水稻耐冷主效基因鑒定方法及其專用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻苗期耐冷主效基因及其專用引物。該專用引物的水稻耐冷主效基因鑒定方法，是以待檢測水稻基因組DNA為模板，用標記引物RM15040、標記引物ZCT13、標記引物ZCT23、標記引物RM15123中的任一種標記引物進行PCR擴增，然后對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳分析得到水稻耐冷性的鑒定，PCR擴增產(chǎn)物中有大小為140~170bp或230~270bp或290~310bp或380~400bp的條帶，則該苗期水稻第3染色體包含耐冷主效基因qCTS-3-1。本發(fā)明水稻耐冷性篩選可節(jié)約生產(chǎn)成本，提高選擇效率、縮短水稻品種的育種周期，減小檢測結(jié)果的誤差。
【專利說明】水稻耐冷主效基因鑒定方法及其專用引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分子標記領(lǐng)域，具體地說涉及一種水稻苗期耐冷主效基因qCTS-3-l的分子標記，以及應(yīng)用專用引物對耐冷水稻進行鑒定篩選的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻的低溫冷害在世界上許多國家均有發(fā)生，是全球性自然災(zāi)害。在水稻廣泛種植的溫帶以及熱帶、亞熱帶地區(qū)，冷害頻繁發(fā)生，嚴重影響了水稻生產(chǎn)的穩(wěn)定與發(fā)展，對世界糧食生產(chǎn)的安全與協(xié)調(diào)也產(chǎn)生了不小的影響。我國所有稻區(qū)均有冷害發(fā)生，每4~5年造就發(fā)生一次較大冷害，使我國災(zāi)年每年損失稻谷50億~100億kg。在中國南方雙季稻區(qū)早稻播種后，幼苗生長期的溫度一般低于20°C，尤其遇上寒潮天氣的危害，輕者導(dǎo)致秧苗黃葉，生長遲鈍；重者導(dǎo)致卷葉和死苗，不僅嚴重影響早稻的產(chǎn)量，而且還會由于生育期的推遲影響晚稻的生產(chǎn)計劃和產(chǎn)量。冷害主要在苗期和生殖生長期出現(xiàn)，苗期冷害普遍發(fā)生在南北早春生長的水稻幼苗。2008年初發(fā)生的我國南方的嚴重低溫冰雪天氣，給華南地區(qū)已經(jīng)播種雜交水稻制種親本造成了極大的損失，可見苗期冷害不僅是北方粳稻也是南方秈稻生產(chǎn)的難題。目前我國培育的耐冷性品種主要是適于緯度較高地區(qū)種植的粳稻品種，而南方稻區(qū)秈稻的苗期耐冷性品種的培育并沒有取得突破性的進展。適于南方稻區(qū)種植的耐冷性秈稻品種極少，主要原因之一是資源的利用效率差和耐冷育種的力度不夠，因此進行水稻耐冷主效基因的挖掘和深入研究極其重要。
[0003]水稻耐冷基因定位方面已有不少的研究報道，如錢前等利用典型的秈粳交(ZYQ8/JX17)的DH群體在1、2、3、4染色體上檢測到與苗期耐冷性有關(guān)的4個QTL。夏瑞祥等以東鄉(xiāng)野生稻作為供體親本，南京11號為輪回親本構(gòu)建BC2F1分離群體，通過SSR標記以根電導(dǎo)率作為耐冷性指標對東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷性進行QTL定位，檢測到2個位于第10染色體的主效QTL qRC10-l和qRC10_2，對表型的貢獻率分別為34.13%和37.02%。1^11等利用桂朝2號和東鄉(xiāng)野生稻構(gòu)建的高世代回交群體，對東鄉(xiāng)野生稻孕穗開花期耐冷性進行QTL分析，在第1、6、11染色體上定位了貢獻率在4-7%之間的3個孕穗開花期耐冷性QTL。Zhang等用耐冷粳稻品種Lemont與不耐冷秈稻品種特青雜交構(gòu)建重組自交系在3、7、11染色體上也發(fā)現(xiàn)3個苗期耐冷性的QTL，貢獻率分布為4-24%。Andaya用耐冷粳稻品種M202與冷敏感秈稻品種IR50雜交構(gòu)建重組自交系，在第12號染色體精細定位I個苗期耐冷性的主效QTLqCTS12。然而這些耐冷基因沒有能夠很好的應(yīng)用到水稻生產(chǎn)中，因此，水稻生產(chǎn)中迫切需要攜帶耐冷基因的優(yōu)良品種。
[0004]中國專利，發(fā)明專利申請?zhí)朇N200610088801.3，專利名稱:一種輔助篩選耐冷水稻的方法及其專用引物， 申請人::中國農(nóng)業(yè)大學，已授權(quán)。該發(fā)明公開了一種輔助篩選耐冷水稻的方法及其專用引物。輔助篩選耐冷水稻的引物，是由序列表中序列I和序列2的核苷酸序列組成的一對引物。該輔助篩選耐冷水稻的方法，是以待檢測水稻的基因組DNA為模板，用由序列表中序列I和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，如該待測水稻的擴增產(chǎn)物中有大小為500-1000bp的條帶，則該待測水稻為候選耐冷水稻。本發(fā)明的輔助篩選耐冷水稻的方法可用于選育耐冷水稻，縮短耐冷水稻的育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點，適于推廣應(yīng)用，為選育耐冷的水稻種質(zhì)提供了一種快捷的選擇方法。但該方法的檢測是通過擴增產(chǎn)物的大小為500-1000bp的條帶來確定耐冷水稻，由于目標條帶的范圍過于寬泛，增大了檢測結(jié)果的誤差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有耐冷水稻檢測鑒定存在誤差大，易出現(xiàn)假陽性等問題，提供一種水稻苗期耐冷主效基因的分子標記的專用引物，以及該應(yīng)用專用引物對耐冷水稻進行鑒定篩選的方法。
[0006]本發(fā)明的方案是通過這樣實現(xiàn)的:一種水稻耐冷主效基因鑒定方法的專用引物，該專用引物包括標記引物RMl5040、標、記引物J、標記引物ZCTW、標記引物RMl5123中的任--種。
[0007]以上所述的標記引物麗/5?勿為由序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列組成的一對引物，SEQ ID N0:1序列為:CAAACAAATCGTGGATGGATGG，SEQ ID NO: 2序列為:CGCACACACGCAAATATATAGTCC。
[0008]以上所述的標記引物及T7J為由序列表SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列組成的一對引物，SEQ ID N0:3 序列為:ATCAATCCACTAGTAAGAGGT，SEQ ID N0:4 序列為:TATTTTGCTACGTCAACAGC。
[0009]以上所述的標記引物及TM為由序列表SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列組成的一對引物，SEQ ID N0:5序列為:TAAGTGACTCCAAAGACCAT，SEQ ID N0:6序列為:CTAAAGATCATAGGGCCCTG。
[0010]以上所述的標記引物經(jīng)/57W為由序列表SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列組成的一對引物，SEQ ID N0:7序列為:AACCGTTGAGCAGATCACATCG，SEQ ID N0:8序列為:CCGTGAACAACCAGAAGATAATGC。
[0011]一種利用以上專用引物的水稻耐冷主效基因鑒定方法，是以待檢測水稻基因組DNA為模板，用標記引物RMl5040、標記引物ZCT13、標記引物ZCT么?、標記引物RMl5123中的任一一種標記引物進行PCR擴增，然后對PCR擴增產(chǎn)物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，若以由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列組成的標記引物麗/5?勿為PCR擴增引物，PCR擴增產(chǎn)物中有大小為14(Tl70bp的條帶，則該待測水稻的第3染色體上具有耐冷主效基因，該待測水稻為候選耐冷水稻。
[0012]若以由SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列組成的標記引物為PCR擴增引物，PCR擴增產(chǎn)物中有大小為23(T270bp的條帶，則該待測水稻的第3染色體上具有耐冷主效基因，該待測水稻為候選耐冷水稻。
[0013]若以由SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列組成的標記引物ZCTW為PCR擴增引物，PCR擴增產(chǎn)物中有大小為29(T310bp的條帶，則該待測水稻的第3染色體上具有耐冷主效基因，該待測 水稻為候選耐冷水稻。
[0014]若以由SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列組成的標記引物麗
為PCR擴增引物，PCR擴增產(chǎn)物中有大小為38(T400bp的條帶，則該待測水稻的第3染色體上具有耐冷主效基因，該待測水稻為候選耐冷水稻。[0015]作為本發(fā)明的進一步限定，所述變性聚丙烯酰胺凝膠電泳其電泳凝膠中變性聚丙烯酰胺含量為5.5~8%。
[0016]作為本發(fā)明的進一步限定，所述的PCR擴增的反應(yīng)體系為:正向引物0.ΙΟμΜ，反向引物0.1OuM, 250μΜ的dNTPs，1.0ul的10 XPCR反應(yīng)緩沖液，水稻基因組DNA模板20ng，
DNA聚合酶1U，用滅過菌的去離子水補充反應(yīng)體系到IOul。
[0017]作為本發(fā)明的進一步限定，所述PCR擴增的反應(yīng)條件為先94°C預(yù)變性5min ;隨后940C 30sec,50-60°C 30sec,72°C 30sec，共 30 個循環(huán)；最后 72°C延伸 5min。
[0018]本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)原理是:由于水稻耐冷性是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，利用常規(guī)育種手段往往難以有效地導(dǎo)入和聚合不同的耐冷基因，本發(fā)明是在找到與水稻苗期耐冷基因緊密連鎖或共分離的分子標記的基礎(chǔ)上，通過回交和SSR標記輔助選擇，建立普通野生稻染色體片段代換系，借助分子標記輔助選擇(Marker-assisted selection, MAS)技術(shù)則可以有目的地進行耐冷基因的導(dǎo)入和聚合，選育出苗期耐冷性優(yōu)良品種。
[0019]為使本發(fā)明公開充分，以上所述標記弓丨物RM15040、標記弓丨物ZCT13、標記弓丨物ZCTM、標記引物73//57W，標記引物—5?勿的篩選獲得步驟如下:
(I)以具有代表性、耐冷性較強的廣西普通野生稻核心種質(zhì)材料DP15和DP30為供體親本、測序秈稻品種9311為受體親本，通過回交和SSR標記輔助選擇，建立普通野生稻染色體片段代換系，進行至BC4F2代選擇有目標片段的230個株系進行苗期耐冷性鑒定，選擇耐冷性強的DNA片段代換系DC907-3株系后代332株發(fā)展為作圖群體。
[0020](2)參照McCouch等公布的2240對新增SSR標記，從中選取覆蓋水稻全基因組遺傳距離均勻的715個SSR標記，從gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.0rg/)下載引物序列合成引物，對兩親本間進行多態(tài)性分析。根據(jù)親本間多態(tài)性分析`結(jié)果選取多態(tài)性好、在水稻遺傳圖譜上均勻分布的232個標記用于分離群體分析。另一方面，基于該基因最后的定位區(qū)段，比較水稻品種9311及日本晴相應(yīng)的基因組序列，利用比較結(jié)果中差異序列兩端的側(cè)翼序列設(shè)計STS引物。
[0021](3)用 CTAB 法(Murray & Thompson, 1980 Rapid isolation ofhigh-moIecuIar-weight plant DNA.Nucleic Acids Res 8: 4321-4325)提取親本 DP30和9311及BC4F2群體各株系的DNA。用步驟(1)獲得的備選標記對兩親本進行多態(tài)性篩選，PCR反應(yīng)在PTC-100擴增儀上進行，擴增產(chǎn)物在7%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析，記錄并選擇在親本間具有多態(tài)性的SSR標記用于后續(xù)分析。
[0022](4)苗期耐冷性鑒定方法為:種子浸泡催芽后播種于24cmX34cm的托盤中，每托盤播12行，每行20株，中間兩行為對照，對照為低溫敏感的秈稻親本9311 (感，記為S)和耐冷性強的粳稻品種藤坂5號(抗，記為R)。幼苗在溫室生長至3葉期時轉(zhuǎn)移至人工氣候箱，在溫度10°C、光照3000LX (12h/d)條件下處理5天，待對照品種9311全部死亡后轉(zhuǎn)移至26°C氣候箱恢復(fù)7天，統(tǒng)計活苗數(shù)作為耐冷性指標。
[0023](5)根據(jù)BC4F2株系的耐冷性表型，分別選擇10個極端耐冷單株和10個極端敏感單株的DNA混合構(gòu)建耐冷、敏感池。同時，利用在親本間有多態(tài)性的引物分別篩選耐冷、敏感池并獲得在DNA池之間有多態(tài)性的分子標記，該類多態(tài)性標記表明與耐冷性狀是連鎖的。然后，根據(jù)連鎖標記所在的染色體，選擇該染色體上在親本間有多態(tài)性的引物篩選BC4F2分離群體的各個單株，PCR程序保持與步驟(3)中的程序相同，獲得群體基因型。根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用軟件Mapmaker/EXp3.0將群體基因型構(gòu)建水稻的部分遺傳圖譜并獲得各分子標記的遺傳距離。最后，結(jié)合BC4F2群體各個單株的分子標記基因型和相應(yīng)的耐冷性表型鑒定，利用Mapmaker/QTL 1.1軟件復(fù)合區(qū)間作圖法，對目標染色體進行QTL位點掃描。
[0024](6)根據(jù)QTL定位的結(jié)果，確定與苗期耐冷主效基因(該基因命名為qCTS-3-l)緊奄、起徵熱^六予標、記RM15040、ZCT13、ZCT23、RM15123，苗期耐冷主效基因qCTS_3_l位于水稻第3條染色體上。因此，分子標記RM15040、ZCT13、ZCT23、RM15123引物為苗期耐冷主效基因qCTS-3-l的標記引物，用于鑒定耐冷水稻并進行育苗篩選，其詳細序列如表1。
[0025]表1.水稻耐冷主效基因鑒定方法的專用引物
【權(quán)利要求】
1.一種水稻耐冷主效基因鑒定方法的專用引物，其特征是，該專用引物包括標記引物麗/5?初、標記引物ZCT7J、標記引物ZCTW、標記引物麗/57W中的任——種； 所述的標記引物似仏5?勿為由序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列組成的一對引物，SEQ ID NO:1 序列為:CAAACAAATCGTGGATGGATGG，SEQ ID NO: 2 序列為:CGCACACACGCAAATATATAGTCC ； 所述的標記引物及T7J為由序列表SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列組成的一對引物，SEQ ID N0:3 序列為:ATCAATCCACTAGTAAGAGGT，SEQ ID N0:4 序列為:TATTTTGCTACGTCAACAGC ； 所述的標記引物及為由序列表SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列組成的一對引物，SEQ ID N0:5 序列為:TAAGTGACTCCAAAGACCAT, SEQ ID N0:6 序列為:CTAAAGATCATAGGGCCCTG ； 所述的標記引物似為由序列表SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列組成的一對引物，SEQ ID N0:7 序列為:AACCGTTGAGCAGATCACATCG，SEQ ID N0:8 序列為:CCGTGAACAACCAGAAGATAATGC。
2.一種利用權(quán)利要求1所述專用引物的水稻耐冷主效基因鑒定方法，其特征是，以待檢測水稻基因組DNA為模板，用標記引物RM15040、標記引物ZCT13、標記引物ZCT么?、標記引頌RMl 5123中的任——種標記引物進行PCR擴增，然后對PCR擴增產(chǎn)物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析， 若以由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列組成的標記引物麗/5?勿為PCR擴增引物，PCR擴增產(chǎn)物中有大小為14(Tl70bp的條帶，則該待測水稻的第3染色體上具有耐冷主效基因，該待測水稻為候選耐冷水稻； 若以由SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列組成的標記引物為PCR擴增引物，PCR擴增產(chǎn)物中有大小為23(T270bp的條帶，則該待測水稻的第3染色體上具有耐冷主效基因，該待測水稻為候選耐冷水稻； 若以由SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列組成的標記引物為PCR擴增引物，PCR擴增產(chǎn)物中有大小為29(T310bp的條帶，則該待測水稻的第3染色體上具有耐冷主效基因，該待測水稻為候選耐冷水稻； 若以由SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列組成的標記引物麗為PCR擴增引物，PCR擴增產(chǎn)物中有大小為38(T400bp的條帶，則該待測水稻的第3染色體上具有耐冷主效基因，該待測水稻為候選耐冷水稻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻耐冷主效基因鑒定方法，其特征是，所述變性聚丙烯酰胺凝膠電泳其電泳凝膠中變性聚丙烯酰胺含量為5.5~8%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的水稻耐冷主效基因鑒定方法，其特征是，所述的PCR擴增的反應(yīng)體系為:正向引物0.ΙΟμΜ，反向引物0.1OuM, 250μΜ的dNTPs，1.0ul的10XPCR反應(yīng)緩沖液，水稻基因組DNA模板20ng，Taq DNA聚合酶1U，用滅過菌的去離子水補充反應(yīng)體系到 IOul。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的水稻耐冷主效基因鑒定方法，其特征是，所述PCR擴增的反應(yīng)條件為先 94°C預(yù)變性 5min ;隨后 94°C 30sec，50_60°C 30sec，72°C 30sec，共 30 個循環(huán)；最后72°C延伸5min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866026SQ201410101188
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】李容柏, 鄭加興, 陳保善, 邱永福, 劉芳, 覃寶祥, 蒙姣榮 申請人:廣西大學