專利名稱：子宮內(nèi)膜癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種子宮內(nèi)膜癌易感基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結(jié)果從基因?qū)用嬖u估女性子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的風(fēng)險級別，并作為針對性預(yù)防和治療的指導(dǎo)依據(jù)。
背景技術(shù)：
近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈上升趨勢，成為繼乳腺癌和卵巢癌之后威脅女性健康的婦科腫瘤。多數(shù)流行病學(xué)研究顯示子宮內(nèi)膜癌的危險因素都與雌激素有關(guān)，雌激素水平升高導(dǎo)致的內(nèi)膜增生及DNA損傷被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的主要機(jī)制。已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報道，細(xì)胞色素P450酶(CYP1A1，CYP1B1，CYP17等)在雌激素的代謝過程中起重要作用。雌激素代謝過程中有兩條主要的競爭性代謝途徑生成代謝中間產(chǎn)物兒茶酚雌激素一條代謝生成低活性的2-羥基雌二醇Q-OH2)；另一條生成具有活性的4-羥基雌二醇 (4-0HE2)。CYPlAl是人體肝外將雌激素進(jìn)行2-羥基化代謝的主要I相代謝酶之一。另外， CYPlAl還具有芳香烴羥基化活性，能催化多環(huán)芳烴等多種致癌物氧化，生成具有強(qiáng)致癌活性的親電子環(huán)氧化物。因此，CYPlAl活性的差異可能會影響雌激素的代謝，與個體易感性有關(guān)。4-0冊2主要是由CYPlBlWh代謝而來，為兒茶酚代謝物，具有基因毒效應(yīng)。其致癌效應(yīng)在雌激素誘發(fā)癌變作用中占主導(dǎo)地位。CYP17基因與雌激素的合成也密切相關(guān)，其5’啟動子區(qū)的翻譯起始點(diǎn)上游的第34 個堿基處存在著一個T-C (等位基因Al-等位基因A2)的多態(tài)位點(diǎn)，當(dāng)?shù)任换駻2存在時可導(dǎo)致雌激素水平改變，增加子宮內(nèi)膜癌易感性?；蚨鄳B(tài)性的存在，并不直接造成細(xì)胞的癌變及腫瘤的發(fā)生，可能會賦予個體對某種特殊的環(huán)境因素易感?；蚺c環(huán)境暴露因素之間可能存在相互影響，研究基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的相互作用，對個體腫瘤易感性的評價會更全面，更具有生物合理性。因此，建立簡單、快速的女性子宮內(nèi)膜癌易感風(fēng)險級別的檢測方法，能夠檢測出女性在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生相關(guān)的基因單核苷酸位點(diǎn)基因型，及時篩查出子宮內(nèi)膜癌易感基因的女性高危人群，從而有針對性的預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜癌，這對于降低女性子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于CYPlAl 基因的 MspI、CYPlBl 基因的 Leu432Val，CYP17 基因的 MspAl I 的 3 個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可用來評估女性子宮內(nèi)膜癌發(fā)生風(fēng)險的生物學(xué)功能基礎(chǔ)上， 本發(fā)明提供一種女性子宮內(nèi)膜癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYPlAl 基因的 MspI、CYPlBl 基因的 Leu432Val, CYP17 基因的 MspAl I 的 3 個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)；
PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA測序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應(yīng)體系10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特異性引物對(每條引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產(chǎn)物純化體系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·測序反應(yīng)體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1.檢測試劑盒的使用1、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(I)CYPlAl (MspI)正向引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3 ‘CYPlAl (MspI)反向引物5' AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3 ‘( CYPlBl (Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘CYPlBl (Leu432Val)反向引物5' AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3 ‘(3)CYP17(MspAl I)正向引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'CYP17 (MspAl I)反向引物5 ‘ AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3 ‘PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq 酶 0. 125 μ 1、DNA 模板 1 μ 1 (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反應(yīng)條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C 1分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。
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4、DNA測序反應(yīng)使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測序引物(I)CYPlAl (MspI)測序引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3 ‘( CYPlBl (Leu432Val)測序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘(3)CYP17(MspAl I)測序引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 測序引物lul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個循環(huán)的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min離心15min，輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.對人們進(jìn)行預(yù)防子宮內(nèi)膜癌易感基因無創(chuàng)檢測的服務(wù)1.采樣及抽提DNA由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的CYPlAl基因的MspI、CYPlBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I的3個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA測序，確定這3個SNPs位點(diǎn)的基因型。3.子宮內(nèi)膜癌女性高危人群風(fēng)險評估通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險評估分析報告單。報告中詳細(xì)說明了受檢者CYPlAl基因的Mspl、CYPlBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I 基因上SNP位點(diǎn)基因檢測信息以及遺傳風(fēng)險評估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險級別， 并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明和解讀子宮內(nèi)膜癌易感基因無創(chuàng)檢測報告單。
權(quán)利要求
1.一種檢測子宮內(nèi)膜癌易感基因的無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于檢測CYPlAl基因的 MspI,CYPIBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I的3個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對CYPlAl 基因的MspI、CYPIB1基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I的3個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)， 能特異性擴(kuò)增出包含這3個SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對CYPlAl基因的MspI、CYPlBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAlI的3個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)而設(shè)計，能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出上述3個SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下(1)CYPlAl(MspI)正向引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3 ‘CYPlAl (MspI)反向引物5 ‘ AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3 ‘(2)CYPlBl(Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3‘CYPlBl (Leu432Val)反向引物5 ‘ AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3 ‘(3)CYP17 (MspAl I)正向引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'CYP17 (MspAl I)反向引物5 ‘ AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3 ‘
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下(1)CYPlAl(MspI)測序引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3 ‘(2)CYPlBl(Leu432Val)測序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3‘(3)CYP17 (MspA 1 I)測序引物5 ‘ CCCATACGAACCGAATAGA 3 ‘
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)PCR反應(yīng)體系10XPCR反應(yīng)緩沖液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產(chǎn)物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應(yīng)體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測子宮內(nèi)膜癌的易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP1A1基因的MspI、CYP1B1基因的Leu432Val，CYP17基因的MspA1 I的3個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生密切相關(guān)的3個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來評估受檢者子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的風(fēng)險級別，指導(dǎo)女性有針對性的預(yù)防子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細(xì)胞采樣，無痛、無創(chuàng)、避免了交叉感染。測序檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，不必購置價格昂貴的進(jìn)口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102559903SQ20121002199
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月1日
發(fā)明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司