高靈敏度小rna定量檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高靈敏度小RNA定量檢測方法及試劑盒，該方法通過使用由接頭序列和Oligo（dT）m序列、S個核苷酸組成的通用RT引物，對經(jīng)poly（A）聚合酶添加了poly（A）尾的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，然后用由調(diào)節(jié)序列、靶標序列和N個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸三部分組成的特異性正向引物和通用反向引物對小RNA進行實時定量檢測。本發(fā)明所述方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡單以及試劑盒性價比高等特點。
【專利說明】高靈敏度小RNA定量檢測方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學檢測領域，更具體的涉及一種高靈敏度小RNA定量檢測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]內(nèi)源小RNA (smalI RNA)是一類非編碼小分子RNA，大致可歸納為:微RNA(microRNA,miRNA),小干擾 RNA (small interfering RNA, siRNA),與 piwi 相互作用的 RNA(piw1-1nteracting RNA,piRNA)等。小RNA在細胞內(nèi)的重要的調(diào)控功能,使其具有作為疾病診斷標記物或藥物靶標的潛力，目前正被廣泛研究。
[0003]miRNA是一類長度約為22nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，是一種重要的基因表達調(diào)控因子，其中多數(shù)miRNA具有高度序列保守性、表達時序性和組織特異性，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控活動。miRNA通常與靶基因3’ UTR區(qū)域部分互補配對，指導靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控作用。值得注意的是，一個基因可能受到數(shù)十個miRNA的調(diào)控，而單個miRNA又可能調(diào)控著數(shù)百個基因的表達，結(jié)合miRNA及基因自身的時空表達差異性，由此構(gòu)成了一個巨大的miRNA基因表達調(diào)控網(wǎng)絡，可能涉及到細胞的各種功能的行駛，包括細胞增殖與凋亡、細胞分化、細胞遷移、生長發(fā)育、器官形成、造血過程、脂肪代謝、病毒防御等。
[0004]miRNA表達分析是生物功能研究的基礎，是當今生物學研究的熱點領域。準確檢測細胞或?qū)嶒瀯游锝M織中miRN A的表達可用來幫助研究者更快地切入miRNA的功能研究；在病理組織或血液中的miRNA表達譜檢測有助于分析miRNA與疾病的相關性，為開發(fā)miRNA作為疾病診斷及治療的生物標志物和以miRNA為基礎的藥物開發(fā)奠定基礎。
[0005]siRNA是一類長度約21_25nt的非編碼雙鏈小分子RNA，一般為人工體外合成，通過轉(zhuǎn)染進入生物體內(nèi)，是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，其形成主要由Dicer和Rde-1調(diào)控完成，之后并入RISC中，與靶標基因編碼區(qū)或UTR區(qū)完全配對，降解靶標基因的mRNA，從而達到基因沉默的效果。因其調(diào)控的機制是通過互補配對而沉默相應靶位基因的表達，所以是一種典型的負調(diào)控機制。siRNA識別靶序列是有高度特異性的，因為降解首先在相對于siRNA來說的中央位置發(fā)生，所以這些中央的堿基位點就顯得極為重要，一旦發(fā)生錯配就會嚴重抑制RNAi的效應。siRNA在模擬藥物靶標基因抑制劑作用方面的高效性和簡單性，使其成為基因功能研究的重要工具。一旦所發(fā)現(xiàn)的基因?qū)儆诳捎盟幍陌袠耍涂梢葬槍Υ税袠诉M行大規(guī)模的藥物篩選。此外，被發(fā)現(xiàn)的靶標也可用RNAi技術在細胞水平或動物體內(nèi)進一步確認。
[0006]piRNA是從哺乳動物生殖細胞中分離得到的一類長度約為30nt的小RNA，已發(fā)現(xiàn)的piRNA王要存在于基因間隔區(qū)，而很少存在于基因區(qū)和重復序列區(qū)，并且這種小RNA與PIWI蛋白家族成員相結(jié)合才能發(fā)揮它的調(diào)控作用(Aravin.A, et al., A novel class ofsmalIRNAs bind to MILI protein in mouse testes.Nature, 2006;442(7099):203-207)。根據(jù)PIWI蛋白已知的功能推測，piRNA可能具有以下3個方面的功能:1.作為沉默重復元件參與沉默轉(zhuǎn)錄基因過程；2.作為表觀遺傳調(diào)控因子，起著調(diào)節(jié)生殖干細胞維持的作用；3.調(diào)節(jié)翻譯以及mRNA的穩(wěn)定性。目前，對piRNA的研究尚處于初級階段，它的一些具體的功能和生源論尚在研究當中。
[0007]目前，研究小RNA的實驗技術方法主要分為兩大類:雜交和PCR。運用雜交方法的主要實驗技術有:Northern blot、生物芯片(Microarray)等。運用PCR方法的實驗技術主要指實時定量PCR技術。
[0008]Northern blot方法最大的缺點是對樣品的需求量較高,且操作繁瑣,有時可能會用到放射性探針，不適合高通量檢測分析。MiCToarray雖然解決了高通量的問題，但是其結(jié)果的準確性低、可重復性差且操作復雜、檢測成本高。
[0009]目前采用定量PCR技術對小RNA進行檢測的方法主要有以下幾種:
[0010]I)莖環(huán)法(stem-loop)
[0011]由于小RNA片段一般偏短，直接的定量PCR無法對其進行檢測，于是很多研究人員通過與小RNA部分互補的特異性反轉(zhuǎn)錄引物對小RNA進行延伸，使其長度達到定量PCR檢測的要求。而后通過特異性正向引物和通用反向引物完成目的小RNA的實時定量PCR檢測。該方法雖然使用特異性反轉(zhuǎn)錄引物降低了非特異性的反轉(zhuǎn)錄，提高了檢測的特異性，但是，一次反轉(zhuǎn)錄只能檢測一種小RNA的特點以及后續(xù)可能用到的探針(Caifu Chen, etal., Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic AcidsResearch, 2006; 33)都極大的提高了大量、多樣樣本的檢測成本。[0012]2)引物延伸法(PE)
[0013]該方法首先通過反轉(zhuǎn)錄引物(其3’端為7-12個與小RNA互補的核苷酸)，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，之后利用反轉(zhuǎn)錄引物5’端預置的通用正向引物和包含2個鎖核酸且與cDNA配對的特異性反向引物，以及SYBR Green進行熒光定量PCR擴增。該方法雖然使用鎖核酸技術提高了引物的Tm值，從而增強了檢測特異性，但是同樣由于特異性反轉(zhuǎn)錄和引物的化學修飾提高了檢測的成本。
[0014]3) poly (A)法
[0015]該方法首先用poly (A)聚合酶(PAP)給小RNA的3’端加一段poly (A)尾巴,然后用5’端含有接頭序列的oligo (dT)引物進行反轉(zhuǎn)錄，最后用特異性正向引物和通用反向引物進行定量PCR檢測。目前市場上已有試劑盒主要采用兩步法完成檢測，即加尾反應和反轉(zhuǎn)錄同時完成，但據(jù)分析，在DNA轉(zhuǎn)錄過程中，小RNA的3’端序列容易產(chǎn)生多樣化現(xiàn)象，這使兩步法檢測的準確性受到很大影響。而常規(guī)三步法的特異性低、對前體、成熟體的區(qū)分度不夠高(Rui Shi and Vincent L.Chiang, 2005),降低了結(jié)果的可信性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明的目的之一提供一種高靈敏度的小RNA定量檢測方法。
[0017]其技術方案如下:
[0018]一種小RNA定量檢測方法，所述方法包括以下步驟:
[0019]a)在待檢測的小RNA的3’末端添加poly(A)尾，得加尾的小RNA，80nt IOnt ；所述poly (A)尾,用途為在反轉(zhuǎn)錄過程中，與通用RT引物的oligo (虹^部分堿基互補配對，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
[0020]b)對加尾的小RNA，用通用RT引物，進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ;所述通用RT引物是由3，12或48條、S個數(shù)相同但堿基不同的RT引物組成的混合物，所述RT引物從5’端到3’端依次由20-50個核苷酸的接頭序列、Oligo (dT)m序列、S個核苷酸組成，S=V或VN或VNM，其中，V為A、G、或C，N為A、C、G、或T，M為A、C、G、或T，m為10-30 ;所述接頭序列，自身會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成環(huán)堿基率為50%-70%，且與被檢測序列無關；
[0021]c)用特異性正向引物和通用反向引物，對cDNA進行實時定量PCR擴增檢測；所述特異性正向引物從5’端到3’端依次為:1-15個核苷酸的調(diào)節(jié)序列、與待檢測小RNA序列相同的DNA序列，其中小RNA序列中U對應改為T、N個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，10 ^ N ^ I,所述調(diào)節(jié)序列自身不會形成發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與被檢測序列無關系；調(diào)節(jié)序列用途為調(diào)節(jié)正向引物的Tm值，使其匹配通用反向引物的Tm值；所述通用反向引物的堿基組成為通用RT引物的5’端的20-40個核苷酸序列。
[0022]在其中一個實施例中，步驟a)中50nt≥A≥40nt。
[0023]在其中一個實施例中，步驟b)中所述通用RT引物中的m為15-25。
[0024]在其中一個實施例中，所述調(diào)節(jié)序列的堿基個數(shù)為7-11。
[0025]在其中一個實施例中，所述通用反向引物的堿基組成為通用RT引物的5’端的25-35個核苷酸序列。
[0026]所述反轉(zhuǎn)錄的溫度為:37_42°C，本發(fā)明最優(yōu)選為40_42°C。
[0027]本發(fā)明的另一目的是提供一種小RNA定量檢測試劑盒。
[0028]實現(xiàn)上述目的的技術方案如下。
[0029]一種小RNA定量檢測試劑盒,主要包括有:
[0030]A)通用RT引物:所述通用RT引物是由3，12或48條、S個數(shù)相同但堿基不同的RT引物組成的混合物，所述RT引物從5’端到3’端依次由20-50個核苷酸的接頭序列、Oligo(dT) m序列、S個核苷酸組成，S=V或VN或VNM，其中，V為A、G、或C，N為A、C、G、或T，M為A、C、G、或T，m為10-30 ;所述接頭序列，自身會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成環(huán)堿基率為50%_70%，且與被檢測序列無關；
[0031]B)特異性正向引物:從5’端到3’端依次為:1-15個核苷酸的調(diào)節(jié)序列、與待檢測小RNA序列相同的DNA序列，其中小RNA序列中的U對應改為T、N個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，IO^N^ I，所述調(diào)節(jié)序列自身不會形成發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與被檢測序列無關系；調(diào)節(jié)序列用途為調(diào)節(jié)正向引物的Tm值，使其匹配通用反向引物的Tm值；
[0032]C)通用反向引物:其堿基組成為通用RT引物的5’端的20-40個核苷酸序列。
[0033]在其中一個實施例中，所述RT引物中，50nt≥A≥40nt。
[0034]在其中一個實施例中，所述RT引物中的m為15_25。
[0035]在其中一個實施例中，所述調(diào)節(jié)序列的堿基個數(shù)為7-11，所述通用反向引物的堿基組成為通用RT引物的5’端的25-35個核苷酸序列。
[0036]在其中一個實施例中，所述特異性正向引物的Tm值為50°C _80°C，更優(yōu)選為550C _75°C，所述通用反向引物與對應的特異性正向引物的Tm值相差為±2°C。
[0037]在其中一個實施例中，還包括有:D)用于小RNA的3’末端加尾的poly (A)聚合酶。
[0038]本發(fā)明的有益效果如下:
[0039]特異性強:本發(fā)明方法的特異性正向引物所具有的調(diào)整序列使引物Tm值得以調(diào)節(jié)到比較高的溫度，以及3’端腺嘌呤核苷酸的添加，此兩種特性使擴增的特異性更強；
[0040]靈敏度高:本發(fā)明方法采用三步法完成檢測(oligo (dT)通用RT引物加尾、反轉(zhuǎn)錄、實時定量PCR)，比目前市場上很多兩步法檢測試劑盒靈敏度更高，準確性更強；
[0041]成本低:通用RT引物使一次反轉(zhuǎn)錄可檢測多種小RNA，使檢測成本降低；
[0042]此外，用RT引物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭序列和3’端添加S個核苷酸也提高了檢測的特異性。
[0043]綜上所述，本發(fā)明通過使用通用RT引物和特異性正向引物的調(diào)節(jié)序列人為地延長了小RNA的長度，使通過實時定量PCR方法對小RNA進行檢測變?yōu)榭尚?；此外，本發(fā)明利用特異性正向引物的特殊序列構(gòu)成，克服了小RNA前體對成熟體檢測的干擾。因此，本發(fā)明所述方法可以高靈敏度、高特異性的完成對小RNA的檢測，且試劑盒操作簡單，可以進行高通量分析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1為Poly A microRNA檢測系統(tǒng)原理；
[0045]圖2為本發(fā) 明方法實驗操作流程圖；
[0046]圖3為9種不同結(jié)構(gòu)的通用RT引物定量檢測hsa-miR-21-5p的擴增曲線圖和熔解曲線圖；
[0047]圖4為hsa-miR-16_5p的前體和成熟體的序列及二級結(jié)構(gòu)示意圖；
[0048]圖5為兩種設計方法的特異性正向引物定量檢測hsa-miR-16_5p的擴增曲線圖；
[0049]圖6為不同Tm值的特異性正向引物定量檢測hsa-miR-21-5p的擴增曲線圖和熔解曲線圖；
[0050]圖7為LNA化學修飾引物和未經(jīng)修飾引物檢測hsa-miR-16_5p的擴增曲線圖；[0051 ] 圖8為本發(fā)明方法和莖環(huán)法定量檢測人的293T細胞中hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-7_5p、hsa-miR-16_5p、hsa-miR-494_3p 表達的靈敏度比較圖；
[0052]圖9為本發(fā)明方法和試劑盒檢測hsa-miR-133a-3p靈敏度比較圖；
[0053]圖10為本發(fā)明方法定量檢測人的精液、血液中hsa-miR-21-5p的表達圖；
[0054]圖11為本發(fā)明方法定量檢測小鼠的腦、肺、皮膚組織中hsa-miR-7-5p的表達圖；
[0055]圖12為探針法和染料法檢測microRNA的表達的分析的結(jié)果圖；
[0056]圖13為poly (A)的長度與加尾時間分析的結(jié)果圖；
[0057]圖14為不同反轉(zhuǎn)錄溫度處理檢測microRNA表達的結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0058]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術內(nèi)容，特舉以下實施例結(jié)合附圖詳細說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Samtoook等人，分子克隆:實驗室手冊(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0059]本發(fā)明提供了一種高靈敏度小RNA定量檢測方法及試劑盒，其中，所述的檢測方法的原理為:首先，對于待檢測RNA樣品，在RNA的3’末端添加poly (A)尾；其次，使用與poly (A)尾部分互補的通用RT引物,完成反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA ;最后,使用與所述cDNA互補的、待檢測小RNA的特異性正向引物和通用反向引物，完成對待檢測小RNA所對應的cDNA的擴增，通過對實驗數(shù)據(jù)的分析，從而確定待檢測小RNA的數(shù)量；如圖1所示。所述的檢測試劑盒的具體實驗操作流程如圖2所示。
[0060]本發(fā)明所用的以下試劑可通過常規(guī)途徑購買得到。
[0061]i?用于RNA的3’末端加尾的poly (A)聚合酶；
[0062]i1.用于RNA的3’末端加尾的腺嘌呤核糖核苷酸(ATP)；
[0063]ii1.用于RNA的3’末端加尾的poly (A)聚合酶緩沖液；
[0064]iv.用于反轉(zhuǎn)錄的RT-Mix ；
[0065]V.用于反轉(zhuǎn)錄的通用RT引物；
[0066]v1.用于實時定量PCR的PCR-Mix ；
[0067]vi1.用于實時定量PCR的通用反向引物。
[0068]其中，RT-Mix為反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)緩沖液、RNase-1nhibitor和dNTPs的混合物。
[0069]所述的PCR-Mix為熱啟動Taq酶、熱啟動Taq酶緩沖液、dNTPs和熒光染料(若使用探針則將PCR-Mix中的熒光染料替換為探針)的混合物。
[0070]實施例一:不同結(jié)構(gòu)的通用RT引物對microRNA的檢測
[0071]以hsa-miR-21_5p為例進行檢測。
[0072]hsa-miR-21-5p 的序列為:UAGCUUAUCAGACUGAUGUUG (SEQ.NO: 1)0
[0073]RT引物的組成:接頭序列+Oligo (dT) m序列+S個核苷酸
[0074]接頭序列A:GCTGTCAACGATACGAGCTCCACGCTTAACGGCATGACAGTG (成環(huán)堿基率為57.14%)
[0075]接頭序列B:AGAGTCAACGCGTAAAGCAGTGTAC (成環(huán)堿基率為 68%)
[0076]接頭序列C:CAGCTACTAGCGAGGATCAGTCGTAGATCCTC (成環(huán)堿基率為 56.25%)
[0077]S個核苷酸(S=I個):V(V=A，G，或C，以上可選用的堿基組合得到3種由I個核苷酸組成的片段，將一種接頭序列、Oligo (dT)m序列、三種單個堿基組合，可得到3種不同的RT引物，混合該3種RT引物構(gòu)成通用RT引物)；
[0078]S個核苷酸(S=2個):VN(V=A，G，或C ；N=A, C，G,或T，以上可選用的堿基組合得到12種由2個核苷酸組成的片段，將接頭序列、Oligo (dT)m序列、12種由2個核苷酸構(gòu)成的片段進行組合，可得到12種不同的RT引物，混合該12種RT引物構(gòu)成通用RT引物)；
[0079]S 個核苷酸(S=3 個):VNM(V=A，G，或 C;N=A，C，G，或 T;M=A，C，G，或 T，以上可選用的堿基組合得到48種由不同的3個核苷酸組成的片段，將接頭序列、Oligo (dT)m序列、48種由3個核苷酸構(gòu)成的片段進行組合，可得到48種不同的RT引物，混合該48種RT引物構(gòu)成通用RT引物)；
[0080]因有3種不同的接頭序列，最終得到以下9種的試劑盒組成:
[0081]hsa-miR-21_5p-特異性正向引物、通用RT引物-Al (3種的混合物)、對應通用反向引物-A ；
[0082]hsa-miR-21_5p-特異性正向引物、通用RT引物_A2(12種的混合物)、對應通用反向引物-A ；[0083]hsa-miR-21-5p-特異性正向引物、通用RT引物-A3(48種的混合物)、對應通用反向引物-A ；
[0084]hsa-miR-21-5p-特異性正向引物、通用RT引物-BI (3種的混合物)、對應通用反向引物-B ；
[0085]hsa-miR-21_5p-特異性正向引物、通用RT引物_B2(12種的混合物)、對應通用反向引物-B ； [0086]hsa-miR-21-5p-特異性正向引物、通用RT引物B3 (48種的混合物)、對應通用反向引物-B ；
[0087]hsa-miR-21_5p-特異性正向引物、通用RT引物-Cl (3種的混合物)、對應通用反向引物-C ；
[0088]hsa-miR-21_5p-特異性正向引物、通用RT引物_C2(12種的混合物)、對應通用反向引物-C ；
[0089]hsa-miR-21-5p-特異性正向引物、通用RT引物_C3(48種的混合物)、對應通用反向引物-C。
[0090]特異性正向引物:從5’端到3’端依次為:1-15個核苷酸的調(diào)節(jié)序列(CGGCATCG)、與待檢測小RNA序列相同的DNA序列(U對應改為T) (TAGCTTATCAGACTGATGTTG),N個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸(AAA)。
[0091]hsa-miR-21-5p的相關引物序列如下表所示:
[0092]
【權利要求】
1.一種小RNA定量檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: a)在待檢測的小RNA的3，末端添加poly(A)尾，得加尾的小RNA，80nt≥A≥IOnt ； b)對加尾的小RNA，用通用RT引物，進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA;所述通用RT引物是由3，12或48條、S個數(shù)相同但堿基不同的RT引物組成的混合物，所述RT引物從5’端到3’端依次由20-50個核苷酸的接頭序列、Oligo (dT)m序列、S個核苷酸組成，S=V或VN或VNM，其中，V為A、G、或C，NSA、C、G、*T，MSA、C、G、*T，mS 10-30 ;所述接頭序列，自身會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成環(huán)堿基率為50%-70%，且與被檢測序列無關； c)用特異性正向引物和通用反向引物，對cDNA進行實時定量PCR擴增檢測；所述特異性正向引物從5’端到3’端依次為:1-15個堿基的調(diào)節(jié)序列、與待檢測小RNA序列相同的DNA序列，其中小RNA序列中的U對應改為T、N個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，10 > N > 1，所述調(diào)節(jié)序列自身不會形成發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且與被檢測序列無關系；所述通用反向引物的堿基組成為通用RT引物的5’端的20-40個核苷酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的小RNA定量檢測方法，其特征在于，步驟a)中50nt ^ A ^ 40nt。
3.根據(jù)權利要求1所述的小RNA定量檢測方法，其特征在于，步驟b)中所述RT引物中的 m 為 15-25。
4.根據(jù)權利要求1所述的小RNA定量檢測方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)序列用于調(diào)節(jié)正向引物的Tm值，使其匹配通用反向引物的Tm值；所述調(diào)節(jié)序列的堿基個數(shù)為7_11。
5.根據(jù)權利要求1所述的小RNA定量檢測方法，其特征在于，所述通用反向引物的堿基組成為RT引物的5’端的25-35個核苷酸序列。
6.根據(jù)權利要 求1一5任一項所述的小RNA定量檢測方法，其特征在于，所述特異性正向引物的Tm值為50°C -80°C，所述通用反向引物與對應的特異性正向引物的Tm值相差為±2。。。
7.—種小RNA定量檢測試劑盒，其特征在于，主要包括有: A)通用RT引物:所述通用RT引物是由3，12或48條、S個數(shù)相同但堿基不同的RT引物組成的混合物，所述RT引物從5’端到3’端依次由20-50個核苷酸的接頭序列、Oligo(dT) m序列、S個核苷酸組成，S=V或VN或VNM，其中，V為A、G、或C，N為A、C、G、或T，M為A、C、G、或T，m為10-30 ;所述接頭序列，自身會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成環(huán)堿基率為50%_70%，且與被檢測序列無關； B)特異性正向引物:從5’端到3’端依次為:1-15個核苷酸的調(diào)節(jié)序列、與待檢測小RNA序列相同的DNA序列，其中小RNA序列中的U對應改為T、N個腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，10 ^ 1，所述調(diào)節(jié)序列自身不會形成發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與被檢測序列無關系； C)通用反向引物:其堿基組成為通用RT引物的5’端的20-40個核苷酸序列。
8.根據(jù)權利要求7所述的小RNA定量檢測試劑盒，其特征在于，所述所用RT引物中的m 為 15-25。
9.根據(jù)權利要求7所述的小RNA定量檢測試劑盒，其特征在于，所述調(diào)節(jié)序列的堿基個數(shù)為7-11 ;所述調(diào)節(jié)序列用于調(diào)節(jié)正向引物的Tm值，使其匹配通用反向引物的Tm值。
10.根據(jù)權利要求9所述的小RNA定量檢測試劑盒，其特征在于，所述特異性正向引物的Tm值為50°C _80°C，所述通用反向引物與對應的特異性正向引物的Tm值相差為±2°C。
11.根據(jù)權利要求7所述的小RNA定量檢測試劑盒，其特征在于，所述通用反向引物的堿基組成為RT引物的5’端的25-35個核苷酸序列。
12.根據(jù)權利要求7—11任一項的所述的小RNA定量檢測試劑盒，其特征在于，還包括有: D)用于小RNA的3’末端加尾的poly (`A)聚合酶。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740842SQ201410039162
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權日:2014年1月26日
【發(fā)明者】張必良, 曹亮, 趙麗, 劉建世 申請人:廣州市銳博生物科技有限公司