本發(fā)明涉及一種支架材料，尤其涉及一種由若干種材料交聯(lián)而成的支架材料，具有促進(jìn)干細(xì)胞分化的作用，以及制取的方法和用途。

背景技術(shù)：

外傷骨折、炎癥、腫瘤和先天異常等均會(huì)造成骨缺損，將人工支架材料植入骨缺損處是國(guó)際公認(rèn)的骨缺損修復(fù)方法。目前在研的生物支架普遍存在生物惰性問(wèn)題，主要表現(xiàn)為缺乏骨誘導(dǎo)活性，不能有效誘導(dǎo)自體骨再生，尤其對(duì)于眼眶骨這類骨壁菲薄，骨髓腔少，局部血供差，骨再生能力弱的骨組織，缺損骨的自我修復(fù)更加困難。為了提高支架材料的骨誘導(dǎo)活性，有大量研究利用干細(xì)胞基因調(diào)控(Int.J.Mol.Med.，2010，26，517～525)和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)等方法(PNAS，2014，111，12847～12852；Biomacromolecules，2014，15，1019～1030)提高支架材料修復(fù)骨缺損的能力，但是卻面臨生物安全性、生長(zhǎng)因子活性和經(jīng)濟(jì)成本等新的問(wèn)題。因此，從根本上提高支架材料的生物活性是發(fā)展組織工程支架材料的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種支架材料，具有良好生物活性，不僅可以通過(guò)納米材料的化學(xué)活性誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化，而且能夠通過(guò)支架材料表面微納結(jié)構(gòu)調(diào)控干細(xì)胞的分化。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種支架材料，不僅可以通過(guò)納米材料的化學(xué)活性誘導(dǎo)干細(xì)胞的骨向分化，而且能夠通過(guò)支架材料表面微納結(jié)構(gòu)調(diào)控干細(xì)胞骨向分化。

本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種制取支架材料的方法，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)制備具有良好促進(jìn)組織再生功能的納米復(fù)合生物活性支架。

本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種制取支架材料的方法，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)制備具有良好促進(jìn)骨再生功能的納米復(fù)合生物活性支架。

本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種支架材料在組織修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種支架材料，在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。

一種支架材料，其內(nèi)部為多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率為90％以上，空隙外徑為200±10μm。

另一種支架材料，其表面的羥基含量為40mol％～50mol％。使用boehm滴定法可對(duì)支架材料表面的官能團(tuán)進(jìn)行定量分析

另一種支架材料，其表面的羧基含量為40mol％～50mol％。使用boehm滴定法可對(duì)支架材料表面的官能團(tuán)進(jìn)行定量分析。

另一種支架材料，其表面具有羧基和羥基等基團(tuán)，還具有納米級(jí)的凸起結(jié)構(gòu)，凸起高度為1nm～100nm。

另一種支架材料，包括碳基納米材料，天然高分子和一維無(wú)機(jī)納米材料，碳基納米材料與天然高分子之間經(jīng)由酰胺鍵互交聯(lián)，天然高分子之間經(jīng)由酰胺鍵自交聯(lián)，一維無(wú)機(jī)納米材料吸附于天然高分子。

另一種支架材料，按重量份，包括0.1～1碳基納米材料、1～5天然高分子和1～5一維無(wú)機(jī)納米材料。

碳基納米材料如：但不僅限于氧化石墨烯，石墨烯量子點(diǎn)和碳納米管等。

天然高分子材料如：但不僅限于膠原蛋白，水溶性殼聚糖和絲素蛋白等。

一維無(wú)機(jī)納米材料如：但不僅限于納米羥基磷灰石納米粒子(nHA)、納米二氧化硅納米粒子(nSiO₂)等，粒徑為1nm～100nm。

一種制取支架材料的方法，包括如下步驟：

先制得濃度1w/v％～5w/v％天然高分子(如：2w/v％)和濃度0.1w/v％～1w/v％碳基納米材料(如：0.2w/v％)的混合液，再加入一維無(wú)機(jī)納米材料(如：濃度至1w/v％～5w/v％)，一維無(wú)機(jī)納米材料經(jīng)靜電吸附作用而吸附于天然高分子上，制得一維無(wú)機(jī)納米材料/碳基納米材料/天然高分子混合水溶液；

加入縮合劑和活化劑，攪拌均勻后，室溫靜置交聯(lián)2小時(shí)，得納米復(fù)合水凝膠；

所得納米復(fù)合水凝膠進(jìn)行預(yù)冰凍處理(如：放置-40℃冰箱里24hr)，之后進(jìn)行冷凍干燥，得到支架材料預(yù)產(chǎn)物，用去離子水超聲清洗3次，每次5分鐘，再經(jīng)冷凍干燥，得到支架材料。

縮合劑如：但不僅限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，J.Org.Chem.1961，26，2525)。

活化劑如：但不僅限于N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。

本發(fā)明的支架材料具有組織誘導(dǎo)活性，無(wú)需使用組織分化培養(yǎng)基，即能促進(jìn)接種其上的細(xì)胞(如：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞)進(jìn)行組織分化，如：

在支架材料上接種干細(xì)胞，體外非成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，待細(xì)胞貼壁增殖良好后，將納米復(fù)合支架材料移植到體內(nèi)非承重骨(如：眼眶骨和顱蓋骨)骨缺損處，移植后隨訪觀察3月，CT檢查缺損部位骨修復(fù)效果良好。

由此可見(jiàn)，在目前大部分細(xì)胞成骨分化都是在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下進(jìn)行，本發(fā)明具有在非成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境下，三維支架通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)作用和表面微納結(jié)構(gòu)作用促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。

本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果：

本發(fā)明提供的支架材料，是具有良好組織誘導(dǎo)(如：硬骨組織誘導(dǎo)和軟骨組織誘導(dǎo))活性的納米復(fù)合支架材料，不僅可以通過(guò)納米材料的化學(xué)活性誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化(如：骨向分化，以及向軟骨分化等)，而且能夠通過(guò)支架材料表面微納結(jié)構(gòu)調(diào)控干細(xì)胞的分化(如：骨向分化，以及向軟骨分化等)。

在非承重骨(如：眼眶骨和顱蓋骨)骨缺損時(shí)，作為組織工程支架體外接種干細(xì)胞后，移植在缺損部位，促進(jìn)新骨的再生并修復(fù)缺損骨組織。

附圖說(shuō)明

圖1A為本發(fā)明nHA/GO/CMC交聯(lián)10分鐘后的形貌圖；

圖1B為本發(fā)明nHA/GO/CMC交聯(lián)2小時(shí)后的形貌圖；

圖2A為本發(fā)明nHA/GO/CMC支架材料形貌圖；

圖2B為本發(fā)明nHA/GO/CMC支架材料掃描電鏡圖；

圖3為本發(fā)明細(xì)胞成骨分化后成骨相關(guān)因子基因表達(dá)水平圖；

圖4為本發(fā)明細(xì)胞成骨分化后成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平凝膠電泳圖；

圖5為本發(fā)明細(xì)胞在nHA/GO/CMC復(fù)合支架生長(zhǎng)7天后堿性磷酸酶染色結(jié)果和生長(zhǎng)14天后茜素紅染色結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明細(xì)胞在nHA/GO/CMC復(fù)合支架生長(zhǎng)7天后的熒光照片。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。

實(shí)施例1支架材料修復(fù)大鼠顱蓋骨缺損

(1)稱取4g羧甲基殼聚糖(CMC)溶解于100mL去離子水中得到4％(w/v)CMC水溶液；稱取0.4g氧化石墨烯(GO)溶解于100mL去離子水中，并超聲(200W，80％)1個(gè)小時(shí)得到黃褐色透明0.4％(w/v)GO水溶液。

(2)取5mL 4％(w/v)CMC水溶液與5mL 0.4％(w/v)GO水溶液磁力攪拌混合，再放置在超聲發(fā)生器中超聲(200W，80％)分散1h，得到2％(w/v)GO和0.2％(w/v)CMC充分混合的水溶液。

(3)稱取0.1g nHA加入到上述混合水溶液中，超聲(200W，80％)分散1h，獲得均勻分散的nHA/GO/CMC混合溶液。

(4)取上述10mL nHA/GO/CMC混合溶液中加入1mL 1mM EDC水溶液和250μL 1mM NHS水溶液并迅速攪拌均勻，將混合后的溶液放置在室溫下靜止10min，得到nHA/GO/CMC凝膠，并在室溫下再靜止2hr，得到充分交聯(lián)的nHA/GO/CMC復(fù)合凝膠(如圖1A和圖1B)。

(5)將nHA/GO/CMC復(fù)合凝膠進(jìn)行放置在-40度冰箱里進(jìn)行預(yù)冰凍處理24hr，之后放置冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，得到nHA/GO/CMC復(fù)合支架預(yù)產(chǎn)物。

(6)將nHA/GO/CMC復(fù)合支架預(yù)產(chǎn)物放置在去離子水中超聲清洗3次(每次5min)，去掉反應(yīng)副產(chǎn)物，再進(jìn)行冷凍干燥，獲得nHA/GO/CMC復(fù)合三維多孔支架待用，三維多孔支架孔徑大小為200±10μm，孔隙率為90％，支架表面呈現(xiàn)微納粗糙結(jié)構(gòu)(如圖2A和圖2B)。

(7)將nHA/GO/CMC復(fù)合三維多孔支架鋪板在6孔板中，并接種大鼠來(lái)源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)后，用非成骨分化培養(yǎng)基(10％FBS、90％DMEM培養(yǎng)基和1％青鏈霉素)培養(yǎng)細(xì)胞7天、14天后，提取細(xì)胞tRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過(guò)熒光定量PCR分析檢測(cè)成骨相關(guān)因子如：堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的基因表達(dá)水平，相對(duì)于對(duì)照組(CMC三維多孔支架、GO/CMC復(fù)合三維多孔支架)，實(shí)驗(yàn)組(nHA/GO/CMC復(fù)合三維多孔支架)基因表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05)(參見(jiàn)圖3)，同時(shí)在rBMSCs培養(yǎng)7天后，提取細(xì)胞總蛋白，從蛋白水平檢測(cè)分析成骨相關(guān)蛋白(BSP，OCN，OPN)的表達(dá)水平，結(jié)果顯示成骨相關(guān)蛋白在實(shí)驗(yàn)組(nHA/GO/CMC復(fù)合三維多孔支架)的表達(dá)水平最高(圖4)。

(8)將nHA/GO/CMC復(fù)合三維多孔支架鋪板在6孔板中，并接種大鼠來(lái)源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)后，用非成骨分化培養(yǎng)基(10％FBS、90％DMEM培養(yǎng)基和1％青鏈霉素)培養(yǎng)細(xì)胞7天后進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色，培養(yǎng)14天后進(jìn)行茜素紅(ARS)染色，染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(nHA/GO/CMC復(fù)合三維多孔支架)較對(duì)照組(CMC三維多孔支架、GO/CMC復(fù)合三維多孔支架)有明顯的細(xì)胞外基質(zhì)礦化現(xiàn)象(參見(jiàn)圖5)。

(9)將nHA/GO/CMC復(fù)合三維多孔支架修剪為直徑為5mm，高度為1.2mm原片，將1×10⁶大鼠來(lái)源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)接種在nHA/GO/CMC復(fù)合三維多孔支架上，體外用非成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，待細(xì)胞貼壁并增殖良好(如圖6)。

(10)選用6周～8周齡雌性SD大鼠，無(wú)菌狀態(tài)下使用5％戊巴比妥(劑量為3.5mg/100g)行腹腔麻醉，使用75％酒精消毒大鼠顱骨皮膚，并做1.0cm縱向切口，依次切開(kāi)皮膚、皮下組織、肌肉、骨膜層，鈍性分離骨膜，暴露顱骨組織。用外徑5mm的環(huán)鉆在大鼠顱骨上制作直徑5mm的圓形全層骨膜骨質(zhì)缺損，然后仔細(xì)沖洗創(chuàng)面，去除殘留碎骨。嚴(yán)密止血后，將上述nHA/GO/CMC復(fù)合三維多孔支架填充于缺損區(qū)，使用5-0縫線逐層縫合骨膜和皮膚。

(11)術(shù)后12周，經(jīng)腹腔注射過(guò)量戊巴比妥以處死實(shí)驗(yàn)大鼠。標(biāo)本使用4％福爾馬林固定24h。然后，將各組樣品行Micro-CT檢測(cè)，20μm層掃，并進(jìn)行三維重構(gòu)，通過(guò)系統(tǒng)自帶軟件分析新生骨體積占總體積百分比(BV/TV)，達(dá)到新骨形成量80％以上。

實(shí)施例2支架材料修復(fù)犬眼眶骨缺損

(1)稱取4g膠原蛋白(Col)溶解于100mL去離子水中得到4％(w/v)Col水溶液；稱取0.4g GO溶解于100mL去離子水中，并超聲(200W，80％)1個(gè)小時(shí)得到黃褐色透明0.4％(w/v)GO水溶液。

(2)取5mL4％(w/v)Col水溶液與5mL0.4％(w/v)GO水溶液磁力攪拌混合，再放置在超聲發(fā)生器中超聲(200W，80％)分散1h，得到2％(w/v)Col和0.2％(w/v)GO充分混合的水溶液。

(3)稱取0.2g納米二氧化硅(nSiO₂)加入到上述混合水溶液中，超聲(200W，80％)分散1h，獲得均勻分散的nSiO₂/GO/Col混合溶液。

(4)取上述10mL nSiO₂/GO/Col混合溶液中加入1mL 1mM EDC水溶液和250μL 1mM NHS水溶液并迅速攪拌均勻，將混合后的溶液放置在室溫下靜止10min，得到nSiO₂/GO/Col凝膠，并在室溫下再靜止2hr，得到充分交聯(lián)的nSiO₂/GO/Col復(fù)合凝膠。

(5)將nSiO₂/GO/Col復(fù)合凝膠進(jìn)行放置在-40度冰箱里進(jìn)行預(yù)冰凍處理24hr，之后放置冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，得到nSiO₂/GO/Col復(fù)合支架預(yù)產(chǎn)物。

(6)將nSiO₂/GO/Col復(fù)合支架預(yù)產(chǎn)物放置在超純水中超聲清洗3次(每次5min)，去掉反應(yīng)副產(chǎn)物，再進(jìn)行冷凍干燥，獲得nSiO₂/GO/Col復(fù)合三維多孔支架待用。

(7)將nSiO₂/GO/Col復(fù)合三維多孔支架修剪為直徑為8mm，高度為1.2mm原片，將1.5×10⁶犬來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(bBMSCs)接種在nSiO₂/GO/Col復(fù)合三維多孔支架上，體外用非成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，待細(xì)胞貼壁并增殖良好。

(8)選成年比格犬全麻后于下眶緣切口分離至內(nèi)下眶緣，切開(kāi)骨膜暴露眶內(nèi)側(cè)壁，模擬人眶內(nèi)下壁骨缺損的狀況，用骨科環(huán)鉆鉆除眶內(nèi)下壁直徑8mm大小的全層圓形骨組織，去除局部的骨膜和篩竇粘膜，嚴(yán)密止血后，將上述nSiO₂/GO/Col復(fù)合三維多孔支架填充于缺損區(qū)，分層關(guān)閉切口。術(shù)后3月進(jìn)行犬眼眶CT掃描，觀察眼眶骨缺損自行修復(fù)情況，新骨形成量達(dá)80％以上。測(cè)量犬雙側(cè)眼球突出度及對(duì)稱情況，并觀察眼球運(yùn)動(dòng)情況，眼球運(yùn)動(dòng)良好，對(duì)稱情況良好，并無(wú)突出。