云杉矮槲寄生的pcr檢測引物及其應(yīng)用和pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一對基于ITS2片段的云杉矮槲寄生PCR快速檢測引物。屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。該引物包括如下基因序列：dwF3：5‘-ACAAACTCATTTTCCCA?CCACA-3’；dwR3：5‘-ACATTCAAGAAACCTGAC?ACCC-3’。本發(fā)明的引物具有檢測周期短、操作簡單、結(jié)果可靠及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地監(jiān)測和早期預(yù)警云杉矮槲寄生的侵染動(dòng)態(tài)，指導(dǎo)制定科學(xué)的病害管理策略，對及時(shí)采取有效措施防治云杉矮槲寄生害具有重要意義。
【專利說明】云杉矮槲寄生的PCR檢測引物及其應(yīng)用和PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物檢測用引物及其檢測測定方法，特別涉及一種對植物寄生進(jìn)行特異性檢測用引物及使用該引物的PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]天然云杉林在我國西部生態(tài)脆弱地區(qū)具有無可替代的生態(tài)價(jià)值，發(fā)揮著保持水土和涵養(yǎng)水源等重要生態(tài)功能，是我國西部乃至全國生態(tài)環(huán)境安全的重要保護(hù)屏障。近年來，我國天然云杉林遭受云杉矮槲寄生(Arceuthobium sichuanense)的嚴(yán)重危害,其中2003年青海省門源縣仙米林場因多年嚴(yán)重發(fā)生云杉矮槲寄生害，大片云杉被寄生致死，被迫砍伐1.1萬m3。到2007年，整個(gè)青海省的發(fā)生面積達(dá)到1.3萬hm2，僅仙米林區(qū)云杉矮槲寄生害的發(fā)生面積達(dá)到3867hm2，已經(jīng)成為我國云杉天然林毀滅性生物災(zāi)害之一，造成三江源地區(qū)云杉天然林和次生林的嚴(yán)重病害，在經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境上帶來巨大的損失。
[0003]云杉矮槲寄生是寄生在云杉上的多年生半寄生性種子植物，主要分布于我國四川、青海、西藏和甘肅等省(自治區(qū))，是我國的特有種。云杉矮槲寄生通過種子進(jìn)行傳播，種子萌發(fā)產(chǎn)生胚根進(jìn)行侵染。胚根侵入寄主枝條后，建立位于寄主組織內(nèi)部的內(nèi)寄生系統(tǒng)。內(nèi)寄生系統(tǒng)可以在寄主體內(nèi)擴(kuò)展，進(jìn)行系統(tǒng)侵染，并吸取寄主營養(yǎng)和水分，在合適的部位發(fā)育長出外部寄生芽。寄主云杉的表現(xiàn)癥狀為受侵染的枝條在云杉矮槲寄生的侵染點(diǎn)出現(xiàn)膨大叢枝。因此，診斷云杉是否受到云杉矮槲寄生侵染的主要依據(jù)是觀察云杉枝條是否出現(xiàn)叢枝和膨大或者寄主枝條上是否存在云杉矮槲寄生的寄生芽。然而，從云杉矮槲寄生成功侵入寄主到寄主表現(xiàn)出叢枝膨大、出現(xiàn)寄生芽整個(gè)潛育期長達(dá)5~8年。目前尚無云杉矮槲寄生害的早期診斷方 法，傳統(tǒng)的觀察方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于病害的發(fā)展過程，導(dǎo)致在實(shí)踐中不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)病害，從而錯(cuò)過云杉矮槲寄生防治的最佳時(shí)期，嚴(yán)重制約了該病害的有效預(yù)防與控制。
[0004]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及其應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)展，分子技術(shù)開始在病原物檢測中廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的檢測方法比較，不但節(jié)省了檢測時(shí)間、提高了工作效率，而且提高了檢測的靈敏度，檢測頻率在10_5~10_4，因此也被作為病害早期診斷的理想方法。其中核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)是真核生物核糖體RNA基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一部分，包括ITSl和ITS2兩個(gè)不同的非編碼區(qū)域。ITS區(qū)域的核苷酸序列具有極大的保守性，又在科、屬、種水平上具有特異性，目前被廣泛用于物種鑒定、種間系統(tǒng)發(fā)育的研究中。在植物病害的分子診斷中也已經(jīng)開發(fā)出大量的特異性PCR引物用于植物病原物的早期檢測和診斷。結(jié)果表明此種方法可以快速準(zhǔn)確檢測植物病原物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種云杉矮槲寄生的PCR檢測用引物及利用該引物進(jìn)行PCR檢測的方法，利用本發(fā)明所述引物及方法能夠更加快速、準(zhǔn)確、直接檢測出云杉矮槲寄生病害，能夠在云杉矮槲寄生侵入寄主云杉的早期進(jìn)行診斷，提前預(yù)防，為有效預(yù)防與控制云杉矮槲寄生病害提供科學(xué)依據(jù)。為治理云杉矮槲寄生病害的最佳防治時(shí)機(jī)的把握具有重要意義。
[0006]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明應(yīng)用PCR方法對云杉矮槲寄生的分子檢測方法進(jìn)行研究，通過基于對ITS2片段(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2)序列設(shè)計(jì)特異性引物，從而建立一種對云杉矮槲寄生穩(wěn)定、高效、準(zhǔn)確的檢測方法，本發(fā)明的檢測方法檢測成本低，可以根據(jù)對擴(kuò)增產(chǎn)物的普通瓊脂糖電泳判定是否有云杉矮槲寄生的存在。
[0007]DNA測序技術(shù)是目前物種鑒別研究中運(yùn)用最為廣泛的技術(shù)之一，而對油杉寄生屬植物的研究中主要集中在其系統(tǒng)發(fā)育分析方面，缺少對病害的前期診斷及其防治方面的研究。尤其是云杉矮槲寄生是我國的特有種，所造成的病害主要分布于我國四川、青海、西藏和甘肅等省(自治區(qū))。此外，其它寄生性植物寄生寄主主要表現(xiàn)在外部寄生，憑借觀察即可發(fā)現(xiàn)。而云杉矮槲寄生的特點(diǎn)在于建立位于寄主枝條內(nèi)部的內(nèi)寄生系統(tǒng)。當(dāng)云杉矮槲寄生侵染寄主后，單憑肉眼觀察難以發(fā)現(xiàn)其侵染跡象。
[0008]核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)包括ITSl和ITS2兩個(gè)不同的非編碼區(qū)域。由于ITS區(qū)具有高拷貝數(shù)，有利于低濃度或被高度降解的DNA樣品中ITS區(qū)域的擴(kuò)增；同時(shí)ITS區(qū)域的核苷酸序列既具有保守性，又在科、屬、種水平上具有特異性，通過對ITS區(qū)進(jìn)行PCR及測序后，再根據(jù)保守序列中的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特殊引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增比較，用來診斷和檢測植物病原菌，尤其是對植物 病原真菌的分子檢測已越來越被廣泛應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明一方面提供一種云杉矮槲寄生的PCR檢測引物，其能對云杉矮槲寄生中的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的ITS2非編碼區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，生成云杉矮槲寄生特異性擴(kuò)增片段。
[0010]其中，所述云杉矮槲寄生的PCR檢測引物的正向引物核苷酸序列為SEQ ID N0.1 ；反向引物核苷酸序列為SEQ ID N0.2。
[0011]特別是，SEQID N0.1 的核苷酸序列為 5 ‘-ACAAACTCATTTTCCCACCA CA_3’;SEQ IDN0.2 的核苷酸序列為 5 ‘-ACATTCAAGAAACCTGACACCC-3’。
[0012]本發(fā)明通過分析云杉矮槲寄生的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，能夠快速、準(zhǔn)確地對云杉矮槲寄生進(jìn)行定性檢測，最低檢測限可達(dá)到0.0332ng級，檢測結(jié)果可靠。本發(fā)明的引物可以通過利用本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知的化學(xué)合成方法進(jìn)行的DNA合成技術(shù)得到。本發(fā)明人在對相應(yīng)的植物的ITS2序列進(jìn)行測定和比較的基礎(chǔ)上，根據(jù)云杉矮槲寄生ITS2序列上的特異堿基位點(diǎn)設(shè)計(jì)了引物，因此僅對云杉矮槲寄生有擴(kuò)增信號，而對其寄主材料沒有目的擴(kuò)增信號。
[0013]本發(fā)明另一方面提供一種云杉矮槲寄生PCR檢測方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟:
[0014]I)提取待測樣品中的DNA ；
[0015]2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0016]3 )分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0017]其中，步驟2)中所述PCR擴(kuò)增過程中，PCR反應(yīng)體系以50-μ I計(jì)為:
[0018]
IOxEasyTaqDNA 反應(yīng)緩沖液5 μL
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種云杉矮槲寄生的PCR檢測引物，其特征是能對云杉矮槲寄生中的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的ITS2非編碼區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，生成云杉矮槲寄生特異性擴(kuò)增片段。
2.如權(quán)利要求1所述的PCR檢測引物，其特征是所述云杉矮槲寄生的PCR檢測引物的正向引物核苷酸序列為SEQ ID N0.1 ;反向引物核苷酸序列為SEQ ID N0.2。
3.—種云杉矮槲寄生PCR檢測方法，其特征是，包括如下順序進(jìn)行的步驟: 1)提取待測樣品中的DNA; 2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求1所述的PCR檢測方法，其特征是步驟2)中所述PCR擴(kuò)增過程中，PCR反應(yīng)體系以50-μ I計(jì)為:
5.一種如權(quán)利要求1或2所述的PCR檢測引物在檢測云杉矮槲寄生中的應(yīng)用。
6.一種用于檢測云杉矮槲寄生的試劑盒，其特征是，所述試劑盒包括引物SEQ ID N0.1和 SEQ ID N0.2。
【文檔編號】C12N15/11GK103923995SQ201410153628
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】陳磊, 田呈明, 白云, 王永林 申請人:北京林業(yè)大學(xué)