使用編碼靶向核酸內(nèi)切酶附著體載體的基因組編輯方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物基因工程【技術領域】，具體為一種使用編碼靶向核酸內(nèi)切酶附著體載體的基因組編輯方法及試劑盒。本發(fā)明利用附著體載體表達靶向核酸內(nèi)切酶，附著體載體可以實現(xiàn)非整合的穩(wěn)定的基因表達，同時表達篩選基因；通過藥物篩選可以除去沒有得到質(zhì)粒的細胞；當編輯完成后撤掉藥物，細胞會逐漸丟掉附著體載體，這樣就得到了不含外源基因的編輯細胞系。本方法延長了編輯的時間，提高了基因編輯效率。本發(fā)明還提供用于編輯細胞中特定染色體序列的試劑盒。本發(fā)明適用于各種真核生物細胞的基因組編輯。
【專利說明】使用編碼靶向核酸內(nèi)切酶附著體載體的基因組編輯方法及試劑盒發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明屬于遺傳工程【技術領域】，具體涉及一種基因組編輯方法及試劑盒。

【背景技術】
[0002]基因組編輯技術(陰如郵6(11丨丨叩)是一種可以在基因組水平上對0嫩序列進行改造的遺傳操作技術。這種技術的原理是構(gòu)建一個人工內(nèi)切酶，在預定的基因組位置切斷0嫩，切斷的0嫩在被細胞內(nèi)的0嫩修復系統(tǒng)修復過程中會產(chǎn)生突變，從而達到定點改造基因組的目的。0嫩修復系統(tǒng)主要通過兩種途徑修復0嫩雙鏈斷裂，即非同源末端連接和同源重組。通過這兩種修復途徑，基因組編輯技術可以實現(xiàn)三種基因組改造的目的，即基因敲除，特異突變的引入和定點轉(zhuǎn)基因。1)基因敲除:如果想使某個基因的功能喪失，可以在這個基因上產(chǎn)生0嫩雙鏈斷裂，非同源末端連接修復的過程中往往會產(chǎn)生0嫩的插入或刪除，造成移碼突變，從而實現(xiàn)基因敲除特異突變引入:如果想把某個特異的突變引入到基因組上，需要通過同源重組來實現(xiàn)，這時候要提供一個含有特異突變同源模版。正常情況下同源重組效率非常低，而在這個位點產(chǎn)生雙鏈斷裂會極大的提高重組效率，從而實現(xiàn)特異突變的引入定點轉(zhuǎn)基因:與特異突變引入的原理一樣，在同源模版中間加入一個轉(zhuǎn)基因，這個轉(zhuǎn)基因在雙鏈斷裂修復過程中會被拷貝到基因組中，從而實現(xiàn)定點轉(zhuǎn)基因。
[0003]目前比較流行的基因組編輯技術包括鋅指酶技術(2111(31111016886,2剛)、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應物核酸酶技術狀丨1妨1:01'- 111^6 6^^601:01-1111016886, 和規(guī)律成族間隔短回文重復技術1111:61-81)806(181101-1: ^81111(11-011110 1~6^681:87 0^18^1^/0889) 0
[0004]鋅指酶(2剛)由一個0嫩識別域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。0嫩識別域是由3-4個&82-11182鋅指蛋白串聯(lián)組成，每個鋅指蛋白識別并結(jié)合一個特異的三聯(lián)體堿基。多個鋅指蛋白串聯(lián)起來形成一個鋅指蛋白組識別一段特異的堿基序列(9-12恥)，具有很強的特異性。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內(nèi)切酶來自的端的0嫩剪切域，它在二聚體狀態(tài)時才有酶切活性。每個？0“單體與一個鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個21^，識別特定的位點，當兩個識別位點相距恰當?shù)木嚯x時(6-8恥),兩個單體2剛相互作用產(chǎn)生酶切功能。從而達到0嫩定點剪切的目的。
[0005]I從冊技術是在2剛技術之后發(fā)展起來的一種分子生物學工具。80(^^108(3011等人發(fā)現(xiàn)來自植物細菌1:11011101121881).的從⑶蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其祀位點的核酸序列有固定的對應關系。從⑶的核酸識別單位為重復34個恒定氨基酸序列，其中的12、13位點雙連氨基酸與八、6? X有恒定的對應關系，即^6識別丁，冊識別0,?I識別八，剛識別I把這4種I從模塊組裝起來就可以特異結(jié)合任意的0嫩序列。仏謂成等用
模塊代替2剛中的0嫩識別域，組裝成新的基因組編輯工具即I從冊(1^1 0^00^01-1111016886),實現(xiàn)了靶向基因組編輯的目的。
[0006]01？18？1？70389是最新出現(xiàn)的一種由八指導的0189核酸酶對靶向基因進行編輯的技術。是細菌和古細菌為應對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。在這一系統(tǒng)中，嫩(0^18^1^-(161-1^6(1 I？嫩)通過堿基配對與廿￡1(31觀八(I？嫩)結(jié)合形成雙鏈I？嫩，此'觀八'觀八二兀復合體指導0狀9蛋白在⑶尺嫩引導序列靶定位點切斷雙鏈0嫩。在基因組編輯過程中，廿狀成嫩和⑶觀八可以融合成為1條八(8成⑷V，本發(fā)明中稱之為向?qū)О?表達同樣可以起到靶向剪切的作用。0？13？1^0189的優(yōu)點是操作簡單，對基因組的效率高。需要對某一個靶位點編輯的時候，只需要表達相應的向?qū)е^V即可，不需要對0^9核酸酶進行改造。但是最近的研究表明系統(tǒng)存在一定的脫靶剪切現(xiàn)象，阻礙了這種技術的廣泛應用。為了克服脫靶剪切現(xiàn)象，麻省理工學院腦與認知科學助理教授、1060^6^腦研究所和81*0^1研究所核心成員？6叩2118118等人利用一種突變的只在0嫩上面產(chǎn)生單切口的內(nèi)切酶018911( 0189-010八)和兩個識別位點較近的向?qū)？嫩同時在細胞中表達，018911分別切開0嫩的兩個鏈產(chǎn)生0嫩斷裂，這就提高了特異性。
[0007]附著體載體是一類游離于染色體外并且可以在真核細胞內(nèi)復制的0嫩質(zhì)粒。目前比較流行的附著體載體包括如81:6111-831~1~ ^11-118 (￡87) , 81( ^11~118 (8^) , 130^11161)81)11101118 ^11~118 1 (8^^-1) , 811111811 ^11~118 40 (8740)衍生的質(zhì)粒載體或者是是一類 3/嫩尺(808^^01(1/181:1-1^ ^1:1:80111116111: 1^6^1011, 3/嫩尺)介導的非病毒附著型載體。
[0008]￡8嫩1/01*1？是287復制和保持病毒基因組游離性有關的重要基因元件?！?嫩1為28乂核抗原I的基因，編碼一個磷酸化的和蛋白，蛋白的端為一個二聚化的0嫩結(jié)合區(qū)，￡8嫩1同源二聚化與0嫩上的特意序列結(jié)合。01*1？含有雙對稱性((173(1 87臟6廿7 08)和成簇的重復序列“116 ^111117 0？ 1-0^681:8,服)。這些序列包含于￡8嫩1結(jié)合位點。當￡8嫩1與這些序列結(jié)合后，使病毒基因組以穩(wěn)定的游離體形式存在，并使病毒基因組依賴宿主復制的方式復制。鑒于￡8嫩1/01*1？的特點，％16在1985年首次將這兩個基因元件引入質(zhì)粒。具有￡8嫩1/01*1？質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入靶細胞后不整合，可以長期穩(wěn)定存在。
[0009]8.屬于家族，￠101701118^11-11186 亞家族，1971 年首次在一位腎臟移植患者的尿液中分離。8.可以有效的感染哺乳動物細胞，并且保持病毒0嫩游離于宿主染色體之外。根據(jù)這個特性，將大I抗原和復制起始序列可以制成附著體質(zhì)粒，用于穩(wěn)定表達外源基因。如本文所用，術語“外源”指正常情況下不在這個染色體位置存在的任何序列。例如，外源序列可以是來自另一種生物體的“基因”、來自相同生物體的“基因”的另外的拷貝、人工序列、編碼報道分子的序列等。？叩1110111狀11~11868在自然界廣泛分布，在高等脊椎動物中常見。研究最深入的是8？7-1，它的基因組是一個小的環(huán)狀雙鏈0嫩，在細胞中可以維持20-300個拷貝數(shù)。8？乂-1編碼的￡1和￡2蛋白，還有復制起始序列是維持病毒穩(wěn)定存在必須的。根據(jù)這個原理可以制成附著體載體用于穩(wěn)定表達外源基因。
[0010]第一個基于病毒制成的附著體載體是81111181140 (8740)衍生來的載體。這個載體含有0嫩復制所必須的3740攜帶的復制起始序列和它編碼的大丁抗原。3740衍生的附著體載體復制不受宿主細胞控制，拷貝數(shù)可以達到上千，會導致細胞死亡。
[0011]最近10 年來，研發(fā)了一種 $/嫩I？ ($(?打01 IX1^6^1011, 8/]^^)介導的非病毒附著型載體。核基質(zhì)附著區(qū)(腦廿IX 81:1:80111116111: 1*681011，嫩10又稱為核骨架附著區(qū)(8(?打01(1 81:1:80111116111: 3八10序列是限制酶消化后仍附著在核基質(zhì)上的0嫩序列，長度約為200-2 000恥；嫩1？富含八I堿基對0 7090。嫩I？元件在游離表達載體中具有三個功能性的特點，能夠介導載體附著于染色體外存在，克服轉(zhuǎn)基因表達的沉默和使載體在有絲分裂中保持穩(wěn)定。
[0012]基因組編輯技術極大的擴展了改造基因的能力，但是編輯效率低的問題阻礙了該技術的應用。在易于編輯的冊093細胞中編輯效率可以達到30%左右，但是在一些難于轉(zhuǎn)染的細胞中效率低于10%，這為后面挑選兩個基因拷貝刪除帶來了麻煩。目前基因編輯過程中主要通過編輯基因的瞬時表達完成，表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩天后檢測編輯效率。隨著時間的延長細胞不斷增殖而質(zhì)粒不增殖，質(zhì)粒會被稀釋，因而編輯效率會被降低。另外，一部分細胞沒有得到質(zhì)粒，這也會影響整體的編輯效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種高效率的用于修飾細胞的基因組編輯方法及試劑盒，以實現(xiàn)體外培養(yǎng)細胞的高效率編輯。
[0014]本發(fā)明提供的用于修飾細胞的基因組編輯方法，使用了一種編碼靶向核酸內(nèi)切酶附著體載體，利用附著體載體表達靶向核酸內(nèi)切酶；附著體載體可以實現(xiàn)非整合的穩(wěn)定的基因表達，同時表達篩選基因，通過藥物篩選可以除去沒有得到質(zhì)粒的細胞；當編輯完成后撤掉藥物，細胞會逐漸丟掉附著體載體，這樣就得到了不含外源基因的編輯細胞系。具體步驟為:
首先，構(gòu)建一個附著體載體，編碼靶向核酸內(nèi)切酶和篩選基因(亦稱抗性基因)；
然后，將所述附著體載體導入到細胞中，在藥物的篩選下培養(yǎng)細胞若干天，使所有的細胞中都含有附著體載體并穩(wěn)定表達靶向核酸內(nèi)切酶。
[0015]本發(fā)明方法提高編輯效率的原理在于:(1)通過藥物篩選富集了含有附著體載體的細胞42)長期培養(yǎng)增加了基因編輯的時間，從而提高編輯效率。
[0016]本發(fā)明中，所述附著體載體可以是如81:6111-8犯'(￡87),81((8^),130^1116 1101118 1 或 811111^1 40 (8740)等病毒附著型載體，也可以是3/嫩I？ (3(?打01 IX紅仏也腕]!!: 0681011，3/嫩10介導的非病毒附著型載體。這類0嫩載體的共同特征是能夠在真核細胞中復制擴增。
[0017]本發(fā)明中，所述靶向核酸內(nèi)切酶可以是鋅指核酸酶(2剛 ?、大范圍核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應物核酸酶(1從冊)或者規(guī)律成簇間隔短回文重復(01118^61-6(1
『6即1虹17 1111:61-81)806(1￠81111(11-011110 代押&匕)。
[0018]本發(fā)明中，所述靶向核酸內(nèi)切酶在特定位置切斷0嫩，細胞的0嫩修復系統(tǒng)通過非同源末端連接修復法或者同源重組修復法修復0嫩斷裂。非同源末端連接修復法常常會產(chǎn)生堿基對的增加或者缺失，從而造成基因的移碼突變。同源重組修復法需要提供額外的與0嫩斷裂位點兩側(cè)有同源性的單鏈或者雙鏈供體0嫩模版，0嫩模版上編碼的信息會被拷貝到編輯位點。這種方法可以精確的改變基因序列，包括突變位點的引入或者改正，或者定點插入轉(zhuǎn)基因。
[0019]本發(fā)明中，所述篩選基因可以是嘌呤霉素，新霉素，博來霉素，潮霉素等。
[0020]本發(fā)明中，所述細胞可以是培養(yǎng)的細胞、原代細胞、永生細胞、干細胞、誘導的多潛能干細胞(1%)或單細胞胚。
[0021]本發(fā)明中，所述細胞可以是人細胞、哺乳動物細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞或單細胞真核生物。
[0022]合適的細胞包括:真菌或酵母，如畢赤酵母(91(:11181)、酵母或裂殖酵母；昆蟲細胞，如來自草地夜蛾(^)0(101) 1:01?打呢如虹也)的細胞或來自黑腹果蠅0)1X1801)111121 1116121110職81:610的32細胞；動物細胞，如小鼠、大鼠、倉鼠、非人靈長類或人細胞。
[0023]示例性細胞是哺乳動物細胞。哺乳動物細胞可以是原代細胞。通常，可以使用對雙鏈斷裂敏感的任何原代細胞。這些細胞可以是多種細胞類型的，例如，成纖維細胞、成肌細胞、I或8細胞、巨噬細胞、上皮細胞等。細胞系可以是貼壁的或非貼壁，或可以使用本領域技術人員已知的標準技術，在刺激貼壁、非貼壁或器官型生長的條件下培育細胞系。合適的哺乳動物細胞系的非限制性實例包括中國倉鼠卵巢⑴訊))細胞、由^40轉(zhuǎn)化的猴腎^1系(⑶37)、人胚腎系293、幼倉鼠腎細胞(8皿)、小鼠36代011細胞(114)、猴腎細胞((^1-76),非洲綠猴腎細胞(犯如)、人宮頸癌細胞(抱匕)、犬腎細胞(1000 4110^10大鼠肝細胞(81^3八)、人肺細胞(1138)、人肝細胞62)、小鼠乳腺瘤細胞(111)、大鼠肝瘤細胞￠110 3111/313細胞、人[2-03骨肉瘤細胞、人八549細胞、人1(562細胞、人冊1(293細胞、人冊1(2931細胞、人!￠1116細胞、人1(^-7細胞和狀1細胞。
[0024]對于所述附著體載體助181:6111-8211~1~ ^11*118 (即￡87系統(tǒng))，本發(fā)明具體構(gòu)建了如下幾種質(zhì)粒:28嫩 1 01896即？、28嫩 1 0189(30^？？、￡8嫩 1 0^8911(, ￡8^1 0189111? ；其中:
(一)28嫩1 0^8966？？附著體載體，含1131)0189內(nèi)切酶、向?qū)？嫩表達系統(tǒng)(包括仙6啟動子、后面的骨架I？嫩和它們之間的成嫩插入位點，即3叩1位點?、嘌呤霉素丨？!!!^)、綠色熒光蛋白6即？、質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件￡8嫩1和￡87 01*1？、在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨節(jié)抗性基因(八即)和復制起始點01-181110
[0025](二)￡8嫩1 0^89001)6？？附著體載體，含1^1)0189內(nèi)切酶、向?qū)？嫩表達系統(tǒng)(包括匕服啟動子、后面的骨架八和它們之間的成…V插入位點，即3叩1位點?、嘌呤霉素(戶證。)、熒光蛋白⑶邱?？(⑶邱?？和嘌呤霉素通過？2八序列連接?、質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件￡8嫩1和￡87 01*1？、在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨芐抗性基因(八卹)和復制起始點
￠)110 01*1 盡 111。
[0026](三)本發(fā)明提供的￡8嫩1^8911(附著體載體，含1^1)0189內(nèi)切酶、向?qū)？嫩表達系統(tǒng)(卜服啟動子V插入位點，即3叩1位點，后面的骨架8^0、嘌呤霉素和1型單純皰疫病毒胸腺喃唳核苷激酶11371-認的融合蛋白(叩:^!^)、質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件￡8嫩1和￡87 01*1？、在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨芐抗性基因(八卹)和復制起始點即0
[0027](四)28^10^891111(附著體載體，含11^)0189內(nèi)切酶的突變體沾隊狀如(產(chǎn)生但缺口切割?、向?qū)О吮磉_系統(tǒng)(卜服啟動子成…V插入位點，即3叩1位點，后面的骨架八?、嘌呤霉素和1型單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶認的融合蛋白(叩抓讓?、質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件￡8嫩1和￡87 01*1？、在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨芐抗性基因(八卹)和復制起始點01-181110
[0028]￡8嫩1 0^8966？？附著體載體構(gòu)建方法的具體步驟為:
(1)^9質(zhì)粒用乂1^1和恥!!〗酶切，保留表達￡8嫩1基因部分。
[0029](2)序列人工合成并克隆到？即?9質(zhì)粒的1^111和乂1^1位點，得到質(zhì)粒
具體序列為:
661^001110^606^1060^61^011^6011^6^0060106^6600660^660066^100^6^
0^16^1^6^1^0^116^16^611166^0^00^0^01^6^160^616^^^160111^111616^11
161110^66110^66666^66161666^66111111^60^61^^00101^0^161661^166016^11^16^1006601600106060611106616^16^06616^^001016^0^0^160^60100066^6^06610^0^6011610161^6066^1600666^60^6^0^6000610^666060610^60666161166066616106660060^600^X6^66X06^0X0X^6^ (560.10.吣.0。
[0030]下劃線部分分別為酶切位點恥111、^131、紅III和^1^1。
[0031](3) 口匕社丨⑶巧?!?質(zhì)粒(來自美國？6叩2匕叩實驗室)用88081酶切，替換為雙3叩1酶切位點。雙3叩1酶切位點用011職0^006^6^6^606^X60X01X06 (820.10.勵.2)和^006^6^60^X060X01X0X0 (820.10.勵.3)退火形成，正好可以連接到8811181酶切位點，得到質(zhì)粒 1) 16=1:10^13？1？-3叩 I。
[0032](4 )用引物 I'八?。?！'八IX！'丁丁(820.10.勵.4 )和(^丁億⑶⑶八!'⑶⑶60^0066601X60666X0^ (820.10.勵.5)把 0189 部分從？16社10？13？1？-3叩1 擴增下來，[即工、八8131酶切，連接到？詘?9-^上。
[0033](5)用引物⑶⑶以八(?八！'八(320.10.勵.6)和611011^611^01161^0^60106100^ (820.10.勵.7)把 6即？從？6即？州1 質(zhì)粒上擴增下來，八8131、紅III酶切，連接到上述(4)中得到的質(zhì)粒，得到￡8嫩1 0^96即？附著體載體。
[0034]￡8嫩1 ^900^？？附著體載體構(gòu)建方法的具體步驟為:
611011^6106^011^110^60101^ (820.10.勵.9)將？2八⑶邱?？部分從丁2八—⑶邱?？ (8781:6111 810801611068)質(zhì)粒擴增下來，八8131、八？III酶切，連接到￡8嫩101896即？質(zhì)粒的八8131、紂III酶切位點，得到￡8嫩1 0^89001)6？？附著體載體。
[0035]￡8嫩1 0^8911(附著體載體構(gòu)建方法的具體步驟為:
用弓丨物八八八?:八 1X6八八(:(^ ( 320.10.80.10 )和
611011^66016^10^606^60101^(820.10.勵.11)將 ￠1^01? 部分從 ^2/1^(:2-031(1-1)110?〈？8 III？如16丨6(1)質(zhì)粒擴增下來，1^1*11、紅III酶切，連接到￡8嫩1質(zhì)粒的尺81*11、紅III酶切位點，得到￡8嫩1 0^8911(附著體載體。
[0036]￡8嫩1 0^9111?附著體載體構(gòu)建方法的具體步驟為:
通過點突變方法把￡8嫩1 0^8911(編碼卜如&的的第29個堿基由八到0，得到￡8嫩108891111(附著體載體。
[0037]關于其余附著體載體:8.、8？乂-1、^40、3/嫩??？，可以根據(jù)實際需求，用上述類似方法構(gòu)建。
[0038]本發(fā)明還進一步提供利用￡8嫩1 01896即？、28嫩1 0189⑶邱？？、28嫩1 0^8911(和￡8嫩1 01891111(附著體載體系統(tǒng)編輯細胞染色體的方法，這4種附著體載體系統(tǒng)使用方法相同，所以具體用￡8嫩1 0^8966？？附著體載體說明。根據(jù)編輯位點設計向?qū)и畎?，合成一?11叫，011叫退火后形成雙鏈0嫩，并且末端和3叩1酶切￡8嫩1 0389166？？附著體載體產(chǎn)生的粘性末端匹配。用14 0嫩連接酶將雙鏈0嫩片段連接到￡8嫩1 0^96即？附著體載體上，得到￡8嫩1 01896即？-成嫩。將￡8嫩1-成嫩導入到要編輯的細胞中，導入方法可以是常規(guī)的細胞轉(zhuǎn)染試劑，如111X^6(3^11111112000，也可以用電轉(zhuǎn)染的方式。轉(zhuǎn)染兩天后用適量濃度的抗性基因(亦稱篩選基因)篩選細胞，把沒有轉(zhuǎn)染的細胞殺死。不同的細胞需要的抗性基因濃度不同，需要實現(xiàn)做濃度滴定，盡量用低劑量的藥物篩選。編輯的時間會因為編輯位點和細胞類型而不同。通常情況下需要8-30天。檢測編輯效率的方法可以用該領域經(jīng)常用到的17酶或&1-1酶切法。編輯完成后將抗性基因撤除，細胞用流式細胞儀分出單克隆培養(yǎng)若干天，提取0嫩，編輯位點連接到I質(zhì)粒載體上測序。在沒有抗性基因篩選的情況下培養(yǎng)，附著體載體會逐漸從細胞中丟失。當使用￡8嫩1 018911(和￡8嫩1附著體載體時，編輯完成后撤除抗性基因培養(yǎng)3天，部分細胞在增殖過程中會丟掉附著體質(zhì)粒，然后加更昔洛韋篩選5天，殺死含有編輯質(zhì)粒的細胞，這樣可以快速得到不含編輯質(zhì)粒的細胞系。
[0039]附著體載體需要編碼在真核細胞中起作用的抗性基因。在轉(zhuǎn)染過程中一部分細胞沒有得到質(zhì)粒，需要通過藥物篩選殺死這部分細胞，只允許得到質(zhì)粒的細胞存活下來。另一方面，一部分細胞在分裂過程中附著體質(zhì)粒會丟失，因此也需要依靠藥物殺死這部分西胞。所述抗性基因可以是嘌呤霉素，新霉素，博來霉素，潮霉素等。
[0040]在同源重組時需要提供與酶切位點有同源性的供體0嫩，附著體質(zhì)粒靶向核酸內(nèi)切酶分子與供體載體的比率可以并且將變化。通常，附著體質(zhì)粒與供體質(zhì)粒的比率范圍可以是約1:10至約10:1。在各個實施方案中，附著體質(zhì)粒與供體質(zhì)粒的比率可以是約1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1 或 10:1。
[0041]靶向編輯染色體序列的頻率可以并且將根據(jù)多種因素變化。在一些實施方案中，編輯的頻率可以是大于約 0.1%、0.3%、1%、3%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或100%?？梢允褂帽绢I域熟知的技術分離單一細胞克隆，其包含編輯的染色體序列。本領域技術人員熟悉用于產(chǎn)生對所編輯染色體序列純合的細胞的方法。換而言之，細胞可以對所編輯的染色體序列是雜合或純合的。
[0042]本發(fā)明還提供構(gòu)建附著體載體基因編輯的試劑盒，該試劑盒中含有:
(1)編碼靶向核酸內(nèi)切酶和篩選基因的附著體載體；
(2)用于檢測編輯位點的？(?的引物；
(3)14連接酶和連接緩沖液。
[0043]本發(fā)明試劑盒中，所述編碼靶向核酸內(nèi)切酶和篩選基因的附著體載體，可以是上述的287、8—、8？7-1、^40、3/嫩??？中的一種，這類0嫩載體的共同特征是能夠在真核細胞中復制擴增。
[0044]本發(fā)明試劑盒中，所述靶向核酸內(nèi)切酶可以是上述鋅指核酸酶(2剛 ?、大范圍核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應物核酸酶(從⑶吣或者規(guī)律成簇間隔短回文重復中的一種。
[0045]本發(fā)明試劑盒中，所述附著體載體助181:6111-8211~1~(即28乂系統(tǒng))，具體可以是上述構(gòu)建的幾種質(zhì)粒:￡8嫩1 01896即？、28嫩1 088911(, 088911(,
[0046]本發(fā)明適用于各種真核生物細胞的基因組編輯。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1為本發(fā)明的4種附著體載體結(jié)構(gòu)。其中，圖1八展示了 ￡8嫩1附著體載體的結(jié)構(gòu)，它是表達一個向?qū)?嫩(成嫩)、一個0189蛋白、一個嘌呤霉素抗性基因(？111~0 )和一個綠色熒光蛋白(一即？)的附著體0嫩(四乂)系統(tǒng)。圖18展示了 ￡8嫩1 0189。0邱？？附著體載體的結(jié)構(gòu)，它是表達一個向?qū)?成^0、一個￠^189蛋白、一個嘌呤霉素抗性基因(戶!!!^)和一個熒光蛋白(⑶邱?？)的附著體0嫩(四乂)系統(tǒng)。圖1(:展示了 ￡8嫩1 088911(附著體載體的結(jié)構(gòu)，它是表達一個向?qū)?成^0、一個￠^89蛋白、一個嘌呤霉素和抗性基因和1型單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶認的融合蛋白(叩抓讓)的附著體載體(四乂)系統(tǒng)。圖10展示了 ￡8嫩1 附著體載體的結(jié)構(gòu)。與￡8嫩1 018911(附著體載體相比，它只在(^89編碼區(qū)哈有一個010八突變，其余相同。01*1？是質(zhì)粒在真核生物細胞內(nèi)的復制起始位點序列，￡8嫩1編碼的蛋白與01*1？序列相互作用起始質(zhì)粒的復制。04是在原核生物中起作用的復制起始位點序列；如1？是氨芐抗性基因。
[0048]圖2為在冊1(293細胞中用￡8嫩1 0^96即？附著體載體編輯湖9位點的結(jié)果。圖2八是檢測編輯位點的序列，下劃線部分是成嫩識別序列，紅色標記是？八1序列，綠色部分是&101酶切位點。圖28是產(chǎn)物的&101酶切凝膠電泳圖，用于檢測編輯效率。如果所述位點被編輯，8801位點就會被破壞，導致&^1無法切斷。圖2(:是編輯效率的定量圖，縱軸是編輯的0嫩占總0嫩的百分比，橫軸是編輯的天數(shù)。
[0049]圖3為在冊1(293細胞中用￡8嫩1 0^89001)6？？附著體載體編輯21X1位點的結(jié)果。圖3八是檢測編輯位點的序列，下劃線部分是V識別序列，紅色標記是？八1序列，綠色與紅色部分是八861酶切位點。圖38是？(?產(chǎn)物的酶切凝膠電泳圖，用于檢測編輯效率。如果所述位點被編輯，^61位點就會被破壞，導致無法切斷。圖3(:是編輯效率的定量圖，縱軸是編輯的0嫩占總0嫩的百分比，橫軸是編輯的天數(shù)。
[0050]圖4為在冊1(293細胞中用￡8嫩1 ^8911(附著體載體編輯⑶1X28位點的結(jié)果。圖4八是檢測編輯位點的序列，下劃線部分是成嫩識別序列，紅色標記是？八1序列，綠色部分是酶切位點。圖48是？(?產(chǎn)物的酶切凝膠電泳圖，用于檢測編輯效率。如果所述位點被編輯，位點就會被破壞，導致無法切斷。圖4(:是編輯效率的定量圖，縱軸是編輯的0嫩占總0嫩的百分比，橫軸是編輯的天數(shù)。
[0051]圖5為在冊1(293細胞中用￡8嫩1 0^8966？？附著體載體編輯011*1八位點的結(jié)果。圖5八是檢測編輯位點的序列，下劃線部分是V識別序列，紅色標記是？八1序列，綠色與紅色部分是80X1酶切位點。圖58是產(chǎn)物的011*1八酶切凝膠電泳圖，用于檢測編輯效率。如果所述位點被編輯，011*1八位點就會被破壞，導致011*1八無法切斷。圖5(:是編輯效率的定量圖，縱軸是編輯的0嫩占總0嫩的百分比，橫軸是編輯的天數(shù)。
[0052]圖6展示用￡8嫩1 0^8966？？附著體載體同時表達2個向?qū)？嫩(成嫩)的系統(tǒng)，用于同時編輯兩個基因組位點。01-1？是質(zhì)粒在真核生物細胞內(nèi)的復制起始位點序列，￡8嫩1編碼的蛋白與01*1？序列相互作用起始質(zhì)粒的復制。01-1是在原核生物中起作用的復制起始位點序列；八1^是氨芐抗性基因。
[0053]圖7為￡8嫩1 0^8966？？附著體載體在冊1(293細胞中編輯011*1八和21X1位點的結(jié)果。圖7八是產(chǎn)物的011*1八酶切凝膠電泳圖，用于檢測編輯效率。如果所述位點被編輯，011*1八位點就會被破壞，導致011*1八無法切斷。圖78是編輯效率的定量圖，縱軸是編輯的0嫩占總0嫩的百分比，橫軸是編輯的天數(shù)。圖7(:是產(chǎn)物的21X1酶切凝膠電泳圖，用于檢測編輯效率。如果所述位點被編輯，21X1位點就會被破壞，導致21X1無法切斷。圖70是編輯效率的定量圖，縱軸是編輯的0嫩占總0嫩的百分比，橫軸是編輯的天數(shù)。
[0054]圖8展示了用￡8嫩1 0^891111(附著體載體同時表達2個向?qū)？嫩(成嫩)的附著體系統(tǒng)，這兩個向?qū)и嗄劬嚯x很近，通過雙切口產(chǎn)生0嫩雙鏈斷裂。01*1？是質(zhì)粒在真核生物細胞內(nèi)的復制起始位點序列，￡8嫩1編碼的蛋白與01*1？序列相互作用起始質(zhì)粒的復制。01-1是在原核生物中起作用的復制起始位點序列是氨芐抗性基因。
[0055]圖9為在冊1(293細胞中用圖8質(zhì)粒編輯21X1位點的結(jié)果。21X1位點與圖3所述位點相同。圖9八的下劃線部分標明了兩個成嫩序列，綠色部分是酶切位點。圖98是產(chǎn)物的21X1酶切凝膠電泳圖，用于檢測編輯效率。如果所述位點被編輯，21X1位點就會被破壞，導致21X1無法切斷。圖％是編輯效率的定量圖，縱軸是編輯的0嫩占總0嫩的百分比，橫軸是編輯的天數(shù)。
[0056]圖10為在冊1(293細胞中用圖6 ￡8嫩1 038966？？質(zhì)粒刪除21X1位點的一個281堿基對的結(jié)果。圖104的下劃線部分標明了兩個成“V序列。圖108是檢測刪除結(jié)果的？(?凝膠電泳圖。刪除片段第三天就可以檢測到，并隨著時間增加。

【具體實施方式】
[0057]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。本實施例僅僅用于對本發(fā)明的說明，不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
[0058]實施例1:利用￡8嫩1附著體載體編輯—基因座
以下實施例詳述利用￡8嫩1附著體載體編輯—基因座，靶位點的序列為 5’ - ^6^6^0X^60X6^60X0X066 -3’ (820.10.勵.12),最后的序列是編輯所必須的？八1序列。20萬個人冊1(293細胞用1 ^ 8圖1八所述￡8嫩1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在孵育一日后，用21^/1111的嘌呤霉素篩選。第1、3、6、9和12天分別提取0嫩鑒定酶切效率。編輯的地方有一個&酶切位點((^(^扣)，已經(jīng)用綠色標記出來(圖2八)。編輯發(fā)生后這個位點被破壞，？⑶產(chǎn)物無法被&^1切開，從而通過酶切可以鑒定效率。由圖28可以看出剛轉(zhuǎn)染第1天編輯沒有發(fā)生，靶位點完全可以被&^1切開.隨著時間的推移越來越多的靶位點被編輯.到了第9天幾乎100%的靶位點被編輯完成。
[0059]實施例2:利用￡8嫩1 0189⑶邱?？附著體載體編輯21X1基因座
以下實施例詳述利用￡8嫩1 0^89001)6？？附著體載體編輯21X1位點。用如圖18所示的￡8嫩1 0^89001)6？？附著體載體表達21X1的導向I？嫩。靶位點的序列為5’ -^6660X000^X0^0^X0^0066 -3’ (820.10.勵.13),最后的序列是 0^13？尺/0189 編輯所必須的？八1序列。20萬個人冊1(293細胞用1 ^ 8圖1八所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在孵育一日后，用2呢加1的嘌呤霉素篩選。第1、3、6、9、12、18天分別提取0嫩鑒定酶切效率。0？13？1^0189編輯的地方有一個八陰〗酶切位點(八，已經(jīng)用綠色標記出來(圖3八)。編輯發(fā)生后這個位點被破壞，？⑶產(chǎn)物無法被八861切開，從而通過酶切可以鑒定效率。由圖38可以看出剛轉(zhuǎn)染第1天編輯沒有發(fā)生，靶位點完全可以被八陰1切開.隨著時間的推移越來越多的靶位點被編輯.到了第18天幾乎100%的靶位點被編輯完成。
[0060]實施例3:利用￡8嫩1 (^91?附著體載體編輯⑶1X28基因座以下實施例詳述利用￡8嫩1 088911(附著體載體編輯現(xiàn)1吧8基因。用如圖所示的￡8嫩1 088911(附著體載體表達⑶爪28的導向I？嫩。靶位點的序列為5’ -1X006^06^66X6600^X0^66 -3’ (820.10.勵.14),最后的八(? 序列是(^1^^/0189 編輯所必須的？八1序列。20萬個人冊1(293細胞用1 ^ 8圖1八所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在孵育一日后，用2呢加1的嘌呤霉素篩選。第1、3、6、9、12、18和22天分別提取0嫩鑒定酶切效率。0^13？尺/0189編輯的地方有一個酶切位點，已經(jīng)用綠色標記出來(圖4八)。編輯發(fā)生后這個位點被破壞，？⑶產(chǎn)物無法被切開，從而通過酶切可以鑒定效率。由圖48可以看出剛轉(zhuǎn)染第1天編輯沒有發(fā)生，靶位點完全可以被1^1切開.隨著時間的推移越來越多的靶位點被編輯.到了第22天65%的靶位點被編輯完成。
[0061]實施例4:利用￡8嫩1 0^8966？？附著體載體編輯011*1八基因座
以下實施例詳述011*1八位點的編輯。用如圖1八所示的￡8嫩1附著體載體表達01胱1八的導向I？嫩。靶位點的序列為5’- 00^X0X6^6600^60^60^X66 -3’ (820.10.^0.20 萬個人冊1(293 細胞用1^8圖1八所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在孵育一日后，用21118/1111的嘌呤霉素篩選。第1、3、6、9、12、18和22天分別提取0嫩鑒定酶切效率。0？13？1^0189編輯的地方有一個80X1酶切位點仏(:1(?)，已經(jīng)用綠色標記出來(圖5八)。編輯發(fā)生后這個位點被破壞，？⑶產(chǎn)物無法被80X1切開，從而通過酶切可以鑒定效率。由圖58可以看出剛轉(zhuǎn)染第1天編輯沒有發(fā)生，靶位點完全可以被80X1切開.隨著時間的推移越來越多的靶位點被編輯.到了第12天大約100%的靶位點被編輯完成。
[0062]實施例5:利用￡8嫩1附著體載體同時編輯011*1八和21X1基因座以下實施例詳述在一個細胞中同時對011*1八和21X1位點的編輯。用如圖6所示的
￡8嫩1 088966？？附著體載體同時表達01胱1八和21X1位點的導向I？嫩。20萬個人冊1(293細胞用1^8圖6所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在孵育一日后，用21118/1111的嘌呤霉素篩選。第1、3、6、9、
12、15、18和22天分別提取0嫩鑒定酶切效率。由圖7八可以看出轉(zhuǎn)染后第18天011*1八位點編輯效率接近100%，轉(zhuǎn)染后第22天21X1靶位點編輯完成90%。
[0063]實施例6:利用￡8嫩1 0^9111?附著體載體編輯21X1基因座
以下實施例詳述利用雙切口技術(如油匕11141118)編輯21X1基因座。如圖8所示，￡8嫩1 0^891111(附著體載體表達21X1的兩個導向I？嫩。這個載體表達的0189內(nèi)切酶含有010八突變，只能在導向I？嫩引導下定點切割0嫩單鏈，兩個距離合適的單鏈斷裂可以形成0嫩雙鏈斷裂。這種方法需要兩個靶位點同時切割才能產(chǎn)生突變，因而增強了切割的特異性。革巴位點的序列為5’- 160600^00661X6^X6X6^X66 -3，(320.10.勵.16)和51 -0^06^60^6600^16666^66 -3’ (820.10.^0.17)(見圖恥)。20 萬個人冊1(293 細胞用1 0 8圖8所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在孵育一日后，用21118/1111的嘌呤霉素篩選。第1、3、6、9、12、15、18和22天分別提取0嫩鑒定酶切效率。編輯的地方有一個八陰1酶切位點(八，已經(jīng)用綠色標記出來(圖9八)。編輯發(fā)生后這個位點被破壞，？⑶產(chǎn)物無法被八陰1切開，從而通過酶切可以鑒定效率。由圖98可以看出剛轉(zhuǎn)染第1天編輯沒有發(fā)生，第22天靶位點編輯完成80%。
[0064]實施例7:利用￡8嫩1 0^96即？附著體載體在21X1基因座刪除281堿基片段以下實施例詳述利用￡8嫩1 0^8966？？附著體載體在21X1基因座敲除281堿基片段。如圖6所示，￡8嫩1 0^8966？？附著體載體表達21X1的兩個導向I？嫩，靶位點的序列為5’ -^660000^6X660X60X0X6666 -3’(320.10.80.18)-3’
(820.10.勵.19)(見圖104)。20萬個人冊1(293細胞用1 ^ 8圖8所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在孵育一日后，用2呢加1的嘌呤霉素篩選。第1、3、6、9、12、15、18、21、24、27和30天分別提取0嫩用？⑶初步鑒定酶切效率。由圖108可以看出剛轉(zhuǎn)染第1天編輯沒有發(fā)生，第3天可以檢測到0嫩片段刪除，第12天后編輯基本上完成，單是仍然有部分沒有編輯的0嫩條帶。
[0065] 本發(fā)明中檢測湖義位點的引物:
1601110111600166^0^0 (820.10.勵.20)
0X6X0^00^X00X6X0001 (820.10.勵.21)；
本發(fā)明中檢測21X1位點的引物:
00^X00001X0X6X6^X61 (820.10.勵.22)
66^6^1X66^6^0^066^6^ (820.10.勵.23)；
本發(fā)明中檢測011? 1八位點的引物:
66^60X66X0X61X66^6^ (820.10.勵.24)
1000^X00^X^X000^06X1 (820.10.勵.25)；
本發(fā)明中檢測⑶爪28位點的引物:
0^66^66600^66^6^X1X6 (820.10.勵.26)
16^X06^66^X0X66606 (820.10.勵.27?0
【權(quán)利要求】
1.一種用于修飾細胞的基因組編輯方法，其特征在于具體步驟為: 首先，構(gòu)建一個附著體載體編碼靶向核酸內(nèi)切酶和篩選基因； 然后，將所述附著體載體導入到細胞中，在藥物的篩選下培養(yǎng)細胞若干天，使所有的細胞中都含有附著體載體并穩(wěn)定表達靶向核酸內(nèi)切酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因組編輯方法，其特征在于所述附著體載體是病毒附著型載體:EBV、BKV、BPV-1或SV40，或者是非病毒附著型載體:S/MAR ;這類DNA載體的共同特征是能夠在真核細胞中復制擴增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因組編輯方法，其特征在于所述靶向核酸內(nèi)切酶是鋅指核酸酶、大范圍核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應物核酸酶或者規(guī)律成簇間隔短回文重復CRISPR/Cas9。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因組編輯方法，其特征在于所述靶向核酸內(nèi)切酶在特定位置切斷DNA，細胞的DNA修復系統(tǒng)通過非同源末端連接修復法或者同源重組修復法修復DNA斷裂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因組編輯方法，其特征在于所述細胞是培養(yǎng)的細胞、原代細胞、永生細胞、干細胞、誘導的多潛能干細胞或單細胞胚。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因組編輯方法，其特征在于所述細胞是人細胞、哺乳動物細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞或單細胞真核生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因組編輯方法，其特征在于所述哺乳動物細胞包括中國倉鼠卵巢細胞、由SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVI系、人胚腎系293、幼倉鼠腎細胞、小鼠Sertoli細胞、猴腎細胞、非洲綠猴腎細胞、人宮頸癌細胞、犬腎細胞、buffalo大鼠肝細胞、人肺細胞、人肝細胞、小鼠乳腺瘤細胞、大鼠肝瘤細胞、HIH/3T3細胞、人U2-0S骨肉瘤細胞、人A549細胞、人K562細胞、人HEK293細胞、人HEK293T細胞、人HCT116細胞、人MCF-7細胞和TRI細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因組編輯方法，其特征在于所述附著體載體EBV系統(tǒng)，為如下幾種質(zhì)粒之一種:EBNA1 Cas9eGFP、EBNAl Cas9copGFP、EBNAl Cas9TK、EBNAl Cas9nTK ；其中: (-)EBNAl Cas9eGFP附著體載體，含有:hSpCas9內(nèi)切酶，向?qū)NA表達系統(tǒng)，包括:hU6啟動子、后面的骨架RNA和它們之間的gRNA插入位點即SapI位點，嘌呤霉素，綠色熒光蛋白eGFP、質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件EBNAl和EBV oriP，在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨節(jié)抗性基因(Amp)和復制起始點pUC origin ； (二)EBNAlCas9copGFP附著體載體，含有:hSpCas9內(nèi)切酶，向?qū)NA表達系統(tǒng)，包括:hU6啟動子、后面的骨架RNA和它們之間的gRNA插入位點即SapI位點，嘌呤霉素、熒光蛋白copGFP，質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件EBNAl和EBV oriP，在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨節(jié)抗性基因(Amp)和復制起始點pUC origin ； (三)EBNAlCas9TK附著體載體，含有:hSpCas9內(nèi)切酶，向?qū)NA表達系統(tǒng):hU6啟動子gRNA插入位點即SapI位點、后面的骨架RNA，嘌呤霉素和I型單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSVlH的融合蛋白(purotk)、質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件EBNAl和EBV oriP,在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨節(jié)抗性基因(Amp)和復制起始點pUC origin ； (四)EBNAlCas9nTK附著體載體,含有:hSpCas9內(nèi)切酶的突變體hSpCas9n，向?qū)NA表達系統(tǒng):hU6啟動子gRNA插入位點即SapI位點、后面的骨架RNA，嘌呤霉素和I型單純皰疫病毒胸腺喃唳核苷激酶HSVlH的融合蛋白(purotk),質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件EBNAl和EBV oriP,在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨芐抗性基因(Amp)和復制起始點pUCorigin。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因組編輯方法，其特征在于利用EBNAlCas9eGFP、EBNAlCas9copGFP、EBNAl Cas9TK和EBNAl Cas9nTK附著體載體系統(tǒng)編輯細胞染色體，其中，利用EBNAl Cas9eGFP附著體載體系統(tǒng)編輯細胞染色體的具體步驟為: 根據(jù)編輯位點設計向?qū)NA，合成一對oligo，oligo退火后形成雙鏈DNA，并且末端和SapI酶切EBNAl CasOTeGFP附著體載體產(chǎn)生的粘性末端匹配用T4 DNA連接酶將雙鏈DNA片段連接到EBNAl Cas9eGFP附著體載體上，得到EBNAl Cas9eGFP-gRNA ； 將EBNAl Cas9eGFP-gRNA導入到要編輯的細胞中，轉(zhuǎn)染兩天后用適量濃度的抗性基因篩選細胞，把沒有轉(zhuǎn)染的細胞殺死，編輯的時間為8-30天； 編輯完成后將抗性基因撤除，細胞用流式細胞儀分出單克隆培養(yǎng)若干天，提取DNA，PCR編輯位點連接到T質(zhì)粒載體上測序，得到不含外源基因的編輯細胞系； 其中，所述抗性基因是嘌呤霉素，新霉素，博來霉素，或潮霉素； 利用EBNAl Cas9copGFP、EBNAl Cas9TK和EBNAl Cas9nTK附著體載體系統(tǒng)編輯細胞染色體步驟，與利用EBNAl Cas9eGFP附著體載體系統(tǒng)編輯細胞染色體的步驟相同。
10.一種用于編輯細胞基因組的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括: (1)編碼靶向核酸內(nèi)切酶和篩選基因的附著體載體； (2)用于檢測編輯位點的PCR的引物； (3)T4連接酶和連接緩沖液； 其中，所述編碼靶向核酸內(nèi)切酶和篩選基因的附著體載體，是EBV、BKV、BPV-1、SV40、S/MAR中的一種，這類DNA載體的共同特征是能夠在真核細胞中復制擴增； 所述靶向核酸內(nèi)切酶是上述鋅指核酸酶、大范圍核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應物核酸酶或者規(guī)律成簇間隔短回文重復CRISPR/Cas9中的一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于編輯細胞基因組的試劑盒，其特征在于所述附著體載體 EBV 系統(tǒng)為下述質(zhì)粒之一種:EBNAl Cas9eGFP、EBNAl Cas9TK、EBNAl Cas9TK、EBNAlCas9nT ;其中: (一)EBNAlCas9eGFP附著體載體，含有:hSpCas9內(nèi)切酶，向?qū)NA表達系統(tǒng)，包括:hU6啟動子、后面的骨架RNA和它們之間的gRNA插入位點即SapI位點，嘌呤霉素，綠色熒光蛋白eGFP、質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件EBNAl和EBV oriP，在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨節(jié)抗性基因(Amp)和復制起始點pUC origin ； (二)EBNAlCas9copGFP附著體載體，含有:hSpCas9內(nèi)切酶，向?qū)NA表達系統(tǒng)，包括:hU6啟動子、后面的骨架RNA和它們之間的gRNA插入位點即SapI位點，嘌呤霉素、熒光蛋白copGFP，質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件EBNAl和EBV oriP，在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨節(jié)抗性基因(Amp)和復制起始點pUC origin ； (三)EBNAlCas9TK附著體載體，含有:hSpCas9內(nèi)切酶，向?qū)NA表達系統(tǒng):hU6啟動子gRNA插入位點即SapI位點、后面的骨架RNA，嘌呤霉素和I型單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSVlH的融合蛋白(purotk)、質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件EBNAl和EBV oriP,在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨節(jié)抗性基因(Amp)和復制起始點pUC origin ； (四)EBNAl Cas9nTK附著體載體,含有:hSpCas9內(nèi)切酶的突變體hSpCas9n，向?qū)NA表達系統(tǒng):hU6啟動子gRNA插入位點即SapI位點、后面的骨架RNA，嘌呤霉素和I型單純皰疫病毒胸腺喃唳核苷激酶HSVlH的融合蛋白(purotk),質(zhì)粒在真核細胞中復制的元件EBNAl和EBV oriP,在大腸桿菌中擴增質(zhì)粒用的氨芐抗性基因(Amp)和復制起始點pUCorigin。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450785SQ201410733267
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】王永明, 麥瑞天, 陳少波 申請人:復旦大學