一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的基因重組方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的基因 重組方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠李糖脂是一種糖脂類的陰離子表面活性劑，它具有良好的生物相容性和高效的 乳化、增溶以及降低表面張力等能力，在石油開采，生物醫(yī)藥、環(huán)境污染物的去除以及食品 加工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]目前，鼠李糖脂的生產(chǎn)菌株主要是銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)，其 生產(chǎn)性能的提高一般是通過各種理化誘變技術(shù)來提高菌株生產(chǎn)鼠李糖脂的能力，而理化誘 變極易回復(fù)突變，造成菌株生產(chǎn)性能的不穩(wěn)定，1994年研宄發(fā)現(xiàn)參與鼠李糖脂合成的基因 rhlA和rhlB，認為它們是合成鼠李糖脂所必需的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，2003年進一步研宄確定 了 RhlA是?；D(zhuǎn)移酶，是合成HAA (烷基酰酸）所必需的，而HAA ( 0 -羥基癸酰-0 -羥基 癸酸）和TDP-鼠李糖是合成鼠李糖脂的前體物質(zhì)，同時HAA也是一種胞外生物表面活性物 質(zhì)，RhlB是催化TDP-鼠李糖與HAA反應(yīng)生成含有一個鼠李糖基的鼠李糖脂的關(guān)鍵基因，在 銅綠假單胞菌中rhlAB是以操縱子的形式存在的，在這一操縱子下，一共可以編碼三個蛋 白，RhlA、RhlB和RhlR，這三個基因都有自己的終止密碼子，但是由于在其起動子前存在核 糖體結(jié)合位點，從而使得下一個基因得到表達，我們可以利用這一特點直接將其中的RhlAB 基因擴增并在其它的細菌種類中進行表達。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李 糖脂的基因重組方法，通過擴增鼠李糖脂合成酶基因RhlAB，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌-銅綠假單 胞菌穿梭質(zhì)粒PAK1900中，獲得新質(zhì)粒pAK1900-AB ;將構(gòu)建好的表達載體pAK1900-AB導(dǎo)入 銅綠假單胞菌中，具有促使鼠李糖脂的高產(chǎn)的特點。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的基因重組方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 根據(jù)鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，設(shè)計用于擴增RhlAB基因（含鼠李糖基轉(zhuǎn)移 酶自身啟動子和結(jié)構(gòu)基因RhlA，RhlB)的引物，為WA :3' -gaatcgaattcatgcggccgaaagtct gt-5'， WB ： ：3? - cggtaagctttcaggacgcagccttcagcc-5,； 2) 以野生型產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌的染色體為模板，進行PCR反應(yīng)擴增RhlAB基 因，反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測其大小和純度，并應(yīng)用純化試劑 盒對目的基因切膠回收純化； 3) 將純化得到的RhlAB基因酶切轉(zhuǎn)入大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭表達載體pAK1900 中，獲得新的質(zhì)粒PAK1900-AB ; 4) 將構(gòu)建好的表達載體PAK1900-AB，采用熱激法轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入受體菌銅綠假單胞菌 感受態(tài)細胞中，涂布羧芐抗性平板，PCR驗證所構(gòu)建工程菌； 5) 搖瓶發(fā)酵，取200 yL銅綠假單胞菌工程菌接入種子培養(yǎng)基（20mL/200mL錐形 瓶），于37°C、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12h，然后以10%接種量（v/v)接入發(fā)酵培養(yǎng) 基（200mL/500mL錐形瓶），溫度為37°C、轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵時間為7d; 6) 采用硫酸-蒽酮法測定鼠李糖脂的產(chǎn)量。
[0006] 所述的染色體模板采用野生型產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌(保藏編號：CCTCC NO : M2011287)。
[0007] 所述的PCR反應(yīng)擴增RhlAB基因的反應(yīng)條件為：94 °C預(yù)變性5 min，30個循環(huán) (94 °C，0.5 min;50 °C，0.5 min;68 °C，1 min)，最后在 68 °C條件下延伸 10 min。
[0008] 所述的受體采用菌銅綠假單胞菌(保藏編號：CCTCC NO :M2011287)，將銅綠假單胞 菌貯存菌液在無抗的LB平板劃線，37°C培養(yǎng)，從37° C (16-20h)培養(yǎng)平皿內(nèi)挑取單菌落， 接種于5毫升LB的30毫升滅菌試管中，于37° C下振蕩培養(yǎng)，按1% (v/v)接入新鮮的LB 液體培養(yǎng)基，取2ml接種于200mlLB培養(yǎng)基中，37° C下200rpm振蕩培養(yǎng)2-2. 5小時0D600 為0. 3-0. 5左右，將菌液加入事先預(yù)冷的無菌離心管中，冰上放置lOmin后，4°C，4000rpm， 離心10min收集對數(shù)期細胞，棄上清，再將菌體懸浮于1/10體積（20ml)的無菌、預(yù)冷的終濃 度為 20mmol/L 的 CaC12 和 80mmol/L 的 MgC12 溶液中，4°C，3, 500rpm，離心 lOmin ;棄上清， 再將菌體懸浮于2ml的預(yù)冷的0. lmol/L的無菌CaC12溶液中，為感受態(tài)細胞，分裝于1. 5ml 的Eppendorf管中，200 y 1/支，加入無菌甘油，使甘油最終含量達到15-20%，于-80°C冰箱 中凍存。
[0009] 所述的熱激法轉(zhuǎn)化采用每100ML感受態(tài)細胞中加入5-10 ML連接液，冰浴30min， 42 °C熱激45s，冰浴lmin，加入600-800ML LB培養(yǎng)基，于37 °C搖床培養(yǎng)lh，以使細菌復(fù)蘇， 并容許質(zhì)粒所編碼的抗生素抗性的表達。
[0010] 所述的硫酸-蒽酮法測定通過分別吸取稀釋500倍的菌株發(fā)酵液1. 0 mL于干凈試 管中，冰水浴中加入4 mL 0.2%的硫酸-蒽酮溶液，混勻后置于沸水?。?00°C)中15 min， 取出后自然冷卻，以蒸餾水做空白對照，用酶標儀測定620nm的吸光值，根據(jù)已測得的鼠李 糖標準曲線，計算野生型銅綠假單胞菌和其工程菌株發(fā)酵液中鼠李糖脂含量，計算公式如 下：
【主權(quán)項】
1. 一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的基因重組方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 根據(jù)鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，設(shè)計用于擴增RhlAB基因（含鼠李糖基轉(zhuǎn)移 酶自身啟動子和結(jié)構(gòu)基因 RhlA，RhlB)的引物，為WA :3' -gaatcgaattcatgcggccgaaagtct gt-5'， WB ： ：3? - cggtaagctttcaggacgcagccttcagcc-5,； 2) 以野生型產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌的染色體為模板，進行PCR反應(yīng)擴增RhlAB基 因，反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測其大小和純度，并應(yīng)用純化試劑 盒對目的基因切膠回收純化； 3) 將純化得到的RhlAB基因酶切轉(zhuǎn)入大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭表達載體pAK1900 中，獲得新的質(zhì)粒PAK1900-AB ; 4) 將構(gòu)建好的表達載體PAK1900-AB，采用熱激法轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入受體菌銅綠假單胞菌 感受態(tài)細胞中，涂布羧芐抗性平板，PCR驗證所構(gòu)建工程菌； 5) 搖瓶發(fā)酵，取200 yL銅綠假單胞菌工程菌接入種子培養(yǎng)基（20mL/200mL錐形 瓶），于37°C、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12h，然后以10%接種量（v/v)接入發(fā)酵培養(yǎng) 基（200mL/500mL錐形瓶），溫度為37°C、轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵時間為7d; 6) 采用硫酸-蒽酮法測定鼠李糖脂的產(chǎn)量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的基因重組方法，其特征 在于，所述的染色體模板采用野生型產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌(保藏編號：CCTCC NO: M2011287)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的基因重組方法，其特征在 于，所述的PCR反應(yīng)擴增RhlAB基因的反應(yīng)條件為：94 °C預(yù)變性5 min，30個循環(huán)（94 °C， 0.5 min;50 °C，0.5 min;68 °C，1 min)，最后在 68 °C條件下延伸 10 min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的基因重組方法，其特征在 于，所述的受體采用菌銅綠假單胞菌(保藏編號：CCTCC NO :M2011287)，將銅綠假單胞菌貯 存菌液在無抗的LB平板劃線，37°C培養(yǎng)，從37° C (16-20h)培養(yǎng)平皿內(nèi)挑取單菌落，接種 于5毫升LB的30毫升滅菌試管中，于37° C下振蕩培養(yǎng)，按1% (v/v)接入新鮮的LB液體 培養(yǎng)基，取2ml接種于200mlLB培養(yǎng)基中，37° C下200rpm振蕩培養(yǎng)2-2. 5小時0D600為 0. 3-0. 5左右，將菌液加入事先預(yù)冷的無菌離心管中，冰上放置IOmin后，4°C，4000rpm，離 心IOmin收集對數(shù)期細胞，棄上清，再將菌體懸浮于1/10體積（20ml)的無菌、預(yù)冷的終濃 度為 20mmol/L 的 CaC12 和 80mmoI /T,的 MgC12 溶液中，4°C，3, 500rpm，離心 IOmin ;棄上清， 再將菌體懸浮于2ml的預(yù)冷的0. lmol/L的無菌CaC12溶液中，為感受態(tài)細胞，分裝于I. 5ml 的Eppendorf管中，200 μ 1/支，加入無菌甘油，使甘油最終含量達到15-20%，于-80°C冰箱 中凍存。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的基因重組方法，其特征在 于，所述的熱激法轉(zhuǎn)化采用每1〇〇μL感受態(tài)細胞中加入5-10 PL連接液，冰浴30min，42 °C 熱激45s，冰浴lmin，加入600-800μL LB培養(yǎng)基，于37 °C搖床培養(yǎng)lh，以使細菌復(fù)蘇，并容 許質(zhì)粒所編碼的抗生素抗性的表達。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的基因重組方法，其特征在 于，所述的硫酸-蒽酮法測定通過分別吸取稀釋500倍的菌株發(fā)酵液1. 0 mL于干凈試管中， 冰水浴中加入4 mL 0.2%的硫酸-蒽酮溶液，混勻后置于沸水浴（100°C)中15 min，取出 后自然冷卻，以蒸餾水做空白對照，用酶標儀測定620nm的吸光值，根據(jù)已測得的鼠李糖標 準曲線，計算野生型銅綠假單胞菌和其工程菌株發(fā)酵液中鼠李糖脂含量，計算公式如下：
【專利摘要】一種銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的基因重組方法，包括以下步驟：根據(jù)鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，設(shè)計擴增RhlAB基因的引物，以野生型產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌的染色體為模板，進行PCR反應(yīng)擴增RhlAB基因，并應(yīng)用純化試劑盒對目的基因切膠回收純化，將純化得到的RhlAB基因酶切轉(zhuǎn)入大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭表達載體pAK1900中，獲得新的質(zhì)粒pAK1900-AB，將構(gòu)建好的表達載體pAK1900-AB，采用熱激法轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入受體菌銅綠假單胞菌感受態(tài)細胞中，涂布羧芐抗性平板，PCR驗證所構(gòu)建工程菌；搖瓶發(fā)酵，采用硫酸-蒽酮法測定鼠李糖脂的產(chǎn)量，極大降低了鼠李糖脂的生產(chǎn)成本，為鼠李糖脂的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，具有促使鼠李糖脂高產(chǎn)的優(yōu)點。CCTCC NO:M201128720110815
【IPC分類】C12N15-54, C12R1-385, C12P19-44, C12N15-78
【公開號】CN104830889
【申請?zhí)枴緾N201510100736
【發(fā)明人】孫葉芳, 陳新玲, 薛姝雯
【申請人】西安海格生物技術(shù)研究所有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年3月6日