一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒及其制備和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測的引物、試劑盒及其制備與檢測方法，該試劑盒包括特異引物，采用步驟簡單的PCR擴增方法，通過對樣品進行無創(chuàng)采集制作，減輕病人在檢測過程中的痛苦。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡單、快速、靈敏的無創(chuàng)幽門螺桿菌的檢測試劑盒及制備與檢測方法，該方法步驟簡單，是靈敏檢測幽門螺桿菌的試劑盒，避免了使用胃鏡等有創(chuàng)取樣，一方面能降低病人檢測中的痛苦，另一方面大大降低了時間、人力物力成本。
【專利說明】一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒及其制備和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測的引物、試劑盒及其制備和檢測方法，具體設(shè)計一種引物，配置成一個試劑盒，提供一種無創(chuàng)、簡單、快速、靈敏的幽門螺桿菌基因檢測的試劑盒及檢測方法，為檢測人和動物幽門螺桿菌感染提供方法和試劑。
【背景技術(shù)】[0002]1983年幽門螺旋桿菌{Helicobacter pylori簡稱Hp)被澳大利亞的Warren和Warshail發(fā)現(xiàn)，已被確認為最常見的慢性感染性疾病的病原之一?，F(xiàn)階段臨床檢測Hp主要分為侵入性和非侵入性兩大類，侵入性檢測一般為胃鏡檢測和血清抗體檢測；非侵入性檢測為同位素C標記呼吸實驗和糞幽門螺桿菌抗原檢測。這些檢測方法雖為臨床常規(guī)檢測方法，但上述方法都不定量，同時檢測不方便，更重要的是因敏感性不高，檢測結(jié)果不能及時反映幽門螺桿菌的感染狀況。另外，這些檢測需要采血或下胃鏡取胃組織，或口服放射性標記物，對人體或環(huán)境有一定的傷害。多聚酶鏈式式反應(yīng)(PCR)技術(shù)的出現(xiàn)，大大提高了檢測的靈敏度和準確性，理論上，只要樣本中有I個被檢物質(zhì)的基因，就可以用PCR檢測方法檢測出來。PCR方法是分子診斷的一種典型的診斷方法，其具有檢測靈敏度高，取材方便，檢測高通量等優(yōu)點。大量研究顯示。幽門螺桿菌進入和排出人或動物體的唯一途徑是糞-口，因此在疑似幽門螺桿菌感染者的糞便樣本和口腔樣本中一定含有幽門螺桿菌核酸分子，用特異的PCR引物，通過適當?shù)脑噭┡渲疲梢杂肞CR技術(shù)無創(chuàng)傷的從唾液或糞便樣本中快速檢測幽門螺桿菌的感染，這種新型的檢測方法對診斷幽門螺桿菌有著非常重要的意義。
[0003]目前，已有的Hp檢測方法通常為侵入性的，如組織切片染色檢查是取胃粘膜標本切片或者涂片染色鏡檢查Hp，再如組織切片免疫組織化學染色檢查是將組織切面的免疫組織化學染色對Hp進行檢測，且一般不能作為常規(guī)的診斷手段，這些檢測的介質(zhì)都需要經(jīng)過復(fù)雜的采集制作過程，比如為提取DNA需要裂解液而對人的胃造成一定的損傷，這樣就會對人力物力和檢測時間都不具有成本節(jié)約性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明克服了臨床現(xiàn)有幽門螺桿菌檢測技術(shù)的不足，提供一種無創(chuàng)、簡單、快速、靈敏的幽門螺桿菌基因檢測引物及試劑盒制備和檢測方法。該試劑盒制備方法和操作步驟簡單，采用唾液或糞便為檢測樣本，無需特殊處理，可快速、定性和定量檢測幽門螺桿菌的感染狀況。取唾液或糞便樣本無創(chuàng)、方便；用特異引物PCR擴增靈敏度高，特異性好；用特殊的反應(yīng)條件，無需繁雜的操作過程，降低病人檢測中的痛苦，提高了檢測的靈敏度和特異性，。
[0005]為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
設(shè)計篩選了一種特異地用于無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測的引物，所述引物為5’-TTGGGATAGCCATTGGAAACG _3’
3’- GTTCCGATACTGCCCATAGGC -5’ 。[0006]建立了該引物的擴增方法，包括以下兩個步驟:
a、熔鏈:在92-96°C下進行8_10s；
b、退火延伸:在56-66°C下進行25-30S，退火延伸是在同一個溫度條件下進行的，因此不需要將熔煉后的產(chǎn)物經(jīng)過2次降溫，而直接將產(chǎn)物降溫到延伸時需要的溫度，省去了一次降溫步驟，而節(jié)約了操作工序和操作時間，同時節(jié)約了成本；
該兩個步驟按順序循環(huán)30cycle。
[0007]退火溫度為62°C。
[0008]一種用于無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測的試劑盒，包括所述的引物(Rl)，還包括R2試劑、R3試劑，所述R2試劑為PCR Taq酶預(yù)混合液(如=TAKARA的SYBR Green Taq MIX等)，所述R3試劑為無菌蒸餾水。
[0009]該無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測的試劑盒配置和操作包括以下步驟:
(O無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒配制:引物Rl用無菌蒸餾水稀釋到終濃度8-10 μ M，SYBR Green Taq MIX為R2試劑；滅菌的蒸餾水作為R3試劑)。將所述試劑組分別包裝或預(yù)混合包裝，如PCR擴增管分別預(yù)裝Rl或R2或R3，配置成試劑盒，又如PCR擴增管預(yù)裝Rl、R2和R3的混合物。
[0010](2)PCR模板:可取糞便樣品或口腔樣本，水煮沸離心后即可作檢樣獲得(模板)；
(3)試劑盒操作:將一定量的PCR模板(糞或唾液樣品)加入預(yù)裝有試劑的PCR擴增管中，按操作參數(shù)設(shè)置，在PCR擴增儀上反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物；
(4)檢測:
Ca)定性PCR檢測:可以在普通PCR儀上擴增，取擴增產(chǎn)物在3%的瓊脂糖膠中進行電泳，凝膠成像觀察結(jié)果；
(b)定量PCR檢測:可以在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，根據(jù)達到熒光閾值的循環(huán)數(shù)，確定模板中幽門螺桿菌的數(shù)量。
[0011]所述試劑組分的體積分別為:R1試劑0.3-0.6份，R2試劑為8_12份，R3試劑為6-9份，PCR模板為1-3份。在此比例范圍內(nèi)，反應(yīng)得到135bp的擴增產(chǎn)物。
[0012]所述糞便樣品處理:取10-50g的糞便溶解到無菌水中混勻，然后利用梯度離心法去除糞便中的雜質(zhì)獲得上層清液，再將上層清液用離心法獲得菌沉淀，再用無菌水將菌沉淀溶解獲得菌溶液，取菌溶液作為PCR模板。
[0013]所述口腔樣本的處理為用無菌棉簽在被檢對象的口腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)蘸取舌胎至咽喉處的口腔粘液，用無菌水溶解粘液得菌溶液，取菌溶液作為PCR模板。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
(I)本發(fā)明以幽門螺桿菌的16s rRNA作為靶序列，得到的引物位于編碼區(qū)5’端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，擴增產(chǎn)物在100-200bp之間，引物的堿基隨機分布、均勻，此引物自身在優(yōu)化的條件下不能形成二聚體，引物長度在17-25堿基之間，上下游引物不能相差3個堿基，G+C含量45-55%，引物不在AT、GC豐富的區(qū)域，不存在T/C，A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)(2_3個)，同時引物3'端不在密碼子的第3位上，并且16s rRNA為幽門螺桿菌屬的保守序列，可以檢測特異的幽門螺桿菌屬，擴大了檢測范圍。
[0015](2)本發(fā)明得到的135bp的引物擴增產(chǎn)物，在此片段的引物擴增產(chǎn)物的靈敏度特別高，檢測靈敏度高達102CFU/ml。[0016](3)本發(fā)明采用唾液或糞便作檢測樣本，制備PCR模板，無創(chuàng)、簡單、快捷。特別是唾液作為無需提取DNA，而是直接擴增樣本，避免了胃鏡等有創(chuàng)采樣方法，因而能減少取樣難度和取樣痛苦，并且能節(jié)約檢測時間和檢測成本。
[0017](4)檢測液體積比例的控，利于擴增產(chǎn)物的生成，能有效提高檢測靈敏度；
(5)本發(fā)明設(shè)計篩選的引物，將退火和延伸合并為一步，步驟簡單，操作便捷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1大腸桿菌和檸檬酸桿菌按同等條件下熒光PCR擴增結(jié)果；
圖2引物在不同溫度下的PCR圖；
圖3最佳退火溫度下的PCR擴增曲線圖；
圖4為熒光定量PCR檢測的標準曲線圖。
【具體實施方式】 [0019]下面根據(jù)具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述。
[0020]但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實施例。
[0021]實施例用到的試劑:
菌株:幽門螺桿菌悉尼株pylori SSl(簡稱Hp),購自于河北醫(yī)科大學，來源于中國疾病預(yù)防控制中心流行病學研究所。
[0022]Sybr Green MIX: ( CW0078, CffBio)
臨床樣本:感染幽門螺桿菌的小鼠和SPF的小鼠胃，糞，口腔樣本:(批號201306，自
制)
大腸桿菌、檸檬酸桿菌:(批號20130522，自制)
無菌ddH20:(批號201305,自制)
Marker:(批號D503A,寶生物)
瓊脂糖:(Bio-west)
IXTAE: (20121124，自制)
組織DNA提取試劑盒:(批號D5934A，Omega)
Premix Taq:(批號 D332, TAKARA)
主要的設(shè)備
電泳儀(電泳槽):(PAC-300，Bio-Rad)，凝膠成像系統(tǒng):(170818，Bio-Rad)
移液器:(KA0015335，成都溶海生物公司)，普通PCR儀:(TC9600-G-230V，Iabnet)
熒光定量 PCR 管:(009701，Bio-Rad)，熒光定量 PCR 儀:(CFX, Bio-Rad)
實施例1引物的設(shè)計和特異性測試 以幽門螺桿菌的16s RNA作為靶序列，設(shè)計引物如下:
引物為 5’- TTGGGATAGCCATTGGAAACG -3’
3’- GTTCCGATACTGCCCATAGGC -5’ ；
以菌株----幽門螺桿菌悉尼株SSl (簡稱Hp)(購自于河北醫(yī)
科大學，來源于中國疾病預(yù)防控制中心流行病學研究所)的16s RNA作為靶序列，得到的引物位于編碼區(qū)5’端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，擴增產(chǎn)物在100-200bp之間，引物的堿基隨機分布、均勻，此引物自身不能形成二聚體，引物長度在17-25堿基之間，上下游引物不能相差3個堿基，G+C含量45-55%，引物不在AT、GC豐富的區(qū)域，不存在T/C，A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)(2_3個)，同時引物3'端不在密碼子的第3位上，并且16s RNA為幽門螺桿菌屬的保守序列，可以檢測出所有的幽門螺桿菌，擴大了檢測范圍，同時引物特異性好，靈敏度高。
[0023]PCR引物特異性的檢測:按照上述確定的反應(yīng)體系和程序，對大腸桿菌(20130522,自制)和檸檬酸桿菌(20130522，自制)進行熒光定量PCR擴增實驗，其他市場流通的大腸桿菌和檸檬酸桿菌均能進行熒光定量PCR擴增實驗，結(jié)果如圖1。
[0024]通過圖1的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和檸檬酸桿菌在上述PCR條件下擴增，無擴增曲線，說明引物的特異性好，與其它腸道細菌無交叉反應(yīng)。
[0025]實施例2引物的擴增反應(yīng)
上述引物 5’- TTGGGATAGCCATTGGAAACG -3’
3’- GTTCCGATACTGCCCATAGGC -5’ 的 PCR 擴增反應(yīng)為:
在90-98°C下將引物熔鏈8-10s ;然后降溫到56-66°C退火延伸25_30s ；
兩步驟循環(huán)30cycle?，F(xiàn)有的工藝是將溫度降低到55°C左右退火處理一段時間，再升溫到72°C左右延伸，而本發(fā)明的退火延伸是一個步驟，因為本發(fā)明采取的退火延伸是在同一個溫度條件下進行的，因此不需要將熔煉后的產(chǎn)物經(jīng)過2次降溫，而直接將產(chǎn)物降溫到延伸時需要的溫度得到引物擴增片段，與現(xiàn)有引物的PCR擴增反應(yīng)相比，省去了一次降溫步驟，而節(jié)約了操作工序和操作時間，進而節(jié)約了成本。
[0026]引物退火溫度可選擇56、58、60、62、64、66°C,最佳退火溫度為62°C。
[0027]引物退火溫度的確定:分別設(shè)置56、58、60、62、64、66<€退火,米用同樣的程序份反應(yīng)物在普通PCR儀進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后在3%的瓊脂糖膠中進行電泳，120V, 30min,凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果如圖2。從圖上可以看到在引物退火溫度為62°C時檢測最為明顯、效果最佳。最佳退火溫度下的PCR擴增曲線參見圖3。
[0028]實施例3 —種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒
一種無創(chuàng)核酸檢測幽門螺桿菌的試劑盒包括Rl試劑:引物5’ -TTGGGATAGCCATTGGAAACG -3’
3’- GTTCCGATACTGCCCATAGGC -5’ ，
R2 試劑:SYBR Green Taq MIX( CW0078, CWBio)，其他的 PCR Taq 酶預(yù)混合液也可以；R3試劑:為無菌蒸餾水(201305，自制)。
[0029]實施例4糞便樣品和口腔中幽門螺桿菌的無創(chuàng)檢測方法
1、試劑盒配置:
無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒配制:引物Rl用無菌蒸餾水稀釋到終濃度8-10 μ Μ，SYBR Green Taq MIX為R2試劑；滅菌的蒸餾水作為R3試劑。將上述試劑組分別包裝或預(yù)混合包裝，如PCR擴增管分別預(yù)裝Rl或R2或R3，配置成試劑盒，又如PCR擴增管預(yù)裝R1、R2和R3的混合物。
[0030]2、糞便樣品及PCR反應(yīng)
取10-50g的確定感染幽門螺桿菌的糞便溶解到300μ I無菌水中混勻，然后利用梯度離心法先用800-1000r/min離心去除糞便中的雜質(zhì)獲得上層清液，再將上層清液用8000-10000r/min離心轉(zhuǎn)速離心獲得菌沉淀，再用300 μ I無菌水將菌沉淀溶解獲得菌溶液，取菌溶液作為PCR模板。
[0031]含R1、R2和R3混合物預(yù)包裝或者分別預(yù)包裝的PCR反應(yīng)管配置成試劑盒，按試劑盒操作加樣，將PCR模板加入預(yù)裝有試劑的PCR擴增管中，試劑組分的體積分別為:R1試劑
0.3-0.6份，R2試劑為8-12份，R3試劑為6_9份，PCR模板為1_3份。在此比例范圍內(nèi)，反應(yīng)得到135bp的擴增產(chǎn)物。
[0032]在92_96°C下進行8-10s的熔鏈；然后在56_66°C下進行25_30s的退火延伸，得到的135bp的擴增產(chǎn)物通過PCR方法定性檢測(在普通PCR儀上進行擴增反應(yīng))、定量PCR檢測(突光PCR儀上進行擴增反應(yīng))得到結(jié)果。
[0033]3、口腔樣本及PCR反應(yīng)
用無菌棉簽在確定感染幽門螺桿菌的小鼠的口腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)蘸取舌胎至咽喉處的口腔粘液，用100 μ I無菌生理鹽水溶解粘液得菌溶液，取菌溶液作為PCR模板。
[0034]含R1、R2和R3混合物預(yù)包裝或者分別預(yù)包裝的PCR反應(yīng)管配置成試劑盒，按試劑盒操作加樣，將PCR模板加入預(yù)裝有試劑的PCR擴增管中。試劑組分的體積分別為:R1試劑0.3-0.6份，R2試劑為8-12份，R3試劑為6_9份，PCR模板為1_3份。在此比例范圍內(nèi)，反應(yīng)得到135bp的擴增產(chǎn)物。
[0035]按試劑盒操作加樣，在92_96°C下進行8-lOs的熔鏈；然后在56_66 °C下進行25-30s的退火延伸，得到的135bp的擴增產(chǎn)物通過PCR方法定量檢測得到結(jié)果，通過定性PCR檢測(在普通PCR儀上進行擴增反應(yīng))、定量PCR檢測(熒光PCR儀上進行擴增反應(yīng))得到結(jié)果。
[0036]口腔、糞便的定性PCR檢測、定量PCR檢測和胃組織PCR、胃組織快速尿酶檢測的比較對確定Hp感染和未知感染小鼠的糞便、口腔樣本和已幽門螺桿菌感染病人的口腔樣本進行PCR檢測和采用同批次已知Hp感染、非感染小鼠以及已幽門螺桿菌感染病人的胃組織PCR、胃組織快速尿酶檢測，以已知Hp感染的小鼠作為陽性參照物，無感染的SPF小鼠為陰性參照物。
[0037]按照上述糞便樣品處理和口腔樣本的處理方法對檢測樣品進行處理，此樣本來源于幽門螺桿菌感染的實驗小鼠口腔(批號201306，自制)和糞便(批號201306，自制)，根據(jù)對小鼠的胃組織DNA進行定性PCR檢測，確定了小鼠是否感染幽門螺桿菌；已幽門螺桿菌感染病人的口腔樣本來自于華西消化內(nèi)科的幽門螺桿菌感染病人口腔黏膜。
[0038]定性PCR檢測比較結(jié)果經(jīng)過對上述樣本的糞便、口腔定性PCR檢測和同批次已知感染或非感染個體的胃組織作定性PCR檢測，具體結(jié)果比較如下。
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒的引物，其特征在于:所述引物為5’-TTGGGATAGCCATTGGAAACG _3’
3’- GTTCCGATACTGCCCATAGGC -5’ 。
2.權(quán)利要求1所述的引物的擴增方法，其特征在于:該方法包括以下步驟 熔鏈:在92-96°C下進行8-10s ； 退火延伸:在54-66°C下進行25-30S，退火延伸是在同樣的溫度下進行； 該兩個步驟按順序循環(huán)30cycle。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物的擴增方法，其特征在于:所述退火溫度為62°C。
4.一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒，其特征在于:包括權(quán)利要求1所述的引物R1，還包括R2試劑、R3試劑，所述R2試劑為SYBR Green Taq MIX,所述R3試劑為無菌蒸餾水。
5.一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于:該檢測方法采用權(quán)利要求4所述的無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒，包括以下步驟: (O無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒配置:將引物Rl用無菌蒸餾水稀釋到終濃度8-10 μ Μ,再將稀釋后的Rl試劑、R2試劑，R3試劑分別包裝或預(yù)混合包裝得PCR擴增管，制得試劑盒； (2)PCR模板制備:將糞便樣品處理或口腔樣本處理后制得PCR模板； (3)試劑盒操作:將PCR模板加入預(yù)裝有試劑的PCR擴增管中，在PCR擴增儀上如權(quán)利要求2或3所述的引物擴增方法進行反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物； (4)檢測:(a)定性PCR檢測:在普通PCR儀上擴增，取擴增產(chǎn)物在3%的瓊脂糖膠中進行電泳，凝膠成像觀察結(jié)果； (b)定量PCR檢測:在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，根據(jù)達到熒光閾值的循環(huán)數(shù)，確定模板中幽門螺桿菌的數(shù)量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于:所述糞便樣品處理:取10_50g的糞便溶解到無菌水中混勻，然后利用梯度離心法去除糞便中的雜質(zhì)獲得上層清液，再將上層清液用離心法獲得菌沉淀，再用無菌水將菌沉淀溶解獲得菌溶液，取菌溶液作為PCR模板。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于:所述口腔樣本的處理為 用無菌棉簽在口腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)蘸取舌胎至咽喉處的口腔粘液，用無菌水溶解粘液得菌溶液，取菌溶液作為PCR模板。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種無創(chuàng)幽門螺桿菌基因檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于:引物、Rl試劑、R2試劑和PCR模板體積為:R1試劑為0.3-0.6份，R2試劑為8-12份，R3試劑為6-9份，PCR模板為1-3份。
【文檔編號】C12N15/11GK103834741SQ201410101308
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】祝潔, 張勇 申請人:四川萬可泰生物技術(shù)有限責任公司