一種豬腸道組織中白細(xì)胞介素17熒光定量pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬腸道組織中白細(xì)胞介素17熒光定量PCR檢測方法。該方法包括設(shè)計(jì)特異性熒光定量PCR引物，建立熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，制備含有目的片段IL-17的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后待測樣品的目的基因和內(nèi)參基因GAPDH同時(shí)擴(kuò)增，根據(jù)相對定量△△CT方法檢測基因的表達(dá)量。本發(fā)明由于利用了熒光定量PCR具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，無污染且實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，為檢測豬腸道部位的IL-17表達(dá)水平，從而輔助評價(jià)動(dòng)物腸道部位免疫狀態(tài)或疾病過程提供了一個(gè)實(shí)用方法。
【專利說明】—種豬腸道組織中白細(xì)胞介素17熒光定量PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬腸道組織中白細(xì)胞介素17熒光定量PCR檢測方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]白細(xì)胞介素17 (IL-17)是一種重要的促炎癥細(xì)胞因子，由輔助性T細(xì)胞(Thl7)及先天性免疫細(xì)胞等分泌，在多種炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
[0003]在動(dòng)物體內(nèi)微環(huán)境作用下，幼稚型T細(xì)胞可分化為Thl，Th2，Thl7，Th22，濾泡輔助性T細(xì)胞和Treg細(xì)胞亞型。其中Thl7細(xì)胞是一種能夠分泌IL17細(xì)胞因子的獨(dú)特亞型。IL-17是一種由Thl7細(xì)胞，自然殺傷性T細(xì)胞，Y σ T細(xì)胞等表達(dá)的促炎性細(xì)胞因子，在自身免疫性疾病及多種炎性反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。人類IL-17相關(guān)研究表明，該因子是聯(lián)系天性免疫反應(yīng)與獲得性免疫反應(yīng)重要橋梁，并對二者均有有效地促進(jìn)作用。豬的IL-17因子于2004年由Katoh等人克隆并描述后，也成為豬免疫學(xué)研究檢測的重要指標(biāo)之一。豬的消化道是營養(yǎng)學(xué)與病理學(xué)研究的重要組織部位，對豬腸道部位IL-17進(jìn)行精確定量可有助于我們對被檢豬只免疫狀態(tài)及其疾病過程分析提供有力的理論數(shù)據(jù)支持。
[0004]目前，檢測細(xì)胞因子的常用方法主要分為從蛋白水平和基因水平檢測兩種。蛋白水平的檢測包括:(I)流式細(xì)胞術(shù)，主要是利用熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體標(biāo)記表達(dá)該細(xì)胞因子的細(xì)胞，再通過流式細(xì)胞儀用單細(xì)胞分析的方式從蛋白水平檢測。此方法雖特異性強(qiáng)，但操作過程繁瑣代價(jià)較高，難于推廣。(2) Western-blot方法，即通過酶標(biāo)的抗細(xì)胞因子抗體與固定到變性凝膠上的蛋白樣品進(jìn)行雜交，該方法多用于定性檢測，用于定量時(shí)操作水平要求較高，精確度較低。(3)ELISA方法，該方法主要用于檢測分泌型的細(xì)胞因子，例如血清中的蛋白水平，難以反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的情況?；蛩降臋z測包括普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。常規(guī)PCR由于靈敏度較低也僅常用于定性檢測，而熒光定量PCR具有靈敏 度高，且實(shí)時(shí)、定量、快速等特點(diǎn)。常用熒光定量PCR技術(shù)又分為熒光探針法(TaqMan探針技術(shù))與熒光染料法(SYBRGreen法)。與TaqMan技術(shù)相比，SYBR Green法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單，無需設(shè)計(jì)多個(gè)探針即可快速檢測多個(gè)基因，初始成本更低，通用性好。然而，目前關(guān)于用染料法檢測豬腸道的白細(xì)胞介素-17的熒光定量的檢測方法卻鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種豬腸道組織中白細(xì)胞介素17轉(zhuǎn)錄本熒光定量PCR檢測方法。
[0006]首先，本發(fā)明提供一種白細(xì)胞介素17轉(zhuǎn)錄本熒光定量PCR引物，正向引物具有SEQID N0.1所示的序列，反向引物具有SEQ IDN0.2所示的序列。
[0007]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種豬腸道組織中白細(xì)胞介素17轉(zhuǎn)錄本熒光定量PCR檢測方法，其為將腸道樣品制備成cDNA，用所述的引物進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。
[0008]在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述豬腸道組織中IL-17轉(zhuǎn)錄本熒光定量PCR檢測方法包括如下步驟:首先設(shè)計(jì)前述的特異性熒光定量引物，然后建立實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，制備含有目的片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后將待測樣品的目的基因IL-17與內(nèi)參基因GAPDH同時(shí)擴(kuò)增，根據(jù)相對定量ΛΛ Ct方法確定目的基因的表達(dá)變化。
[0009]本發(fā)明檢測方法中，每20 μ I的熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:10 μ I熒光定量PCR預(yù)混液，5 μ mol/L正向引物、反向引物各0.5μ 1，2μ I標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?；驑颖綜DNA，用水補(bǔ)足至20 μ I。
[0010]本發(fā)明檢測方法中，PCR反應(yīng)程序如下:50°C 2min，95°C 10min,95°C 15sec，60°C lmin，擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)，最后 95°C 15sec，60°C lmin,95°C 30sec 作熔解曲線。
[0011 ] 本發(fā)明還提供一種豬腸道白細(xì)胞介素17轉(zhuǎn)錄本熒光定量PCR檢測試劑盒，其含有所述的熒光定量PCR引物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒還可以含有本領(lǐng)域常規(guī)的熒光定量PCR所需的其他試劑。該試劑盒可實(shí)現(xiàn)對豬腸道部位IL-17進(jìn)行精確定量，并有助于對被檢豬只免疫狀態(tài)及其疾病過程分析提供有力的理論數(shù)據(jù)支持。
[0012]本發(fā)明采用熒光定量PCR技術(shù)提供了一種能夠?qū)崟r(shí)、準(zhǔn)確、快速檢測豬腸道組織中白介素17(IL-17)的檢測方法，從而填補(bǔ)了該細(xì)胞因子在豬腸道中檢測方法方面的空白。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對豬腸道部位IL-17進(jìn)行精確定量，并有助于對被檢豬只免疫狀態(tài)及其疾病過程分析提供有力的理論數(shù)據(jù)支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的熔解曲線。圖中橫坐標(biāo)代表解鏈溫度，縱坐標(biāo)代表相對熒光強(qiáng)度，圖中不同顏色的曲線A、B、C、D、E、F、G、H代表標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)107、106、105、104、103、102拷貝數(shù)/μ I及以DEPC處理水作為模版的空白對照的熔解曲線。
[0014]圖2為熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的熒光信號(hào)圖，圖中橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，圖中縱坐標(biāo)代表相對熒光強(qiáng)度，圖中的不同顏色的曲線Α、B、C、D、Ε、F、G、H代表標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)107、IO6UO5UO4UO3UO2拷貝 數(shù)/ μ I及以DEPC處理水作為模版的空白對照的熒光信號(hào)。
[0015]圖3為熒光定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線y= — 3.2431og(conc)+22.67。圖中橫坐標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)(拷貝/μ 1)，縱坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)。
[0016]圖4是利用本發(fā)明所述實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測豬腸道部位IL-17表達(dá)水平的結(jié)果；其中A為回腸部位IL-17表達(dá)水平檢測結(jié)果，B為結(jié)腸部位IL-17表達(dá)水平檢測結(jié)果。
[0017]圖5是利用ELISA方法檢測豬腸道部位IL-17表達(dá)水平的結(jié)果；其中A為回腸部位IL-17表達(dá)水平檢測結(jié)果，B為結(jié)腸部位IL-17表達(dá)水平檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0019]動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo 公司)、Power SYBRK Qreen pcr Master Mix (ABI 公司)，PCR Mixture、pMD18_T、感受態(tài)細(xì)胞DH5a (TakaRa公司)。
[0020]實(shí)施例1制備含IL-17目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0021]一、引物設(shè)計(jì)與合成[0022]先從http://www.ncb1.nlm.nig.gov/GenBank 中查找豬 IL-17 序列(AB102693.1)，然后根據(jù)豬IL_17mRNA保守序列(CDS區(qū)域)，利用Perlprimer軟件設(shè)計(jì)引物送上海英駿生物工程有限公司合成。引物、模板序列如下:
[0023]正向引物:5，-CTGGAGAAAGTGATGGTGAC-3’(SEQ ID N0.1)；
[0024]反向引物:5’-CCTGAAAGCCTAACTGATTTGG-3’ (SEQ ID N0.2)；
[0025]模板(SEQID N0.3):
[0026]5，-CTGGAGAAAGTGATGGTGACAGTGGGCTGCACCTGTGTCACCCCCATCGTCCGCCATATTTCTTAAGAGCTTCTAGTCTGACCCCTGCTCCCCAAATCAGTTAGGCTTTCAGG-3，。
[0027]二、不同處理的仔豬腸道樣品的采集
[0028]為檢測干酪乳桿菌Lactobacillus casei Zhang在日糧中添加后對仔豬腸道IL-17表達(dá)水平的影響，本試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取64頭14日齡左右的杜X長X大仔豬，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭豬。試驗(yàn)分為2個(gè)處理組:1)對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧(不添加抗生素和益生菌)；2)益生菌組，飼喂基礎(chǔ)日糧并添加益生菌(干酪乳桿菌Lactobacillus casei Zhang, IO7CFU/頭/天)；試驗(yàn)全過程共28d。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取一頭仔豬采取腸道組織。
[0029]三、提取豬腸道組織總RNA
[0030]將采集的豬腸道組織樣品取約10mg，加入RNA樣本保存液，然后按照RNA提取試劑盒說明提取總RNA。
[0031]四、反轉(zhuǎn)錄豬腸道RNA
[0032]利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將上述豬腸道總RNA`反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄方法為:0.5 μ g total RNA>I μ I random hexamer primer、其余用 RNase Free H2O 補(bǔ)足至12μ 1，在65 V反應(yīng)5min ;將上述反應(yīng)體系加入4 μ 15 X Reaction BufferU μ IRiboLock RNase Inhibitor(20U/μ I)>2 μ IlOmM dNTP Mix>I μ I RevertAid M-MulLVReverseTranscriptase (200U/ μ I)、其余用 RNase Free H2O 補(bǔ)足至 12μ I,于 PCR 儀上250C 5min、42°C 60min、70°C 5min。
[0033]五、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒
[0034]在20μ I反應(yīng)體系中以前述的2μ I cDNA為模版，加入10 μ I熒光定量PCR預(yù)混液、5 μ mol/L前述正向引物、反向引物各0.5 μ 1、ddH20補(bǔ)足至20 μ I。PCR反應(yīng)程序如下:500C 2min,95°C 10min,95°C 15sec，60°C lmin，擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后取 5 μ I 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，最后EB染料染色，凝膠圖像分析儀上觀察。
[0035]T-A克隆:PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，同pMD18-T載體按一定的比例混合，于16°C連接30min，然后該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5ci菌。根據(jù)藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆。然后用堿裂解法抽提質(zhì)粒，通過PCR和酶切鑒定，如鑒定陽性，則送公司測序。
[0036]稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒:測定上述測序正確的陽性質(zhì)粒的核酸濃度，并計(jì)算出拷貝數(shù)/μ 1，然后將陽性質(zhì)粒先稀釋成IXioici拷貝/y 1，然后按?ο倍依次倍比稀釋成ιχιο9、
IX 108、1X 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X IO2 拷貝 / μ I。
[0037]六、制定標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0038]以上述稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模版，利用SYBR Green I能嵌合到雙鏈DNA，結(jié)合熒光定量PCR儀能夠?qū)崟r(shí)檢測熒光強(qiáng)度的特點(diǎn)來制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:在20 μ I反應(yīng)體系中加入稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒各2 μ IUO μ I Power SYBRx Green PCRMaster Mix, 5 μ mol/L正向引物、反向引物各0.5μ I, 2 μ I標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?；驑颖綾DNA,補(bǔ)充DEPC處理水至20 μ I。在ΑΒΙ7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為50°C 2min,95°C 10min,95°C 15sec, 60°C lmin，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。最后進(jìn)行熔解曲線分析以確定PCR反應(yīng)的特異性。
[0039]標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線圖參見圖1，標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)圖參見圖2，標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖參見圖3。
[0040]實(shí)施例2樣本豬腸道組織中IL-17基因表達(dá)的檢測
[0041 ] 一、豬腸道樣品按前述的方法制備成cDNA，然后與內(nèi)參基因GAPDH同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后根據(jù)相對定量ΛΛ Ct方法確定樣本中IL-17基因相對表達(dá)量。
[0042]4頭空白組(Control)和4頭益生菌組(Lc Zhang)仔豬回腸和結(jié)腸組織中IL-17轉(zhuǎn)錄本相對表達(dá)量(以GAPDH作為內(nèi)參基因)的檢測結(jié)果如下表:
【權(quán)利要求】
1.一種白細(xì)胞介素17轉(zhuǎn)錄本熒光定量PCR引物，其特征在于，正向引物具有SEQ IDN0.1所示的序列，反向引物具有SEQ ID N0.2所示的序列。
2.一種豬腸道組織中白細(xì)胞介素17轉(zhuǎn)錄本熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，將腸道樣品制備成cDNA，用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，每20μ I的熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:10 μ I熒光定量PCR預(yù)混液，5 μ mol/L正向引物、反向引物各0.5 μ I，2 μ I標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?；驑颖綾DNA，用水補(bǔ)足至20 μ l。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，PCR反應(yīng)程序如下:50°C2min,95°C 10min,95°C 15sec,60°C lmin，擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)，最后 95°C 15sec,60°C lmin,95°C 30sec作熔解曲線。
5.含有權(quán) 利要求1所述引物的白細(xì)胞介素17轉(zhuǎn)錄本熒光定量PCR檢測試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103865926SQ201410084252
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】董曉麗, 蘇華荔, 王安如, 閆軼潔 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 江西大北農(nóng)科技有限責(zé)任公司, 哈爾濱大北農(nóng)牧業(yè)科技有限公司