列對上述10頭水牛DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余樣品送至深圳華大科技有限公司測序；利用DNAStar7.0Seqman生物信息分析軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接和比對，初步篩選與水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)基因MC4R基因分子標(biāo)記(見表1)，共有13個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基突變，其中5個(gè)位于5’ UTR，外顯子I有5個(gè)，3’ UTR有3個(gè)。
[0070]表1水牛MC4R基因篩選SNP信息表
[0071]
【權(quán)利要求】
1.水牛產(chǎn)奶性狀MC4R基因作為分子標(biāo)記，其特征在于，所述MC4R基因的核酸序列如SEQ ID NO:1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述MC4R基因，其特征在于:SEQID NO:1第226bp處C226-T226的堿基突變，與水牛產(chǎn)奶量極顯著相關(guān)；第1104bp處的C1104-T1104和1525bp處的A1525-G1525堿基突變，與水牛產(chǎn)奶量顯著相關(guān)。
3.獲取權(quán)利要求1所述基因MC4R的獲取方法，其特征在于操作步驟如下: (1)利用購自于大連寶生物有限公司的RNAiso試劑盒從成年的水牛脂肪組織中提取總RNA，并進(jìn)行質(zhì)控以及于_80°C保存； (2)以牛MC4R基因序列為模板，其NCBI登錄號(hào)為:FJ430565.1，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，經(jīng)Oligo軟件檢測， 確定用于擴(kuò)增水牛MC4R基因的正反向引物，其序列如下所示: 正向引物:
5 ‘-GCTCGACGGAGAAGAAGCAT-3，；
5 ‘-GGCCATGAGGAACATGTGGA-3，；
5 ‘-TTGCCCAGTCTCGGTGTATT-3’ ； 反向引物:
5 ‘-CTGCCTCATCACCGTGTTCT-3’ ；
5 ‘-AGACTGGGCACTGTTTCACA-3’ ；
5 ‘-CAACTTCTGCACAGGAAGAATGA-3’ ； 并委托大連寶生物技術(shù)有限公司合成； (3)反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng):cDNA第一鏈的合成:反應(yīng)總體積為20μ L，首先將總RNAl μ g與50 μ M的Oligo dT Primerl μ L, each I OmM 的 dNTP Mixturel μ L 以及 RNase free dH208 μ L混合一離心管中，于65°C保溫5min后，冰上迅速冷卻，接著將上述離心管短暫離心后加A 5X PrimerScript II Buffer4 μ L,40U/μ L 的 RNase Inhibitor0.5 μ L,200U/μ L 的PrimerScript II RTasel μ L 以及 RNase free dH204.5 μ L,緩慢混勻，于 42°C溫育 60min后95°C滅活5min，冰上冷卻，之后置于_20°C保存?zhèn)溆茫? PCR反應(yīng):反應(yīng)總體積為20 μ L，其中水牛cDNA模板I μ L，IOX PCR Buffer 112 μ L，eachlOmM 的 dNTP Mixture2 μ L, 5U/ μ L 的 Takara Ex Taq HS0.5μ L 以及 RNase freedH2014.5 μ L，反應(yīng)條件為:94°C /3min ；94°C /30sec,60°C /30sec, 72°C /I ~1.5min, 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ； (4)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)產(chǎn)物大小判定結(jié)果；將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至PMD-18T，挑取陽性克隆委托深圳華大科技有限公司測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析獲取水牛MC4R基因核苷酸序列。
4.權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記在水牛分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用，其特征在于，操作步驟如下: (1)對397頭水牛進(jìn)行靜脈采血提取總DNA，對其進(jìn)行質(zhì)控，調(diào)整DNA終濃度在30~50ng/l.! L之間，于-20°C保存；根據(jù)水牛家族系譜和產(chǎn)奶記錄，選取5頭高產(chǎn)水牛，產(chǎn)奶量為305d大于或等于2000kg，以及5頭低產(chǎn)水牛，產(chǎn)奶量為305d小于或等于1000kg，用于下一步驟水牛MC4R基因SNP位點(diǎn)的篩選； (2)利用SEQID NO:2~7所示引物對上述10頭水牛DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余樣品委托深圳華大科技有限公司測序； (3)利用DNAStar7.0Seqman生物信息分析軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接和比對，獲取候選的SNP位點(diǎn)，其中有13個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基突變，5個(gè)位于5’ UTR,外顯子I有5個(gè)，3’ UTR有3個(gè)； (4)針對上一步驟中候選的SNP位點(diǎn)，利用SequenomMassARRAY技術(shù)對上述水牛群體DNA樣本進(jìn)行SNP分型檢測，根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本位點(diǎn)基因型； (5)利用SAS9.2軟件開展SNP基因分型檢測結(jié)果與水牛產(chǎn)奶量的相關(guān)性分析。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103923997SQ201410160033
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】龐春英, 鄧廷賢, 梁賢威, 楊炳壯, 劉滿清, 陳明棠, 黃健, 譚正準(zhǔn), 李輝 申請人:廣西壯族自治區(qū)水牛研究所