一種銅綠假單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種銅綠假單胞菌，其分類命名為銅綠假單胞菌（Pseudomonas?aeruginosa）DSP-05，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC?No.8390，保藏日期為2013年10月24日。本發(fā)明一種銅綠假單胞菌主要應(yīng)用于降解廢水中的毒死蜱，適合在含有毒死蜱的廢水處理中推廣使用。且采用菌株制備成固定化小球的毒死蜱降解效果更佳，且具有生產(chǎn)成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點，本發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人類的身體健康，降低廢水處理成本具有重要的意義；本發(fā)明一種銅綠假單胞菌（Pseudomonas?aeruginosa）DSP-05培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
【專利說明】一種銅綠假單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DSP-05及其在毒死蜱生產(chǎn)廢水中毒死蜱降解中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]有機磷農(nóng)藥(Organophosphate pesticides OPs)作為殺蟲劑在農(nóng)業(yè)上被廣泛應(yīng)用，是當(dāng)今農(nóng)藥中的主要類別，長期在國內(nèi)外大量生產(chǎn)和廣泛使用。有機磷農(nóng)藥具有誘變性和致畸性，哺乳動物的神經(jīng)和免疫系統(tǒng)疾病如瘋牛病、克雅病、海灣戰(zhàn)爭綜合癥、帕金森綜合癥等大多與其有關(guān)。殘留在蔬菜、水果及動物性食品上的有機磷農(nóng)藥由于能夠抑制人體內(nèi)乙酞膽堿酷酶的功能從而對人存在著程度不同的毒性，其中慢性毒性可誘導(dǎo)多發(fā)性神經(jīng)病、中風(fēng)等，急性中毒可引起人肌肉痙攣、瞳孔收縮、呼吸困難直至死亡。
[0003]毒死蜱是一種高效、廣譜有機磷殺蟲劑，對害蟲具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，尤其對褐飛虱的防治有非常好的效果。目前它是全球應(yīng)用最廣泛的五種殺蟲之一。由于它的生物體內(nèi)積累作用，會對周圍的環(huán)境、海中的生物體以及人類產(chǎn)生危害作用。我國農(nóng)藥生產(chǎn)毒死蜱過程中產(chǎn)生的廢水中均會含有不同濃度的原藥，造成廢水難以進行生物降解。在毒死蜱的田間施用過程中，也有很大一部分會散落在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，影響農(nóng)業(yè)生態(tài)平衡。微生物降解具有成本低、 效率高、無二次污染、生態(tài)恢復(fù)性好等優(yōu)點，已在很多方面得到應(yīng)用，所以篩選出毒死蜱降解菌對于處理毒死蜱生產(chǎn)廢水具有重大意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一目的在于提供一種對毒死蜱具有降解作用的銅綠假單胞菌。
[0005]本發(fā)明的第二目的在于提供一種將所述銅綠假單胞菌制備成固定化小球后在毒死蜱降解中的應(yīng)用。
[0006]技術(shù)方案:為了解決上述第一目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種銅綠假單胞菌，其分類命名為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) DSP-05,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼為100101，保藏編號為:CGMCC N0.8390，保藏日期為2013年10月24日。
[0007]為了解決上述的第二目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:所述銅綠假單胞菌制備成固定化小球后在毒死蜱降解中的應(yīng)用所述的解淀粉芽孢桿菌在抑制草莓炭疽菌生長中的應(yīng)用。
[0008]具體應(yīng)用為:先將固定化小球在毒死蜱生產(chǎn)廢水中曝氣12h進行活化，活化過程中水溫26°C -30°C，曝氣量為1.2L/min ;然后在溫度為26°C -30°C、pH值為6.8-7.2、毒死蜱進水濃度200mg/L、水力停留時間為32h的條件下，每升毒死蜱廢水采取185mL的固定化小球來處理。[0009]更進一步的，將所述銅綠假單胞菌制備成固定化小球的方法包括以下步驟:
[0010](1)用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上挑取少量銅綠假單胞菌菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中于30°C, 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；
[0011](2)將上述培養(yǎng)好的菌液于8000r/min的條件下離心2min,倒掉上清液,加入相同體積的無菌水，搖勻后于8000r/min的條件下離心2min,重復(fù)操作兩遍,用相同體積的無菌水懸浮，制成菌體液；
[0012](3)取1mL菌體液與20mL的質(zhì)量濃度為4%的海藻酸鈉溶液于室溫混勻，然后用注射器將混合液滴入室溫下的質(zhì)量濃度為3%的CaCl2溶液，于4°C下交聯(lián)鈣化6h后得到海藻酸鈣凝膠固定化小球，無菌水洗兩遍保存于4°C備用。
[0013]更進一步的，上述步驟(1)中LB培養(yǎng)基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨 10.0g,氯化鈉 10.0g, pH7.0。
[0014]本發(fā)明中所述的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) DSP-05的生理活性特征如下:
[0015]所述銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) DSP-05主要生物學(xué)特性為G-,該菌氧化酶陽性，能氧化分解葡萄糖和木糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，但不分解乳糖和蔗糖。液化明膠、可分解尿素，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽并產(chǎn)生氮氣。
[0016]革蘭氏染色表現(xiàn)為陰性；吲哚陰性，利用枸櫞酸鹽，精氨酸雙水解酶陽性；通過BLAST比對該菌株的16SrDNA基因序列，鑒定其為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。
[0017]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0018](1)本發(fā)明公開的一種銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) DSP-05能以毒死蜱為唯一碳源進行生長；在實驗室搖瓶條件下對200mg/L毒死蜱的降解率達93%。本發(fā)明還提供了一種使用菌株DSP-05所制備的固定化小球，實驗室生物降解實驗結(jié)果表明，其對200mg/L毒死蜱的降解率達到90%。固定化小球的制備方法具有生產(chǎn)成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點，可以降解廢水中的毒死蜱，適合在含有毒死蜱的廢水處理中推廣使用。本發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人類的身體健康，降低廢水處理成本具有重要的意義。
[0019](2)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) DSP-05培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明菌株DSP-05菌體結(jié)晶紫染色照片(1000x)；
[0021]圖2為本發(fā)明使用菌株DSP-05制備的固定化小球?qū)Χ舅莉缃到馊コ孰S時間變化的示意圖；
[0022]圖3為本發(fā)明使用菌株DSP-05制備的固定化小球?qū)Χ舅莉绮煌M水濃度的降解
去除率意圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合實驗例詳細闡述本發(fā)明銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DSP-05的應(yīng)用。[0024]銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) DSP-05菌株的分離和鑒定方法:
[0025](I)分離:取毒死蜱富集菌液1.0ml，加入9.0mL無菌水中，充分混勻配成KT1的富集液，再吸取1.0mL配好的KT1的富集液加入9.0mL無菌水中，充分混勻配成10_2的富集液，以此類推，對富集液進行梯度稀釋。吸取各梯度的稀釋液0.1mL涂布于含200mg/L毒死蜱的無機鹽固體培養(yǎng)基上(無機鹽固體培養(yǎng)基的配方為:1000mL蒸餾水、1.5g K2HP04、0.5gΚΗ2Ρ04、0.2g MgSO4.7Η20、1.0g NaClU.0g (NH4) 2S04，20g 瓊月旨，ρΗ7.0)，30°C培養(yǎng) 7 天；7 天后從以上的無機鹽固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，于5mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，于8000r/min的條件下離心2min,倒去上清液,加入5mL的無菌水搖勻，仍于8000r/min的條件下離心2min,按此方法用無菌水洗兩遍后,加入5mL無菌水懸浮該菌；吸取ImL該菌液加入IOOmL毒死蜱濃度為200mg/L的無機鹽液體培養(yǎng)基(配方為:1000mL蒸餾水、1.5g K2HPO4,
0.5g ΚΗ2Ρ04、0.2gMgS04.7Η20、1.0g NaClU.0g(NH4)2SO4, ρΗ7.0)于 160r/min，30°C條件下振蕩培養(yǎng)3天后，用紫外分光光度法測其降解效果。如圖2所示，在實驗室搖瓶條件下游離細菌對200mg/L毒死蜱的降解率達90%。
[0026](2)鑒定:將降解效率較高的一株菌株保存，進行后續(xù)實驗。其菌體革蘭氏染色照片(1000x)如圖1所示，鑒定為銅綠假單胞菌屬(Pseudomonas aeruginosa, p.);命名為:DSP-05。主要生物學(xué)特性為G_，對數(shù)生長期菌體細長且長短不一，有時呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排列。該菌氧化酶陽性，能氧化分解葡萄糖和木糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，但不分解乳糖和蔗糖。液化明膠、可分解尿素，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽并產(chǎn)生氮氣，吲哚陰性，利用枸櫞酸鹽，精氨酸雙水解酶陽性。能以毒死蜱為唯一碳源進行生長。
[0027]將銅綠假單胞菌制備成固定化小球的方法:
[0028](I)用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上挑取少量銅綠假單胞菌菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中于30°C, 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；
`[0029](2)將上述培養(yǎng)好的菌液于8000r/min的條件下離心2min，倒掉上清液，加入相同體積的無菌水，搖勻后于8000r/min的條件下離心2min,重復(fù)操作兩遍,用相同體積的無菌水懸浮，制成菌體液；
[0030](3)取ImL菌體液與20mL的質(zhì)量濃度為4%的海藻酸鈉溶液于室溫混勻，然后用注射器將混合液滴入室溫下的質(zhì)量濃度為3%的CaCl2溶液，于4°C下交聯(lián)鈣化6h后得到海藻酸鈣凝膠固定化小球，無菌水洗兩遍保存于4°C備用。
[0031]其中上述步驟(1)中LB培養(yǎng)基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨
10.0g,氯化鈉 10.0g, pH7.0。
[0032]實施例1:
[0033]將固定化小球應(yīng)用于毒死蜱降解的方法:先將固定化小球在毒死蜱生產(chǎn)廢水中曝氣12h進行活化，活化過程中水溫26°C，曝氣量為1.2L/min ;然后在溫度為26°C、pH值為
6.8、毒死蝶進水濃度200mg/L、水力停留時間為32h的條件下,每升毒死蝶廢水采取185mL的固定化小球來處理。
[0034]實施例2:
[0035]先將固定化小球在毒死蜱生產(chǎn)廢水中曝氣12h進行活化，活化過程中水溫30°C，曝氣量為1.2L/min ;然后在溫度為30°C、pH值為7.2、毒死蜱進水濃度200mg/L、水力停留時間為32h的條件下，每升毒死蜱廢水采取185mL的固定化小球來處理。[0036]實施例3:
[0037]先將固定化小球在毒死蜱生產(chǎn)廢水中曝氣12h進行活化，活化過程中水溫28V’曝氣量為1.2L/min ;然后在溫度為28V、pH值為7.0、毒死蜱進水濃度200mg/L、水力停留時間為32h的條件下，每升毒死蜱廢水采取185mL的固定化小球來處理。
[0038]采用上述實施例1-3的方法對于毒死蜱的去除情況如圖2所示，毒死蜱的去除率在90%以上，有較好的去除效果。
[0039]如圖3所示，對于不同進水濃度的毒死蜱的去除情況，研究表明，毒死蜱的去除率隨著進水濃度的升高而降低，當(dāng)進水的毒死蜱濃度在低于500mg/L的范圍內(nèi)時，毒死蜱都有較高的去除 率，可以達到85%以上。
【權(quán)利要求】
1.一種銅綠假單胞菌，其分類命名為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DSP-05,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為:CGMCCN0.8390，保藏日期為2013年10月24日。
2.權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌在毒死蜱降解中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述銅綠假單胞菌制備成固定化小球后在毒死蝶降解中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，先將固定化小球在毒死蜱生產(chǎn)廢水中曝氣12h進行活化，活化過程中水溫26°C -30°C，曝氣量為1.2L/min ;然后在溫度為260C -30°C、pH值為6.8-7.2、毒死蜱進水濃度200mg/L、水力停留時間為32h的條件下，每升毒死蜱廢水采取185mL的固定化小球來處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述銅綠假單胞菌制備成固定化小球的方法包括以下步驟: (1)用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上挑取少量銅綠假單胞菌菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中于30 °C, 160r/min條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期； (2)將上述培養(yǎng)好的菌液于8000r/min的條件下離心2min,倒掉上清液,加入相同體積的無菌水，搖勻后于8000r/min的條件下離心2min,重復(fù)操作兩遍,用相同體積的無菌水懸浮，制成菌體液； (3)取ImL菌體液與20mL的質(zhì)量濃度為4%的海藻酸鈉溶液于室溫混勻，然后用注射器將混合液滴入室溫下的質(zhì)量濃度為3%的CaCl2溶液，于4°C下交聯(lián)鈣化6h后得到海藻酸鈣凝膠固定化小球，無菌水洗兩遍保存于4°C備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的`應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(1)中LB培養(yǎng)基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g,氯化鈉10.0g, pH7.0。
【文檔編號】C12N11/04GK103820370SQ201410083918
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】何任紅, 馬愛軍 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院