家蠶w染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的靶序列及其位點(diǎn)和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的靶序列及其位點(diǎn)和應(yīng)用，其靶序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.19所示，該序列為家蠶W染色體上的特異序列，在Z染色體和常染色體上并不含有此序列，并且本發(fā)明公開的靶序列上插入外源基因后能夠正常表達(dá)，因此可以作為家蠶W染色體上外源基因定點(diǎn)插入的位點(diǎn)制備W染色體連鎖轉(zhuǎn)基因家蠶，對(duì)家蠶雌雄鑒定具有重要意義。
【專利說明】家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的靶序列及其位點(diǎn)和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種核苷酸序列，具體涉及家蠶W染色體上適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的靶序列及其位點(diǎn)，還涉及該靶序列和位點(diǎn)在轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入報(bào)告基因表達(dá)盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]家蠶是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鱗翅目昆蟲，蠶絲業(yè)是許多地區(qū)農(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源之一，蠶絲業(yè)為世界經(jīng)濟(jì)、文化、社會(huì)發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。優(yōu)良蠶品種選育一直都是蠶業(yè)科學(xué)研究的重點(diǎn)和蠶桑業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)良種選育的主要目標(biāo)是高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)。
[0003]家蠶的體細(xì)胞染色體數(shù)是28對(duì)，其中27對(duì)是常染色體，另外一對(duì)是性染色體。在雌蠶中，性染色體不成對(duì)，叫做ZW ;在雄蠶中成對(duì)，叫做ZZ。雌蠶可以產(chǎn)生兩種卵，一種是27+W，一種是27+Z，兩種卵的比數(shù)相等；而雄蠶只能產(chǎn)生一種精子，即27+Z。帶有W的卵跟帶有Z的精子結(jié)合，得到ZW合子，發(fā)育成為雌蠶；帶有Z的卵跟帶有Z的精子結(jié)合，得到ZZ合子，發(fā)育成為雄蠶。因此，家蠶是ZW型性決定，雌蠶是異配性別，雄蠶是同配性別，下代個(gè)體的性別是由卵細(xì)胞帶的是Z染色體還是W染色體決定。
[0004]蠶種分為母種和雜交種，蠶種生產(chǎn)單位飼養(yǎng)母種并制備雜交種，蠶農(nóng)飼養(yǎng)雜交種。雄蠶在體質(zhì)抗性、飼料效率、繭絲品質(zhì)等方面都優(yōu)于雌蠶，因此蠶農(nóng)希望能夠單養(yǎng)雄蠶。但蠶種生產(chǎn)單位必須同時(shí)飼養(yǎng)多個(gè)母種的雌雄個(gè)體，并在制種前將雌雄個(gè)體分開，以防止自交。在短短的幾天蛹期對(duì)大量的蠶蛹進(jìn)行雌雄鑒定，不但工作量非常大，而且不能保證100%正確。培育具有W染色體連鎖標(biāo)記基因的限性品種成為解決以上兩個(gè)問題的有效方法，限性品種能夠根據(jù)其限性特征在非破壞條件下鑒別雌雄。培育限性品種的傳統(tǒng)方法主要是通過雜交的方式，將已有限性品種的卵色、體色、繭色等限性性狀導(dǎo)入實(shí)用品種，再經(jīng)過很多代長(zhǎng)時(shí)間的回交選純，最后培育成生產(chǎn)品種。但是，這種方法具有很大局限性，比如:在導(dǎo)入限性性狀的同時(shí)帶入了其他不良性狀、限性性狀不穩(wěn)定導(dǎo)致后代出現(xiàn)分離、選育周期過長(zhǎng)，等等。因此，要克服傳統(tǒng)育種方法的這些缺點(diǎn)，需要利用新的技術(shù)和方法。
[0005]轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過的基因片段導(dǎo)入到生物體基因組中的一種方法，導(dǎo)入基因的表達(dá)將引起生物體性狀的可遺傳修飾。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)研究中的一項(xiàng)重要技術(shù)，在基因功能研究、生物素材創(chuàng)新、品種遺傳改良等方面發(fā)揮著重要作用。合適的轉(zhuǎn)座子是轉(zhuǎn)基因成功的重要條件，PiggyBac轉(zhuǎn)座子首次從桿狀病毒侵染粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)昆蟲TN-368細(xì)胞株系時(shí)分離得到，它是一種DNA型轉(zhuǎn)座子。PiggyBac轉(zhuǎn)座子長(zhǎng)2476bp，含有ITR (13bp)和2個(gè)RNA聚合酶II啟動(dòng)子及I個(gè)聚腺苷酸信號(hào)，在該信號(hào)的側(cè)面是一個(gè)編碼轉(zhuǎn)座酶的0RF，該轉(zhuǎn)座子總是在TTAA目標(biāo)位點(diǎn)處特異插入。PiggyBac轉(zhuǎn)座子能夠準(zhǔn)確切除DNA片段并將其插入到基因組中，插入片段遵循孟德爾遺傳規(guī)律被穩(wěn)定遺傳；而且它攜帶的基因片段大小沒有限制，引起的染色體整合頻率也較高。因此，PiggyBac轉(zhuǎn)座子目前已經(jīng)在很多物種中廣泛使用。經(jīng)過研究人員的長(zhǎng)期摸索證明，piggyBac轉(zhuǎn)座子是最適合家蠶轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)座子。[0006]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在W染色體特異插入一個(gè)標(biāo)記基因或者條件性致死基因，是制備雌特異轉(zhuǎn)基因家蠶的有效方法。但是，家蠶W染色體上面包含大量的重復(fù)序列，基因組測(cè)序工作目前尚未完成，而且W染色體上的大量轉(zhuǎn)座元件會(huì)抑制插入基因的表達(dá)。因此，要找到一條適合轉(zhuǎn)基因插入的W染色體序列非常困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供家蠶W染色體上適合外源片段定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因插入的靶序列；本發(fā)明的目的之二在于提供家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的位點(diǎn)；本發(fā)明的目的之三在于提供家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的位點(diǎn)的應(yīng)用。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，提供如下技術(shù)方案:
[0009]家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ IDN0.19所示。
[0010]優(yōu)選的，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.19第1_120位所示。
[0011]其獲得方法是通過胚胎顯微注射的方式將piggyBac[3Xp3EGFP afm]轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入不同家蠶品種，利用該載體隨機(jī)插入的特性，制備了 135個(gè)轉(zhuǎn)基因家蠶系統(tǒng)，并從中篩選出一個(gè)雌特異的轉(zhuǎn)基因品系W-T。熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，在卵期、幼蟲期、蛹期和蛾期，W-T的雌個(gè)體在神經(jīng)系統(tǒng)和復(fù)眼發(fā)出綠色熒光，而雄個(gè)體沒有熒光；PCR檢測(cè)結(jié)果顯示只有W-T的雌個(gè)體含有EGFP序列而雄個(gè)體不含有Southern blot檢測(cè)結(jié)果顯示外源基因以單拷貝方式插入在W-T的W染色體上；通過反向PCR對(duì)插入位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，并設(shè)計(jì)引物通過PCR擴(kuò)增的方法對(duì)插入位點(diǎn)左邊和右邊的基因組序列進(jìn)行了再次克隆驗(yàn)證，將測(cè)序結(jié)果在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比出，發(fā)現(xiàn) 其中一條序列沒有相同序列，表明本發(fā)明獲得的是一條W染色體特異的序列；連續(xù)11代的調(diào)查結(jié)果表明報(bào)告基因在W-T中穩(wěn)定遺傳。因此該序列能夠用于制備W染色體連鎖的轉(zhuǎn)基因家蠶品系，作為適合定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因插入的W染色體特異序列。
[0012]2.家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的位點(diǎn),所述位點(diǎn)位于如SEQ ID N0.19所示核苷酸序列上的任意位置。
[0013]優(yōu)選的，所述位點(diǎn)位于如SEQ ID N0.19所示核苷酸序列的3’端。
[0014]3.所述家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的位點(diǎn)在定點(diǎn)插入報(bào)告基因表達(dá)盒中的應(yīng)用。
[0015]優(yōu)選的，所述報(bào)告基因?yàn)闊晒鈭?bào)告基因、卵色基因、體色基因、繭色基因、斑紋基因或條件性調(diào)控基因。
[0016]更優(yōu)選的，所述報(bào)告基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的靶序列，由于家蠶W染色體上面存在大量和常染色體重復(fù)的序列，并且還存在大量轉(zhuǎn)座元件，會(huì)抑制外源基因的表達(dá)，本發(fā)明克隆出的序列為W染色體特異的序列，插入外源基因后正常表達(dá)，并能夠在后代穩(wěn)定遺傳，也不會(huì)發(fā)生性狀分離，為外源片段定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因插入在W染色體提供了靶標(biāo)序列；利用本發(fā)明公開的靶序列制備W染色體連鎖轉(zhuǎn)基因家蠶，可以在整個(gè)生命周期(卵期、幼蟲期、蛹期、蛾期)進(jìn)行雌雄鑒別，而且熒光標(biāo)記清楚，雌雄個(gè)體的徹底分離避免了自交造成的損失，保證雜交蠶種100%的雜交率，節(jié)約生產(chǎn)成本，而且提高蠶種產(chǎn)量和質(zhì)量；對(duì)絲繭生產(chǎn)而言，利用W-T的限性特征，在幼蟲期分離雌雄，可以實(shí)現(xiàn)雌雄蠶分戶飼養(yǎng)，雌雄繭分別收烘、分別繅絲利用，提高養(yǎng)蠶業(yè)的綜合收益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0019]圖1為W染色體連鎖轉(zhuǎn)基因家蠶W-T的熒光觀察結(jié)果(A和k' =W-T的雌蛾分別在白光和綠色熒光下進(jìn)行觀察和B' =W-T的雄蛾分別在白光和綠色熒光下進(jìn)行觀察)。
[0020]圖2為外源片段在W-T中的拷貝數(shù)檢測(cè)(A:通過PCR檢測(cè)EGFP，I表示NT ?檢測(cè)結(jié)果、2表示NT早檢測(cè)結(jié)果、3表示W(wǎng)-T ?檢測(cè)結(jié)果和4表示W(wǎng)-T早檢測(cè)結(jié)果，M表示marker ；B Southern blot檢測(cè)，I表示W(wǎng)-T早的基因組被Bgl II徹底消化和2表示W(wǎng)-T早的基因組被Xba I分別徹底消化，然后用EGFP的探針進(jìn)行雜交，白色箭頭指示目標(biāo)條帶)。 [0021]圖3為W-T的插入位點(diǎn)分析(A:插入物在W-T基因組中的位置示意圖，SG-R和SG-L分別代表插入位點(diǎn)右邊和左邊鄰近的W染色體基因組序列，虛線表示未知的W染色體序列，TTAA是piggyBac切割和粘貼的特異位點(diǎn)，GCC是HaeIII的酶切位點(diǎn)，引物ff-T-R sense、W-T-R ant1、W_T_L sense 和 W_T_L anti 的箭頭指不 PCR 擴(kuò)增方向；(a)piggyBac [3Xp3EGFP afm]載體示意圖，3Xp3-EGFP_SV40是報(bào)告標(biāo)記基因，PR和PL分別表示右臂和左臂；(b)和(c)分別為克隆的SG-R和SG-L序列。B和C分別為SG-R和SG-L序列在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0023]實(shí)施例1、轉(zhuǎn)基因顯微注射和雌特異轉(zhuǎn)基因家蠶W-T的篩選
[0024]將家蠶“大造”、“P50”等品種蠶卵在溫度為46°C條件浸酸5分鐘解除滯育，浸酸溶液是比重為1.073的鹽酸，然后放于溫度為15°C、80%濕度的黑暗環(huán)境中催青30天左右直至孵化，孵化后將蟻蠶收好置于溫度為25°C，濕度為80%的標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，化蛾以后將雌雄蠶蛾交配4小時(shí)，拆對(duì)后產(chǎn)下的蠶卵為非滯育蠶卵，用于下一步的顯微注射。
[0025]將產(chǎn)下的蠶卵在干凈的載玻片上排列整齊，在蠶卵產(chǎn)后2小時(shí)用Eppendorf顯微注射儀將PiggyBac [3Xp3 EGFP afm]轉(zhuǎn)基因載體和輔助質(zhì)粒A3H，一起注射進(jìn)5300粒蠶卵中，用無(wú)毒膠水封口以后置于25°C、相對(duì)濕度80%的環(huán)境中催青10天左右孵化，將孵化的GO代蟻蠶用桑葉收集飼養(yǎng)至化蛾，GO代蠶蛾通過自交或回交共獲得602個(gè)蛾圈Gl代蠶
卵，用Olympus+、電動(dòng)宏觀熒光顯微鏡觀察Gl胚胎篩選并獲得135個(gè)陽(yáng)性蛾圈。
[0026]選擇雌性轉(zhuǎn)基因個(gè)體的Gl蛾圈，將其和正常親本的雄蛾雜交，制備G2轉(zhuǎn)基因系統(tǒng);再用Olympus?電動(dòng)宏觀熒光顯微鏡觀察，選擇雌性轉(zhuǎn)基因個(gè)體的G2系統(tǒng)，將其和正常
親本的雄蛾雜交，制備G3轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，再用Olympus?電動(dòng)宏觀熒光顯微鏡觀察；最終我們
篩選出一個(gè)來(lái)自于P50的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，在Gl、G2、G3連續(xù)3代，其所有的雌性個(gè)體都是轉(zhuǎn)基因而無(wú)任何雄性轉(zhuǎn)基因個(gè)體(圖1 )，因此，獲得的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)理論上為W染色體連鎖的轉(zhuǎn)基因家蠶，命名為W-T。每一代都將W-T的雌蛾和正常親本的雄蛾進(jìn)行雜交，制備后代蠶種。[0027]實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)W-T的拷貝數(shù)檢測(cè)
[0028]設(shè)計(jì)GFP突變系EGFP和家蠶內(nèi)參基因GAPDH(BmGAPDH)的引物，EGFP的正向引物為5，-gtgagcaagggcgaggagct-3，(SEQ ID N0.1)，反向引物為 5’-cttgtacagctcgtccatgcc-3’(SEQ ID N0.2);BmGAPDH 的正向引物為 5’-cattccgcgtccctgttgctaat-3’ (SEQ ID N0.3),反向引物為 5’-gctgcctccttgaccttttgc-3’ (SEQ ID N0.4)。提取 W-T 雌香(ff-T 早)>ff-T雄蠶(W-T ^ )、非轉(zhuǎn)基因雌蠶(NT早)、非轉(zhuǎn)基因雄蠶(NT ^ )的基因組，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增BmGAPDH基因的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性40秒、58 °C退火40秒、72 °C延伸10秒，共25個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；擴(kuò)增EGFP的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性40秒、56°C退火40秒、72°C延伸10秒，共28個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示4個(gè)樣品都能擴(kuò)增出BmGAPDH的目標(biāo)條帶，而只在W-T早中擴(kuò)增出EGFP的目的條帶(圖2A)，說明W-T確實(shí)是W染色體連鎖的轉(zhuǎn)基因家蠶。
[0029]將W-T早的基因組用Bgl II和Xba I分別進(jìn)行徹底消化，利用制備EGFP的探針(EGFP探針是地高辛標(biāo)記的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2擴(kuò)增的產(chǎn)物)進(jìn)行Southern blot檢測(cè)(具體方法參考蔣亮的博士學(xué)位論文，基于轉(zhuǎn)基因工程的家蠶核型多角體病毒(BmNPV)抗性素材創(chuàng)新及抗性機(jī)制)。結(jié)果顯示兩種酶切產(chǎn)物都只有一條EGFP的雜交條帶(圖2B)，說明插入片段以單拷貝數(shù)方式插入家蠶W染色體。
[0030]實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)W-T的插入位點(diǎn)檢測(cè)
[0031]將W-T早的基因組用Hae III進(jìn)行徹底消化并自連，利用轉(zhuǎn)座子特異引物pBacL和pBacR進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增。pBacR用于擴(kuò)增piggyBac [3 Xp3EGFPafm]右臂(PR)的部分序列和鄰近的基因組序列(SG-R)，pBacR引物序列具體如下，pBacR F ;5，-tacgcatgattatctttaacgta-3’ (SEQ ID N0.5) ；pBacR R:5，-gtactgtcatctgatgtaccagg-3，(SEQ ID N0.6), pBacL 用于擴(kuò)增 piggyBac[3Xp3EGFPafm]左臂(PL)的部分序列和鄰近的基因組序列(SG-L)，pBacL引物序列具體如下，pBacL F:5，-atcagtgacacttaccgcattgaca-3，(SEQ ID N0.7), pBacL R:5’-tgacgagcttgttggtgaggattct-3’ (SEQ ID N0.8),位置如圖 3A 所示。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，然后與PMD19-T載體連接，連接反應(yīng)在T4DNA連接酶作用下，16°C過夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性克隆后送往上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示。其中SEQ ID N0.9中第1_23位為pBacR正向引物序列，第516-538位表不pBacR反向引物序列，第1-246位和第489-538位為PR部分序列，第251-484位為SG-R序列，第247-250位的GGCC為HaeIII的酶切位點(diǎn)；第485-488位的TTAA為piggyBac的特異插入位點(diǎn)；SEQ ID N0.10中第1_25位為pBacL正向引物，第640-664位為反向引物；第1-159位和第332-664位為PL部分序列，第164-327位為SG-L序列，第160-164位的TTAA為piggyBac的特異插入位點(diǎn)，第328-331位為GGCC為HaeIII的酶切位點(diǎn)。
[0032]為了對(duì)測(cè)序結(jié)果所得的插入位點(diǎn)序列進(jìn)行再次驗(yàn)證，我們以SG-R和部分PR的序列 SEQID N0.11 作為模板，設(shè)計(jì)了 W-T-R 引物，正向引物為:5’ -acagctcgtatacccatcta-3’(SEQ ID N0.12),反向引物為 5，-tgtttctattatgtataagttaagc-3’ (SEQ ID N0.13)；以SG-L和部分PL的序列SEQ ID N0.14作為模板，設(shè)計(jì)了 W-T-L引物，正向引物為5，-gtgacacttaccgcattg-3’ (SEQ ID N0.15),反向引物為 5，_tttgttgcgtcagttgtta_3’(SEQ ID N0.16)。以W-T早的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增W-T-R的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性40秒、50°C退火40秒、72°C延伸45秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；擴(kuò)增W-T-L的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性40秒、49 °C退火40秒、72 °C延伸40秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，然后與PMD19-T載體連接，連接反應(yīng)在T4DNA連接酶作用下，16°C過夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性克隆后送往上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別如SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示。
[0033]將SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18 和 SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10 進(jìn)行比對(duì)分析，證明反向PCR的結(jié)果確實(shí)是正確的。由于目前還沒有完成家蠶W染色體的基因組測(cè)序工作，因此家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(SilkDB)沒有包含W染色體序列。將SG-R (圖3Α (b)，SEQ IDN0.19)和SG-L (圖3A (c)，SEQ ID N0.20)的序列放在SilkDB進(jìn)行比對(duì)，沒有發(fā)現(xiàn)與SG-R相同的序列，說明其是一條家蠶W染色體特異的序列；SilkDB中存在一條和SG-L相同的序列，該序列位于16號(hào)染色體的nscaf3058上面，證明SG-L是家蠶基因組上的一條重復(fù)序列。
[0034]實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)W-T性連鎖性狀的遺傳穩(wěn)定性分析
[0035]將獲得的雌性轉(zhuǎn)基因W-T G3與正常親本的雄蛾雜交，子代再與正常親本的雄蛾雜交從G4到G14，連續(xù)11代、每代隨機(jī)選擇5個(gè)蛾圈，分別調(diào)查雌雄個(gè)體數(shù)和是否發(fā)出綠色熒光，結(jié)果如表1所不。
[0036]表1.W-T的遺傳分析結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的靶序列，其特征在于:所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.19所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的靶序列，其特征在于:所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.19第1-120位所示。
3.家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的位點(diǎn)，其特征在于:所述位點(diǎn)位于如SEQIDN0.19所示核苷酸序列上的任意位置。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的位點(diǎn)，其特征在于:所述位點(diǎn)位于如SEQ ID N0.19所示核苷酸序列的3’端。
5.權(quán)利要求3或4所述家蠶W染色體適合轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)插入的位點(diǎn)在定點(diǎn)插入報(bào)告基因表達(dá)盒中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述報(bào)告基因?yàn)闊晒鈭?bào)告基因、卵色基因、體色基因、繭色基因、斑紋基因或條件性調(diào)控基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述報(bào)告基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103725676SQ201410027716
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】夏慶友, 蔣亮, 孫強(qiáng), 劉緯強(qiáng), 郭慧珍, 彭正文, 黨穎慧 申請(qǐng)人:西南大學(xué)