一種利用重編程制備豬神經(jīng)干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用重編程制備豬神經(jīng)干細(xì)胞的方法，本發(fā)明提供了一種利用重編程制備哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：1）將基因OCT3/4、SOX2、KLF4、LMyc和LIN28用非整合型附著體載體共同導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，2）用包含丁酸鈉的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，即得到神經(jīng)干細(xì)胞；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用非整合型附著體載體（episomal載體）將OCT3/4、SOX2、KLF4、LMyc和LIN28等因子導(dǎo)入豬體細(xì)胞，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，將體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)一步分化獲得有生理活性的神經(jīng)細(xì)胞，為以豬為模型的神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】一種利用重編程制備豬神經(jīng)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種利用重編程制備豬神經(jīng)干細(xì)胞的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)研究和神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞治療中具有廣闊的前景。長期以來，神經(jīng)干細(xì)胞的來源始終局限于胎腦或經(jīng)由多能干細(xì)胞的定向分化，嚴(yán)重限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。目前，一種新型的轉(zhuǎn)分化技術(shù)為提供了新的神經(jīng)干細(xì)胞來源。神經(jīng)轉(zhuǎn)分化技術(shù)是直接將成體終末分化細(xì)胞特定向轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞的技術(shù)。該技術(shù)不需要經(jīng)過多能干細(xì)胞階段，就可快速直接的獲得神經(jīng)細(xì)胞材料，因此將在神經(jīng)修復(fù)性治療中得到廣泛應(yīng)用。目前神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化已在小鼠和大鼠等生物成功實(shí)現(xiàn)。然而，小鼠和大鼠在體形特征、生理特性、壽命等方面與人存在很大的差異，因而利用其作為模式生物模擬人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病和治療存在明顯的缺陷。相對(duì)而言，豬在解剖、生理生化和代謝等方面與人更為近似，在器官大小、免疫學(xué)和物種演化上也與人接近，因此建立豬的神經(jīng)干細(xì)胞系更有利于研究疾病機(jī)制和探索有效的治療模式。
[0003]迄今為止，以體細(xì)胞為起始材料獲得豬神經(jīng)細(xì)胞均是通過重編程實(shí)現(xiàn)的，即通過病毒載體將重編程因子導(dǎo)入豬體細(xì)胞，誘導(dǎo)體細(xì)胞重新獲得多能性；進(jìn)一步對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化，產(chǎn)生具有重要科研價(jià)值和臨床價(jià)值的神經(jīng)細(xì)胞(Jeong-Yeh Yang, Jennifer L.Mumaw, Yubing Liu, Steve L.Stice and Franklin D.West.SSEA4Positive Pig Induced Pluripotent Stem Cells Are Primed for Differentiationinto Neural Cells.Cell T ransplantation.2013; 22 (6): 945-59.)。然而與其他物種的重編程不同，在對(duì)豬體細(xì)胞重編程過程中引入的外源重編程因子無法沉默，因而獲得的細(xì)胞為持續(xù)表達(dá)外源干性基因和內(nèi)源干性基因的非經(jīng)典誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ToshihikoEzashi,Bhanu Prakash V.L.Telugu, Andrei P.Alexenko, Shrikesh Sachdev, SunilimaSinha, and R.Michael Roberts.Derivation of induced pluripotent stem cells frompig somatic cells.PNAS.2009.106 (27): 10993-10998.)D 在此基礎(chǔ)上定向分化產(chǎn)生的神經(jīng)干細(xì)胞，在應(yīng)用于基礎(chǔ)研究或臨床研究時(shí)，具有不可避免的偏見性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種利用重編程制備哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞的方法。
[0005]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0006]I)將基因0CT3/4、S0X2、KLF4、LMyc和LIN28用非整合型附著體載體共同導(dǎo)入離體的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，
[0007]2)用丁酸鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，即得到神經(jīng)干細(xì)胞；
[0008]所述基因0CT3/4的核苷酸序列為序列表中的序列I ;
[0009]所述基因S0X2的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；
[0010]所述基因KLF4的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；[0011 ] 所述基因LMyc的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；
[0012]所述基因LIN28的核苷酸序列為序列表中的序列5。
[0013]上述方法中，所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞為哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞具體為哺乳動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞。
[0014]上述方法中，所述非整合型附著體載體為Episomal質(zhì)粒載體。
[0015]上述方法中，所述共同導(dǎo)入的方法包括如下步驟:將表達(dá)0CT3/4的Episomal載體、表達(dá)S0X2和KLF4的Episomal載體、表達(dá)LMyc和LIN28的Episomal載體和表達(dá)標(biāo)記基因的載體共同導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中。
[0016]上述方法中，所述表達(dá)0CT3/4的Episomal載體為pCXLE_h0CT3/4 ；
[0017]所述表達(dá)S0X2 和 KLF4 的 Episomal 載體為 pCXLE-hSK ；
[0018]所述表達(dá)LMyc 和 LIN28 的 Episomal 載體為 pCXLE-hUL ；
[0019]所述標(biāo)記基因?yàn)镋GFP，所述EGFP的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；
[0020]所述表達(dá)標(biāo)記基因的載體為pCXLE-EGFP。
[0021]上述方法中，所述表達(dá)0CT3/4的Episomal載體、表達(dá)S0X2和KLF4的Episomal載體、表達(dá)LMyc和LIN28的Episomal載體和表達(dá)標(biāo)記基因的載體等質(zhì)量導(dǎo)入共同導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中。
[0022]上述方法中，所述`用丁酸鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包括如下步驟:
[0023]I)將所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞接種在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞培
養(yǎng)基中培養(yǎng)；
[0024]2)將所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞培養(yǎng)基替換為含有50-200 μ M 丁酸鈉的多能干細(xì)胞培
養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0025]3)將所述含有50-200 μ M 丁酸鈉的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基替換為無丁酸鈉的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)至得到克隆樣細(xì)胞；
[0026]4)將所述克隆樣細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞。
[0027]上述方法中，步驟I)中，所述培養(yǎng)為連續(xù)培養(yǎng)，所述培養(yǎng)的時(shí)間為1-2天。
[0028]步驟2)中，所述培養(yǎng)的時(shí)間為3-4天。
[0029]步驟3)中，所述繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為3-4周。
[0030]步驟4)中，所述繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為4-5天。
[0031]上述方法中，所述哺乳動(dòng)物為人、大鼠、小鼠、猴、狗、貓、牛、兔、馬或豬；所述哺乳動(dòng)物具體為豬；
[0032]所述多能干細(xì)胞培養(yǎng)基為CDF12培養(yǎng)基.[0033]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由哺乳動(dòng)物體細(xì)胞獲得哺乳動(dòng)物功能性神經(jīng)細(xì)胞的方法。
[0034]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0035]I)按照上述的方法進(jìn)行，得到哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞；
[0036]2)將所述哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到哺乳動(dòng)物功能性神經(jīng)細(xì)胞；
[0037]所述哺乳動(dòng)物為人、大鼠、小鼠、猴、狗、貓、牛、兔、馬或豬；所述哺乳動(dòng)物具體為豬；[0038]所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞為哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞,所述哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞具體為哺乳動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞；
[0039]所述哺乳動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞具體為豬胚胎成纖維細(xì)胞；
[0040]所述功能性神經(jīng)細(xì)胞為Tujl陽性的神經(jīng)元或GFAP陽性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
[0041]其中，涉及的培養(yǎng)基如下:
[0042]豬體細(xì)胞培養(yǎng)基配方:
[0043]DMEM/F12(Invitrogen,11320-033)
[0044]0.1mM 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)
[0045]ImM GlutaMAX? 二妝(Invitrogen, 35050-061)
[0046]1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen，15070-063)
[0047]10% 胎牛血清(Hyclone，SH30084.83)
[0048]cDF12培養(yǎng)基配方:
[0049]DMEM/F12(Invitrogen,11320-033)
[0050]0.1mM 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)
[0051]ImM GlutaMAX? `二妝(Invitrogen, 35050-061)
[0052]20%Knockout 血清替代物(Invitrogen, N10828-028)
[0053]1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen，15070-063)
[0054]55 μ Μβ-疏基乙酉享(Invitrogen, 21985-023)
[0055]10ng/ml 人 FGF2(Joint Protein Central)
[0056]神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基配方:
[0057]DMEM/F12(Invitrogen,I1320-033)
[0058]0.1mM 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)
[0059]ImM GlutaMAX? 二妝(Invitrogen, 35050-061)
[0060]1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen，15070-063)
[0061]1%Ν-2 添加劑(Invitrogen，17502-048)
[0062]2% B-27? 添加劑(Invitrogen, 0080085-SA)
[0063]神經(jīng)分化培養(yǎng)基:
[0064]DMEM/F12 (Invitrogen,11320-033)
[0065]0.1mM 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)
[0066]ImM GlutaMAX? 二妝(Invitrogen, 35050-061)
[0067]1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen，15070-063)
[0068]P/oN-2 添加劑(Invitrogen，17502-048)
[0069]步驟2)中，所述培養(yǎng)為連續(xù)培養(yǎng)，所述培養(yǎng)的時(shí)間為3-4周。
[0070]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用非整合型附著體載體(印isomal載體)將0CT4，S0X2，KLF4、LMyc和LIN28等因子導(dǎo)入豬體細(xì)胞，利用丁酸鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)，將體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)一步分化獲得有生理活性的神經(jīng)細(xì)胞，為以豬為模型的神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)。
[0071]預(yù)期本發(fā)明所含技術(shù)將在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用方面產(chǎn)生重要意義。與鼠等小動(dòng)物不同，以豬為代表的大動(dòng)物模型在神經(jīng)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究中有著無可比擬的價(jià)值。目前已經(jīng)產(chǎn)生了包括帕金森病、老年癡呆、自閉癥等豬模型，很好的重現(xiàn)了神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀。因而本發(fā)明轉(zhuǎn)分化產(chǎn)生的豬神經(jīng)干細(xì)胞是用于評(píng)價(jià)神經(jīng)細(xì)胞移植治療效果和安全性的重要移植材料。同時(shí)，結(jié)合轉(zhuǎn)基因豬疾病模型，還能夠建立用于篩選神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療藥物的個(gè)性化藥物篩選平臺(tái)。
[0072]總之，通過表達(dá)載體直接從豬成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞及其衍生的神經(jīng)細(xì)胞，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和臨床提供大量用于疾病模擬和治療性移植的細(xì)胞移植材料，并且應(yīng)用于治療神經(jīng)退行性疾病的藥物篩選和安全評(píng)估。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0073]圖1為本發(fā)明的總體技術(shù)方案
[0074]圖2為豬誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞各相關(guān)分子標(biāo)志物的鑒定
[0075]圖3為由豬誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞體外定向分化的神經(jīng)細(xì)胞的分子標(biāo)志物和生理功能
鑒定
[0076]圖4為豬誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞小鼠腦內(nèi)移植后存活和神經(jīng)整合能力的鑒定【具體實(shí)施方式】
[0077]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0078]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0079]下述實(shí)施例中的細(xì)胞培養(yǎng)條件如無特殊說明，均為37攝氏度，5%C02。
[0080]下述實(shí)施例中的細(xì)胞培養(yǎng)基配方如下:
[0081]豬體細(xì)胞培養(yǎng)基配方:
[0082]DMEM/F12 (Invitrogen,11320-033)
[0083]0.1mM 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)
[0084]ImM GlutaMAX? 二肽(Invitrogen，35050-061)
[0085]1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen, 15070-063)
[0086]10% 胎牛血清(Hyclone，SH30084.83)
[0087]cDF12培養(yǎng)基配方:
[0088]DMEM/F12 (Invitrogen,11320-033)
[0089]0.1mM 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)
[0090]ImM GlutaMAX? 二肽(Invitrogen，35050-061)
[0091]20%Knockout 血清替代物(Invitrogen, N10828_028)
[0092]1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen，15070-063)
[0093]55 μ Μβ-疏基乙酉享(Invitrogen, 21985-023)
[0094]10ng/ml 人 FGF2(Joint Protein Central)
[0095]神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基配方: [0096]DMEM/F12 (Invitrogen,11320-033)
[0097]0.1mM 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)
[0098]1mM GlutaMAX? 二肽(Invitrogen，35050-061)
[0099]1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen，15070-063)[0100]1%Ν-2 添加劑(Invitrogen，17502-048)
[0101]2% B27? 添加劑(Invitrogen，0080085-SA)
[0102]神經(jīng)分化培養(yǎng)基:
[0103]DMEM/F12(Invitrogen,11320-033)
[0104]0.1mM 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)
[0105]ImM GlutaMAX? 二妝(Invitrogen, 35050-061)
[0106]1% 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen，15070-063)
[0107]1%Ν-2 添加劑(Invitrogen，17502-048)
[0108]下述實(shí)施例中的qPCR檢測(cè)中使用的引物序列如表1所示:
[0109]表1為qPCR檢測(cè)中使用的弓丨物序列
[0110]
[0111]
【權(quán)利要求】
1.一種利用重編程制備哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞的方法，包括如下步驟: 1)將基因0CT3/4、S0X2、KLF4、LMyc和LIN28用非整合型附著體載體共同導(dǎo)入離體的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞， 2)用丁酸鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，即得到神經(jīng)干細(xì)胞； 所述基因0CT3/4的核苷酸序列為序列表中的序列I ; 所述基因S0X2的核苷酸序列為序列表中的序列2 ； 所述基因KLF4的核苷酸序列為序列表中的序列3 ； 所述基因LMyc的核苷酸序列為序列表中的序列4 ； 所述基因LIN28的核苷酸序列為序列表中的序列5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞為哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞具體為哺乳動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述非整合型附著體載體為Episomal質(zhì)粒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于: 所述共同導(dǎo)入的方法包括如下步驟:將表達(dá)0CT3/4的Episomal載體、表達(dá)S0X2和KLF4的Episomal載體、表達(dá)LMyc和LIN28的Episomal載體和表達(dá)標(biāo)記基因的載體共同導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于: 所述表達(dá) 0CT3/4 的 Episomal 載體為 pCXLE_hOCT3/4 ； 所述表達(dá)S0X2和KLF4的Episomal載體為pCXLE-hSK ； 所述表達(dá)LMyc和LIN28的Episomal載體為pCXLE-hUL ； 所述標(biāo)記基因?yàn)镋GFP，所述EGFP的核苷酸序列為序列表中的序列6 ； 所述表達(dá)標(biāo)記基因的載體為pCXLE-EGFP。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法,其特征在于:所述表達(dá)0CT3/4的Episomal載體、表達(dá)S0X2和KLF4的Episomal載體、表達(dá)LMyc和LIN28的Episomal載體和表達(dá)標(biāo)記基因的載體等質(zhì)量導(dǎo)入共同導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述用丁酸鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包括如下步驟: 1)將所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞接種在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 2)將所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞培養(yǎng)基替換為含有50-200μ M 丁酸鈉的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)； 3)將所述含有50-200μ M 丁酸鈉的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基替換為無丁酸鈉的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)至得到克隆樣細(xì)胞； 4)將所述克隆樣細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述培養(yǎng)為連續(xù)培養(yǎng)，所述培養(yǎng)的時(shí)間為1-2天。 步驟2)中，所述培養(yǎng)的時(shí)間為3-4天。步驟3)中，所述繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為3-4周。 步驟4)中，所述繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為4-5天。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于: 所述哺乳動(dòng)物為人、大鼠、小鼠、猴、狗、貓、牛、兔、馬或豬；所述哺乳動(dòng)物具體為豬； 所述多能干細(xì)胞培養(yǎng)基為cDF12培養(yǎng)基。
10.一種由哺乳動(dòng)物體細(xì)胞獲得哺乳動(dòng)物功能性神經(jīng)細(xì)胞的方法，包括如下步驟: O按照權(quán)利要求1-9中任一所述的方法進(jìn)行，得到哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞； 2)將所述哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到哺乳動(dòng)物功能性神經(jīng)細(xì)胞； 所述哺乳動(dòng)物為人、大鼠、小鼠、猴、狗、貓、牛、兔、馬或豬；所述哺乳動(dòng)物具體為豬； 所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞為哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞具體為哺乳動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞； 所述哺乳動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞具體為豬胚胎成纖維細(xì)胞； 所述功能性神經(jīng)細(xì)胞為Tujl陽性的神經(jīng)元或GFAP陽性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/0793GK103740757SQ201410027420
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】劉光慧, 曲靜, 徐秀玲, 付麗娜, 楊濟(jì)平, 任若通, 劉林, 劉凱 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生物物理研究所