一種從胎盤中灌洗造血干細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從胎盤中灌洗造血干細胞的方法，所述方法包括胎盤的收集、胎盤的初檢、胎盤的預消毒、胎盤及母血檢測、胎盤造血干細胞的灌洗、造血干細胞的濃縮純化六個步驟，所述方法和使用的設備簡單，操作方便，洗脫出來的造血干細胞損傷小，數(shù)量多，濃度高，活性強，可以應用于自體或者異體的造血干細胞的移植，并且有助于受損組織的修復。
【專利說明】一種從胎盤中灌洗造血干細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從胎盤中灌洗造血干細胞的方法。 【背景技術】
[0002]目前在國際血液系統(tǒng)疾病的治療中主要采取的造血干細胞移植的方法，根據(jù)細胞的來源，可分為三類:骨髓造血干細胞移植(BMT)、動員周圍血干細胞移植(MPST)和臍帶血干細胞移植(UCBT)。前兩者干細胞來源豐富，一般有核細胞數(shù)可達5-10 X 108/Kg，⑶34+細胞(一種造血干/祖細胞的表面標記)可達1-5X 106/Kg，可是由于供者和受體之間需HLA嚴格相符，才能保證移植的成功，否則供者造血干細胞不易在病人體內(nèi)植活，即使成活也會發(fā)生較嚴重的移植物抗宿主病(GVHD)。在一個家庭的子女中，僅有1/4 HLA相符的機率，而在非血緣關系的無關供者中，這種機率只有百分之一，極大的限制了 BMT或MPST在臨床上的廣泛應用。
[0003]近十余年來臍帶血造血干細胞移植在臨床上成功的應用促進了臍帶血造血干細胞研究的發(fā)展。臍帶血來自于胎盤，通常在婦女分娩后廢棄，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)臍帶血中含豐富的造血干細胞，其⑶34+細胞的濃度和骨髓類似，約占總細胞數(shù)的0.1-0.5%，而更早期的造血干細胞⑶34-還較骨髓濃度更高。作為一種造血細胞的來源，現(xiàn)在利用臍帶血移植手術正在逐漸增加。與BMT相比，UCBT的優(yōu)勢在于減少了嚴重的移植物抗宿主反應，有效的擴大了對于那些缺少合適的人類白細胞抗原配型家庭或者無關供體移植的可能性。臍帶血移植主要的限制在于臍血中的造血干細胞數(shù)量有限。這種限制促使臨床中使用2倍劑量單位臍血移植較大的成年受助人，另一種方法是進行體外造血干細胞擴增培養(yǎng)，但體外擴增需要花費時間，費用也高，更重要的是擴增的同時，造血干細胞也發(fā)生分化，臨床應用的結(jié)果表明臍血細胞擴增前后對移植無多大差異。
[0004]人類足月胎盤存在大量的造血干細胞，比臍帶血有更多的造血干細胞，而且這些胎盤造血干細胞在冷凍儲存前后都可以分離出來。胎盤造血干細胞菌落形成單位(CFU)的活性是確定的，在免疫缺陷鼠中的移植實驗已經(jīng)證明胎盤細胞在移植中的潛力。這些結(jié)果有力地表明，人類足月胎盤有可能成為一種新型的用于移植的造血干細胞的來源。并且胎盤中有大量的造血干細胞，胎盤血干細胞是較為早期的干細胞，能在體內(nèi)分化成各種細胞，胎盤血內(nèi)含有豐富的各種階段早期造血干細胞，其含量大約是臍帶血的十幾倍，一個胎盤中的造血干細胞可完全滿足于兩個成年人的需求，若能和臍帶血細胞一起應用于病人，無疑大大增加了造血干細胞的含量，使這造血干細胞可完全應用于所有的適用人群。
[0005]專利CN01131190.8公開了一種通過剪碎消化的方法獲得造血干細胞的方法，方法復雜，獲得的造血干細胞數(shù)量少、純度低，且細胞容易染菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供了一種從健康產(chǎn)婦的足月胎盤中灌洗造血干細胞的方法。[0007]所述的方法包括胎盤的收集、胎盤的初檢、胎盤的預消毒、胎盤及母血檢測、胎盤造血干細胞的灌洗、造血干細胞的濃縮純化六個步驟，各步驟具體為:
(1)胎盤的收集:在手術室無菌環(huán)境下收集胎盤及母血，存放于無菌的胎盤儲運盒中，貼好標簽、條碼，胎盤儲運盒的溫度保持在4-10 °C,24小時內(nèi)送達實驗室；
(2)胎盤的初檢:檢查胎盤儲運盒盒內(nèi)溫度、標簽、送達日期、儲運盒是否有滲漏、是否有母血血樣；
(3)胎盤的預消毒:將胎盤的胎兒面展開放置于胎盤沖洗盒的底部，用生理鹽水沖洗胎盤表面，打開胎盤沖洗盒底面的排水孔，去掉沖洗的生理鹽水，檢查胎盤表面鈣化情況；
(4)胎盤及母血檢測:對所取的胎盤和母血樣本進行檢測，檢測的項目包括肝炎病毒檢測、艾滋病毒檢測、性病檢測、組織配型(HLA)檢測、造血干/祖細胞定性檢測(CFU-GM)；
(5)胎盤造血干細胞的灌洗:將胎盤在無菌條件下用無菌生理鹽水清洗掉胎盤上的血凝塊及積血，采用消毒劑消毒后，將灌注液針頭插入胎盤臍動脈中，胎盤灌注回收瓶針頭插入臍靜脈中，止血鉗夾緊，緩慢開啟恒流泵，灌注液經(jīng)膠管、開關、蠕動泵、針頭、胎盤動脈、胎盤、胎盤靜脈、胎盤灌注回收瓶針頭，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液；
(6)造血干細胞的濃縮純化:將灌洗出來的灌洗液，在離心機中以1500-2000rpm離心15-20分鐘，去掉上清液，收集沉淀和下層的液體，將收集到的沉淀和下層的液體與生理鹽水按2:1-1:2的比例混勻得混合液，然后將混合液和淋巴細胞分離液按2:1-1:2的比例分別加入到離心管中，添加的順序為先在離心管中加入淋巴細胞分離液，再緩慢加入混合液，加入過程中注意保持淋巴細胞分離液的液面平整，加完后以2200-2500 rpm離心20-25分鐘，離心時慢加速慢減速，離心結(jié)束后，收集中間白膜層到新的離心管中，以2:1-1:2的比例加生理鹽水混勻，1200-1500 rpm離心10-15分鐘；離心結(jié)束后去掉上清液，加入10-20mL生理鹽水吹打沉淀,再1200-1500 rpm離心10-15分鐘，離心結(jié)束后,去掉上清液,用DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，收集造血干細胞群，將重懸的細胞群進行細胞和霉菌培養(yǎng)，造血干細胞定量檢測(⑶34)，造血干細胞活性檢測(臺盼藍染色)，造血干細胞定性檢測(CFU-GM)。
[0008]上述方法中所述的造血干細胞的灌洗步驟為:
開始灌洗時使用的灌洗液是每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 50 mL、硝酸甘油注射液(I mL:5 mg) 2支、肝素鈉注射液(2mL:12500單位)2支，混勻制得的灌洗液，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2小時，灌洗了 1000 mL灌洗液；關閉恒流泵，將灌洗液換成每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 50 mL，硝酸甘油注射液(I mL:5 mg)2支，肝素鈉注射液(2 mL:12500單位)2支，AMD3100 (5 mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2.5小時，灌洗了 1500 mL灌洗液；配制灌洗所用的DMEM培養(yǎng)基、10%的FBS使用前先放置于37 °C的水浴鍋中，提前預熱到37°C。上述方法中所述的造血干細胞的灌洗步驟還可以為:
開始灌洗時使用的灌洗液是每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 50 mL、硝酸甘油注射液(I mL:5 mg)2支、肝素鈉注射液(2mL:12500單位)2支，混勻制得的灌洗液，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2小時，灌洗了 1000 mL灌洗液；關閉恒流泵，將灌洗液換成50 mL含AMD3100的濃度為100 mg/L的DMEM培養(yǎng)基，以每秒鐘10滴灌洗液的速度灌洗5分鐘，灌洗，灌洗完后；關閉恒流泵，30分鐘后，將灌洗液換成每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS50 mL，硝酸甘油注射液(I m L:5 mg) 2支，肝素鈉注射液(2 mL: 12500單位)2支，AMD3100(5 mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，開啟恒流泵，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2.5小時，灌洗了1500 mL灌洗液，回收灌洗液。
[0009]上述方法中所述的造血干細胞濃縮純化還可以是:將灌洗出來的灌洗液，離心，離心的條件是:轉(zhuǎn)速1500 rpm,加速時間45 s,減速時間45 s,離心時間20 min,離心結(jié)束后，將回收瓶轉(zhuǎn)移到無菌操作臺中，移液槍吸走上層液體，留血細胞沉淀，往血細胞沉淀中加入10-20 mL的生理鹽水，輕輕吹打起沉淀，取50 mL離心管，每管加入20 mL的淋巴細胞分離液，傾斜含淋巴細胞分離液的離心管，用移液槍吸取吹打起來的血細胞沿著離心管管壁緩緩加入到淋巴細胞分離液上，加的過程要緩慢，保持淋巴細胞分離液液面平整，每管加入血細胞25 mL ;移液完成后，離心，離心條件:轉(zhuǎn)速2200 rpm，加速時間600 S，減速時間600S，離心時間20 min ;離心結(jié)束后，溶液會分四層，用移液管吸取中間白膜層，每管20 mL轉(zhuǎn)移到新的50 mL離心管中，然后每管加入20 mL的生理鹽水，混勻后，離心，離心的條件:轉(zhuǎn)速1500 rpm,加速時間45 s,減速時間45 s,離心時間15 min ;離心結(jié)束后,轉(zhuǎn)移到無菌操作臺中，去掉上清液，每管加入20 mL的生理鹽水吹打沉淀，然后離心，離心的條件:轉(zhuǎn)速1500 rpm，加速時間45 S，減速時間45 S，離心時間15 min ;離心結(jié)束后，去掉上清液，用20 mL的10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，收集造血干細胞群，將細胞群進行細胞和霉菌培養(yǎng)，造血干細胞定量檢測(⑶34)，造血干細胞活性檢測(臺盼藍染色)，造血干細胞定性檢測(CFU-GM)．
[0010]造血干細胞移植中胎盤造血干細胞的含量十分重要，采用本方法提取的胎盤造血干細胞經(jīng)過淋巴細胞分離液分離后，使用細胞計數(shù)儀計數(shù)，有8X IO7-L 5X IO8單個核細胞數(shù)，雖然個體差異較大，但也能夠滿足所有移植的病人的需要。其中約有1.5-3.6%為CD34陽性細胞，體外集落細胞培養(yǎng)(CFU-GM)，可見集落巨大的細胞群。
[0011]通過本發(fā)明所述的方法灌洗得到的胎盤造血干細胞可以應用于各種惡性血液病，如白血??；遺傳性疾病，如先天性溶血性貧血；血液再生不良性疾病，如再生障礙性貧血；放射性疾病，如放射線意外等。治療方法是采用化療或放療等各種手段摧毀病人自身患病的骨髓細胞及免疫系統(tǒng)，然后輸入健康的造血干細胞，通過本發(fā)明方法從胎盤灌洗獲得的造血干細胞可以很好的用于化療或放療術后的造血細胞的重建，移植物抗宿主反應小，極大的提聞了成活率。
[0012]本發(fā)明制備的胎盤干細胞的應用途徑，可以是靜脈注射、動脈注射，也可以局部注射，一般以靜脈輸入給病人，不排除采用其他方式的應用途徑。
[0013]本發(fā)明所用到的試劑或藥學成分，如生理鹽水、DMEM培養(yǎng)基、硝酸甘油注射液、胎牛血清(FBS)、肝素納注射液和AMD3100等，均是無菌、無熱源的，均可適用于臨床移植的病人。
[0014]本發(fā)明的所有操作步驟，都是藥典允許的常規(guī)操作方法，包括采用無菌操作、無菌生理鹽水洗滌、滅菌、無菌細胞濃縮和純化等，所應用的試劑或藥學成分，如生理鹽水、DMEM培養(yǎng)基、硝酸甘油注射液、胎牛血清、肝素納注射液和AMD3100等均是符合我國衛(wèi)生機構的要求，操作完畢后做常規(guī)病毒、細胞檢查及細菌、霉菌培養(yǎng)，只有合乎要求的胎盤造血干細胞才能應用于臨床。
[0015]本發(fā)明所要求保護的制備方法的優(yōu)點:
(１)本發(fā)明方法和使用的設備簡單，操作方便，效率高，大大縮短的從制備到應用的周期，且胎盤來源豐富，供者無痛苦；
(2)本發(fā)明方法從胎盤中灌洗出來的造血干細胞損傷小，數(shù)量多，純度高，活性高，可以應用于自體或者異體的造血干細胞的移植，并且有助于受損組織的修復，大大提高了病人的成活率；
(3)本發(fā)明方法的灌洗系統(tǒng)是封閉的系統(tǒng)，和空氣外界沒有接觸，避免染菌；
(4)本發(fā)明方法能保持胎盤的完整性，方便從胎盤中提取其他細胞；
(5)本發(fā)明方法使用的試劑少，有效節(jié)約資源和成本。
[0016]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1:實施例一方法從胎盤中灌洗得到的造血干細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果。
[0017]圖2:從胎盤中灌洗得到的造血干細胞的集落培養(yǎng)(CFU-GM)培養(yǎng)實驗結(jié)果。
[0018]圖3:從胎盤中分離得到的造血干細胞活性檢測(臺盼藍染色)檢測結(jié)果。
[0019]圖4:實施例二方法從胎盤中灌洗得到的造血干細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果。
[0020]圖中，圖1是指:實施例一方法從胎盤中灌洗得到的造血干細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果，可見細胞的數(shù)量可觀，其中CD34陽性細胞的比率為1.65%，說明胎盤灌洗得到的造血干細胞的數(shù)量可觀，比率很高，對臨床的應用價值很高。
[0021]圖2是指:將得到的胎盤造血干細胞用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)兩周時間后，可以觀察到在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中有明顯的集落，這說明得到的造血干細胞的活性和增殖能力都較高。
[0022]圖3是指:將胎盤造血干細胞進行活性檢測，沒有觀察到造血干細胞被染色，說明造血干細胞的活性較好，而且細胞的形態(tài)很好。
[0023]圖4是指:實施例二方法從胎盤中灌洗得到的造血干細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果，可見細胞的數(shù)量可觀，其中⑶34陽性細胞的比率為3.2%，說明胎盤灌洗得到的造血干細胞的數(shù)量可觀，比率很高，對臨床的應用價值很高。
[0024]【具體實施方式】
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。
[0025]本發(fā)明涉及的技術方案為提供了一種從胎盤中灌洗造血干細胞的方法。
[0026]本發(fā)明所述的從胎盤中灌洗造血干細胞的方法包括胎盤的收集、胎盤的初檢、胎盤的預消毒、胎盤及母血檢測、胎盤造血干細胞的灌洗、造血干細胞的濃縮純化的步驟，其分別為:
(1)胎盤的收集:在手術室無菌環(huán)境下收集胎盤及母血，存放于無菌的胎盤儲運盒中，貼好標簽、條碼，胎盤儲運盒的溫度保持在4-10 °C，24小時內(nèi)送達實驗室；
(2)胎盤的初檢:打開胎盤儲運盒，檢查盒內(nèi)溫度計標度，要求盒內(nèi)溫度保持在4-10°C之間；標簽檢查，胎盤儲運盒上所貼標簽應完整、清晰，且送達日期在胎盤儲運盒失效日期前，否則視為不合格，不予接收；檢查胎盤儲運盒是否有滲漏，如有滲漏，不予接收；檢查是否有母血血樣，且標示完整，若無母親血樣，不予接收；
(3)胎盤的預消毒:將胎盤小心的用鑷子整體取出，平緩放置于已經(jīng)提前消毒處理的胎盤沖洗盒中，展開胎盤，將胎兒面展開放置于胎盤沖洗盒的底部，用生理鹽水沖洗胎盤表面，打開胎盤沖洗盒底面的排水孔，去掉沖洗的生理鹽水，檢查胎盤表面鈣化情況，胎盤鈣化是由于孕婦晚期胎盤發(fā)生局灶性梗死所致，梗死灶越多，出現(xiàn)鈣化點就越多，B超下表現(xiàn)的較強光斑點就越多，B超檢測時可根據(jù)胎盤鈣化斑點分布大小將鈣化程度分為三度，即I度、II度、III度，B超下診斷的鈣化情況不一定與實際相符，而確診須根據(jù)產(chǎn)后檢查胎盤鈣化面積來斷定，根據(jù)胎盤表面鈣化情況確定鈣化程度I度、II度、III度，保存記錄；
(4)胎盤及母血檢測:對所取的胎盤和母血樣本進行檢測，檢測的項目包括肝炎病毒檢測、艾滋病毒檢測、性病檢測、組織配型(HLA)檢測、造血干/祖細胞定性檢測(CFU-GM)；
(5)胎盤造血干細胞的灌洗:將胎盤在無菌條件下用無菌生理鹽水清洗，清洗掉胎盤上的血凝塊及積血，采用消毒劑消毒后，將胎盤的目前面、胎兒面及臍帶橫截面拍照存檔，然后將灌注液針頭插入胎盤臍動脈中，臍帶中有兩條臍動脈，只插入其中一條即可，止血鉗加緊插入臍動脈的針頭，由于靜脈竇的存在，灌洗液不會從另一條臍動脈中流出，胎盤灌注回收瓶針頭插入臍靜脈中，止血鉗夾緊插入臍靜脈的針頭，將灌洗液放置在32 °C恒溫電熱片上，將存放胎盤的盒子放置于32 1:的恒溫電熱片中，待溫度穩(wěn)定后，緩慢開啟恒流泵的開關(插管之前要開啟一下恒流泵，將管道中的空氣排出，使膠管中充滿灌洗液)，將速度調(diào)節(jié)至中速(以每秒鐘3滴灌洗液的速度)，確保沖洗通路流暢，沖洗開始的一段時間要時刻注意接收端灌洗液的流出速度，如果突然停止流出或者流出的速度明顯下降，要關閉恒流泵，打開靜脈止血鉗，取出回收瓶針頭，查看是否有凝血塊堵塞針頭，然后再插針頭，夾緊止血鉗，開啟恒流泵；沖洗的過程中也要時刻注意回收瓶中液體的收集速度，灌注液經(jīng)膠管、開關、蠕動泵、針頭、胎盤動脈、胎盤、胎盤靜脈、胎盤灌注回收瓶針頭，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液；
(6)造血干細胞的濃縮純化:將灌洗出來的灌洗液，在離心機中以1500rpm離心20分鐘，去掉上清液，收集沉淀和下層的液體，將收集到的沉淀和下層的液體與生理鹽水按I: I的比例混勻得混合液， 然后將混合液和淋巴細胞分離液按1:1的比例分別加入到離心管中，添加的順序為先在離心管中加入淋巴細胞分離液，再緩慢加入混合液，加入過程中注意保持淋巴細胞分離液的液面平整，加完后以2200轉(zhuǎn)離心20分鐘，離心時慢加速慢減速，離心結(jié)束后，離心管從上到下溶液分為四層，第一層為血漿層，第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層，第三層為透明分離液，第四層為紅細胞層。收集第二層白膜層到新的離心管中，加10-20mL生理鹽水混勻，1500轉(zhuǎn)離心15分鐘；離心結(jié)束后去掉上清液，生理鹽水吹打沉淀，再1500轉(zhuǎn)離心15分鐘，離心結(jié)束后，去掉上清液，用DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，收集造血干細胞群，將重懸的細胞群進行細胞和霉菌培養(yǎng)，造血干細胞定量檢測(CD34)，造血干細胞活性檢測(臺盼藍染色)，造血干細胞定性檢測(CFU-GM)。
[0027]實施例一從胎盤中灌洗造血干細胞的方法
胎盤來自于當?shù)氐尼t(yī)院婦產(chǎn)科。首先，征得孕婦或者其家屬同意捐獻胎盤后，查閱孕婦的所有檢查報告，證實無任何的病毒、梅毒和血液有關的病毒感染，然后詢問孕婦的家族病史、傳染和感染病史。在確定一切正常后，采集母血5 mL，將胎盤和母血一起盛裝入胎盤儲運盒，貼好標簽、條碼。胎盤儲運過程中的盒內(nèi)溫度保持在4-10 °C，在24小時內(nèi)運送到實驗室。
[0028]到實驗室后將條碼和標簽都輸入電腦中，將胎盤小心的用鑷子整體取出，平緩放置于已經(jīng)提前消毒處理的胎盤沖洗盒中，展開胎盤，將胎兒面展開放置于胎盤沖洗盒的底部，用生理鹽水沖洗胎盤表面，打開胎盤沖洗盒底面的排水孔，去掉沖洗的生理鹽水。檢查胎盤表面鈣化情況。對所取的母血和胎盤樣本進行檢測，檢測的項目包括肝炎病毒檢測、艾滋病毒檢測、性病檢測、組織配型(HLA)檢測，造血干/祖細胞定性檢測(CFU-GM)。
[0029]將胎盤在無菌條件下用無菌生理鹽水清洗，清洗掉胎盤上的血凝塊及積血，采用消毒液消毒后，將胎盤的目前面、胎兒面及臍帶橫截面拍照存檔。然后將灌注液針頭插入胎盤臍動脈中，臍帶中有兩條臍動脈，只插入其中一條即可，止血鉗加緊，由于靜脈竇的存在，灌洗液不會從其中一條動脈中流出，胎盤灌注回收瓶針頭插入臍靜脈中，止血鉗夾緊，開啟灌流系統(tǒng)，開始灌洗時使用的灌洗液是每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 50 mL、硝酸甘油注射液(I mL:5 mg)2支、肝素鈉注射液(2mL:12500單位)2支，混勻制得的灌洗液，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2小時，灌洗了 1000 mL灌洗液；關閉恒流泵，將灌洗液換成每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 50 mL，硝酸甘油注射液(I mL:5 mg) 2支，肝素鈉注射液(2 mL:12500單位)2支，AMD3100 (A5602，5 mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2.5小時，灌洗了 1500 mL灌洗液，在接收端，接收灌洗液。
[0030]將250 mL回收瓶中回收到的灌洗液，配平，離心，離心的條件是:轉(zhuǎn)速1500 rpm,加速時間45 S，減速時間45 S，離心時間20 min ;離心結(jié)束后，將回收瓶轉(zhuǎn)移到無菌操作臺中，移液槍吸走上層液體倒入廢液缸中，留血細胞沉淀，根據(jù)血細胞沉淀加入20 mL的生理鹽水，輕輕吹打起沉淀。取50 mL離心管，每管加入20 mL的淋巴細胞分離液，傾斜含淋巴細胞分離液的離心管，用移液槍吸取吹打起來的血細胞，沿著離心管管壁緩緩加入到淋巴細胞分離液上，加的過程一定要注意緩慢，保持淋巴細胞分離液液面平整，每管加入血細胞25 mL ;移液完成后,離心,離心條件:轉(zhuǎn)速2200 rpm,加速時間600 s,減速時間600 s,離心時間20 min;離心結(jié)束后，溶液會分四層，用移液管吸取中間白膜層，每管20 mL轉(zhuǎn)移到新的50 mL離心管中，然后每管加入20 mL的生理鹽水，混勻后，離心，離心的條件:轉(zhuǎn)速1500rpm,加速時間45 s,減速時間45 s,離心時間15 min ;離心結(jié)束后,轉(zhuǎn)移到無菌操作臺中，去掉上清液，每管加入20 mL的生理鹽水，吹打沉淀，然后離心，離心的條件:轉(zhuǎn)速1500rpm，加速時間45s，減速時間45 S，離心時間15 min ;離心結(jié)束后，去掉上清，將20 mL的10%FBS的DMEM培養(yǎng)基加入到去掉上清液的離心管中，緩慢震蕩離心管，將沉淀都吹打起來，形成溶液。然后從其中取20 ul到1.`5 mL離心管中，取兩管，用于細胞計數(shù)和活性檢測(臺盼藍染色)；然后再從其中分別取200 ul到1.5 mL的離心管中，三管，第一管加入I ul的生理鹽水，第二管加入⑶34的同型對照PE，第三管加入⑶34抗體，將三管混勻后放置在黑暗處孵育15分鐘，然后流式細胞儀檢測。
[0031]對得到的造血干細胞進行細胞計數(shù)、細胞活性檢測、流式細胞儀檢測和集落培養(yǎng)實驗。將一管20 ul的細胞液到細胞計數(shù)儀上，計數(shù)細胞個數(shù)1.0X IO8個單個核細胞；將另一管20 ul的細胞液，加入20 ul濃度0.08%的臺盼藍染液，混勻，然后取4 ul到載玻片上，在顯微鏡下觀察，并沒有觀察到細胞被染色，說明細胞活性較好，而且細胞的形態(tài)很好(見說明書附圖3);細胞定量檢測(CD34)將三管200 ul孵育后的細胞液到流式細胞儀上檢測，通過檢測，⑶34陽性細胞的比率達到1.65%，此次檢測⑶34陽性細胞是加了陰性對照的，數(shù)據(jù)比較保守，正常實驗中所得到的的⑶34陽性細胞的比率最高能達到3.6%，這充分說明胎盤灌洗得到的造血干細胞的比率是很高的，數(shù)量可觀，臨床的應用價值很高(結(jié)果見說明書附圖1);對得到的造血干細胞進行甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)(CFU-GM)，取細胞培養(yǎng)板一個孔，在孔中加入甲基纖維素半固體培養(yǎng)基3 mL，然后取I ul的細胞液，加到甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，并另取一個孔加2 mL蒸餾水，加好后，蓋好培養(yǎng)板蓋子，放置到二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱的條件7 °C、5% CO2、濕度90%培養(yǎng)14天，觀察到完整的細胞集落，這說明得到的造血干細胞的具有增殖能力(結(jié)果見說明書附圖2)。
[0032]實施例二從胎盤中灌洗造血干細胞的方法
胎盤來自于當?shù)氐尼t(yī)院婦產(chǎn)科。首先，征得孕婦或者其家屬同意捐獻胎盤后，查閱孕婦的所有檢查報告，證實無任何的病毒、梅毒和血液有關的病毒感染，然后詢問孕婦的家族病史、傳染和感染病史。在確定一切正常后，采集母血5 mL，將胎盤和母血一起盛裝入胎盤儲運盒，貼好標簽、條碼。胎盤儲運過程中的盒內(nèi)溫度保持在4-10 °C，在24小時內(nèi)運送到實驗室。
[0033]參考實施例一的方法進行胎盤的初檢、胎盤的預消毒、胎盤及母血檢測，
將胎盤造血干細胞的灌洗方法改為:開始灌洗時使用的灌洗液是每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 50 mL、硝酸甘油注射液(I mL:5 mg)2支、肝素鈉注射液(2mL:12500單位)2支，混勻制得的灌洗液，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2小時，灌洗了 1000 mL灌洗液；關閉恒流泵，將灌洗液換成50 mL含AMD3100的濃度為100 mg/L的DMEM培養(yǎng)基，以每秒鐘10滴灌洗液的速度灌洗5分鐘，灌洗，灌洗完后；關閉恒流泵，30分鐘后，將灌洗液換成每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 50 mL，硝酸甘油注射液(I mL:5 mg) 2支，肝素鈉注射液(2 mL:12500單位)2支，AMD3100 (5 mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，開啟恒流泵，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2.5小時，灌洗了 1500 mL灌洗液，在接收端，接收灌洗液。
[0034]參考實施例一的方法對造血干細胞進行濃縮純化，處理樣品后，對得到的造血干細胞進行流式細胞儀檢測(結(jié)果見附圖4)，CD34陽性細胞的比率達到3.2%，說明胎盤灌洗得到的造血干細胞的比率`很高，數(shù)量可觀。
【權利要求】
1.一種從胎盤中灌洗造血干細胞的方法，其特征在于，所述方法包括胎盤的收集、胎盤的初檢、胎盤的預消毒、胎盤及母血檢測、胎盤造血干細胞的灌洗、造血干細胞的濃縮純化的步驟，其分別為: (1)胎盤的收集:在手術室無菌環(huán)境下收集胎盤及母血，存放于無菌的胎盤儲運盒中，貼好標簽、條碼，胎盤儲運盒的溫度保持在4-10 °C，24小時內(nèi)送達實驗室； (2)胎盤的初檢:檢查胎盤儲運盒盒內(nèi)溫度、標簽、送達日期、儲運盒是否有滲漏、是否有母血血樣； (3)胎盤的預消毒:將胎盤的胎兒面展開放置于胎盤沖洗盒的底部，用生理鹽水沖洗胎盤表面，打開胎盤沖洗盒底面的排水孔，去掉沖洗的生理鹽水，檢查胎盤表面鈣化情況； (4)胎盤及母血檢測:對所取的胎盤和母血樣本進行檢測，檢測的項目包括肝炎病毒檢測、艾滋病毒檢測、性病檢測、組織配型(HLA)檢測、造血干/祖細胞定性檢測(CFU-GM)； (5)胎盤造血干細胞的灌洗:將胎盤在無菌條件下用無菌生理鹽水清洗掉胎盤上的血凝塊及積血，采用消毒劑消毒后，將灌注液針頭插入胎盤臍動脈中，胎盤灌注回收瓶針頭插入臍靜脈中，止血鉗夾緊，緩慢開啟恒流泵，灌注液經(jīng)膠管、開關、蠕動泵、針頭、胎盤動脈、胎盤、胎盤靜脈、胎盤灌注回收瓶針頭，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液； (6)造血干細胞的濃縮純化:將灌洗出來的灌洗液，在離心機中以1500-2000rpm離心15-20分鐘，去掉上清液，收集沉淀和下層的液體，將收集到的沉淀和下層的液體與生理鹽水按2:1-1:2的比例混勻得混合液，然后將混合液和淋巴細胞分離液按2:1-1:2的比例分別加入到離心管中，添加的順序為先在離心管中加入淋巴細胞分離液，再緩慢加入混合液，加入過程中注意保持淋巴細 胞分離液的液面平整，加完后以2200-2500 rpm離心20-25分鐘，離心時慢加速慢減速，離心結(jié)束后，收集中間白膜層到新的離心管中，以2:1-1:2的比例加生理鹽水混勻，1200-1500 rpm離心10-15分鐘；離心結(jié)束后去掉上清液，加入10-20mL生理鹽水吹打沉淀,再1200-1500 rpm離心10-15分鐘，離心結(jié)束后,去掉上清液,用DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，收集造血干細胞群，將重懸的細胞群進行細胞和霉菌培養(yǎng)，造血干細胞定量檢測(⑶34)，造血干細胞活性檢測(臺盼藍染色)，造血干細胞定性檢測(CFU-GM)。
2.根據(jù)權利要求1所述的從胎盤中灌洗造血干細胞的方法，其特征在于，所述的造血干細胞的灌洗步驟為: 開始灌洗時使用的灌洗液是每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 50 mL、硝酸甘油注射液(I mL:5 mg) 2支、肝素鈉注射液(2mL:12500單位)2支，混勻制得的灌洗液，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2小時，灌洗了 1000 mL灌洗液；關閉恒流泵，將灌洗液換成每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 50 mL，硝酸甘油注射液(I mL:5 mg)2支，肝素鈉注射液(2 mL:12500單位)2支，AMD3100 (5 mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2.5小時，灌洗了 1500 mL灌洗液；配制灌洗所用的DMEM培養(yǎng)基、10%的FBS使用前先放置于37 °C的水浴鍋中，提前預熱到37 °C。
3.根據(jù)權利要求1所述的從胎盤中灌洗造血干細胞的方法，其特征在于，所述的造血干細胞的灌洗步驟為: 開始灌洗時使用的灌洗液是每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 50 mL、硝酸甘油注射液(I mL:5 mg)2支、肝素鈉注射液(2mL:12500單位)2支，混勻制得的灌洗液，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2小時，灌洗了 1000 mL灌洗液；關閉恒流泵，將灌洗液換成50 mL含AMD3100的濃度為100 mg/L的DMEM培養(yǎng)基，以每秒鐘10滴灌洗液的速度灌洗5分鐘，灌洗，灌洗完后；關閉恒流泵，30分鐘后，將灌洗液換成每500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10% FBS`50 mL，硝酸甘油注射液(I mL:5 mg) 2支，肝素鈉注射液(2 mL: 12500單位)2支，AMD3100(5 mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，開啟恒流泵，以每秒鐘3滴灌洗液的速度灌洗2.5小時，灌洗了`1500 mL灌洗液，回收灌洗液。
4.根據(jù)權利要求1所述的從胎盤中灌洗造血干細胞的方法，其特征是，所述的造血干細胞濃縮純化還可以是:將灌洗出來的灌洗液，離心，離心的條件是:轉(zhuǎn)速1500 rpm，加速時間45 s,減速時間45 s,離心時間20 min,離心結(jié)束后,將回收瓶轉(zhuǎn)移到無菌操作臺中，移液槍吸走上層液體，留血細胞沉淀，往血細胞沉淀中加入10-20 mL的生理鹽水，輕輕吹打起沉淀，取50 mL離心管，每管加入20 mL的淋巴細胞分離液，傾斜含淋巴細胞分離液的離心管，用移液槍吸取吹打起來的血細胞沿著離心管管壁緩緩加入到淋巴細胞分離液上，加的過程要緩慢，保持淋巴細胞分離液液面平整，每管加入血細胞25 mL ;移液完成后，離心，離心條件:轉(zhuǎn)速2200 rpm,加速時間600 s,減速時間600 s,離心時間20 min;離心結(jié)束后,溶液會分四層，用移液管吸取中間白膜層，每管20 mL轉(zhuǎn)移到新的50 mL離心管中，然后每管加入20 mL的生理鹽水，混勻后，離心，離心的條件:轉(zhuǎn)速1500 rpm，加速時間45 S，減速時間45 S，離心時間15 min ;離心結(jié)束后，轉(zhuǎn)移到無菌操作臺中，去掉上清液，每管加入20 mL的生理鹽水吹打沉淀，然后離心，離心的條件:轉(zhuǎn)速1500 rpm，加速時間45 S，減速時間45S，離心時間15 min ;離心結(jié)束后，去掉上清液，用20 mL的10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，收集造血干細胞群，將細胞群進行細胞和霉菌培養(yǎng)，造血干細胞定量檢測(⑶34)，造血干細胞活性檢測(臺盼藍染色)，造血`干細胞定性檢測(CFU-GM)。
【文檔編號】C12N5/0789GK103756965SQ201410039328
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權日:2014年1月27日
【發(fā)明者】戴曉宇, 李棟 申請人:山東省齊魯干細胞工程有限公司