六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，直接從加工過(guò)程中的六堡茶中提取真菌總DNA，然后采用PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)其中的真菌菌群組成。本發(fā)明避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)不能分離鑒定六堡茶中未培養(yǎng)真菌微生物的缺陷，能在較短的時(shí)間內(nèi)得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大大減少工作量和工作時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可信。該法適應(yīng)于六堡茶及六堡茶加工過(guò)程中的茶葉樣品，檢測(cè)的真菌菌群能全面包括六堡茶中的真菌種類(lèi)，能客觀有效地反映茶加工過(guò)程中六堡茶真菌菌群動(dòng)態(tài)變化，為有效揭示六堡茶發(fā)酵過(guò)程中微生物的作用機(jī)制和改進(jìn)六堡茶生產(chǎn)工藝奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黑茶生產(chǎn)過(guò)程中存在大量微生物，不同黑茶加工中微生物種類(lèi)不同，可以說(shuō)是一個(gè)以茶葉為基質(zhì)的相當(dāng)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)中，細(xì)菌、真菌、放線菌都是互相依存或相互拮抗的，而且隨著發(fā)酵推移，各類(lèi)微生物也在發(fā)生極大的變化，期間產(chǎn)生大量?jī)?nèi)含物質(zhì)，如可溶性多糖、多酚、蛋白酶等。因此，研究黑茶加工中的微生態(tài)系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，對(duì)黑茶的形成、品質(zhì)的保持和提高具有重要意義。
[0003]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)是直接從環(huán)境樣品中提取微生物的DNA進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)擴(kuò)增序列、測(cè)序和基因庫(kù)比對(duì)，快速確定微生物的種屬，其指紋圖譜每個(gè)條帶代表某個(gè)微生物菌群。PCR-DGGE技術(shù)靈敏度高，可以檢測(cè)出環(huán)境中含量很少的微生物(能檢測(cè)出數(shù)量?jī)H占總?cè)郝鋽?shù)I~3%的微生物)，檢測(cè)結(jié)果更加全面和準(zhǔn)確，省去了分離培養(yǎng)過(guò)程，檢測(cè)時(shí)間和工作量大大減少。目前，應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究微生物種群及群落結(jié)構(gòu)主要集中在環(huán)境微生態(tài)，城市污水和農(nóng)田土壤等。近年，黑茶微生態(tài)研究逐漸成為熱點(diǎn)，相關(guān)報(bào)道僅僅少量集中在普洱茶，Michiharu等(MICHIHARU A，NAOHIRO T，Y0SHIT0 I, et al.Characteristic fungi observed in the fermentation process forPuer tea[J].International Journalof Food Microbiology, 2008,124: 199-203)應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)普洱茶中存在2種優(yōu)勢(shì)種群；國(guó)內(nèi)的華南理工大學(xué)和云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司也做了一些研究并申請(qǐng)了相關(guān)專(zhuān)利(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01010622765.0，201010622769.9,201310020829.3)。
[0004]黑茶發(fā)酵過(guò)程中微生物種類(lèi)復(fù)雜，貫穿整個(gè)發(fā)酵流程，不同工藝時(shí)期、不同種類(lèi)黑茶品質(zhì)形成過(guò)程中的微生物種類(lèi)及其優(yōu)勢(shì)種群存在差異，這就決定了不同環(huán)境下的茶葉樣品在進(jìn)行微生物群落構(gòu)成分析時(shí)存在差異。
[0005]六堡茶(Liu Pao Tea)是廣西梧州特有的歷史名茶,是以梧州原產(chǎn)地的中小葉茶樹(shù)為原料，采摘一芽二三葉，經(jīng)攤青、殺青、揉捻、慪堆、干燥制成。根據(jù)廣西壯族自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)“六堡茶”中的定義，六堡茶是在適宜加工的特定區(qū)域內(nèi)，選用適制茶樹(shù)(Camelliasinensis L.0.Kunts)的芽葉和嫩莖為原料，采用六堡茶初制工藝和六堡茶精制工藝加工制成，具有“六堡香”及紅、濃、陳、醇等品質(zhì)特征的黑茶。2011年3月16日，六堡茶被國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局批準(zhǔn)為地理保護(hù)產(chǎn)品。目前針對(duì)六堡茶微生物群落結(jié)構(gòu)的檢測(cè)與分析方法還是空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速、靈敏、高效的六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法。[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，直接從加工過(guò)程中的六堡茶中提取真菌總DNA，然后采用PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)其中的真菌菌群組成。
[0008]上述六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0009]<1>取不同發(fā)酵過(guò)程中的六堡茶樣品
[0010]〈2>收集茶樣品的微生物菌體
[0011]〈3>提取真菌總DNA
[0012]<4> 真菌 18S rRNA 的 PCR 擴(kuò)增
[0013]以待測(cè)樣品的真菌總DNA為模板，使用帶GC夾子的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)目的片段進(jìn)行回收及純化；
[0014]<5>DGGE 電泳分析
[0015]純化的PCR產(chǎn)物通過(guò)DGGE進(jìn)行分離，染色后得到DGGE指紋圖譜，通過(guò)指紋圖譜分析真菌菌群構(gòu)成及菌群相對(duì)數(shù)量；
[0016]<6>DGGE條帶回收及序列分析
[0017]從凝膠中回收條帶，并以此為模板，使用不帶GC夾子的同一通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)目的片段進(jìn)行回收、純化及測(cè)序；測(cè)序結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定六堡茶的真菌菌群結(jié)構(gòu)。
[0018]步驟〈1>按以下操作進(jìn)行:抽取大生產(chǎn)的茶堆的上層、中層和下層的茶葉，然后于無(wú)菌室內(nèi)將其混勻，制成包含上、中、下層茶葉的混樣。
[0019]步驟〈2>按以下操作進(jìn)行:采用玻璃珠震蕩法，先稱(chēng)量50g混勻的茶葉于500mL的錐形瓶里面，加少量滅菌過(guò)的玻璃珠，再添加0.85%磷酸鹽緩沖液450mL，200rpm震蕩15min,然后用雙層紗布過(guò)濾掉茶葉,濾液使用500mL的離心瓶收集,1000Orpm離心10min,
收集沉淀。
[0020]步驟〈3>按以下操作進(jìn)行:采用液氮研磨裂解菌體，將沉淀從離心瓶轉(zhuǎn)移至滅菌的研缽，倒進(jìn)適量的液氮，用力研磨，反復(fù)直至粉末狀，轉(zhuǎn)移粉末至50mL離心管，加入15mL的總DNA提取液，同時(shí)加入7.5mL的氯仿、7.5mL的Tris-平衡酚，輕輕上下顛倒混勻，1000Orpm離心10min ;取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等量的氯仿，上下顛倒混勻后，1000Orpm離心10min ;取上清，加入等量的異丙醇沉淀，13000rpm,離心15min ;收集的DNA用75%酒精洗滌2遍，加入約0.3mL的ddH20溶解，置_20°C保存。
[0021]步驟〈4>按以下操作進(jìn)行:
[0022]引物為對(duì)大多數(shù)真菌18S rRNA基因5'末端具有特異性的帶GC發(fā)夾的通用引物，引物序列 NLl (F)為 5’ -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，引物序列 NLl (F) -GC 為 5’ -CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，引物序列 LS2(R)為 5，-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3，；
[0023]PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min，94°C 50sec,58.4°C 30sec，72°C lmin，循環(huán) 36次，72。。延伸 IOmin ；
[0024]PCR 擴(kuò)增體系為GoTaq?> Green Master Mix 25 μ L，引物 NLl (F)-GC I μ L (濃度10 μ M/L)，引物 LS2 (R) I μ L (濃度 10 μ M/L)，樣品 DNA 模板 I μ L，ddH20 補(bǔ)足至 50 μ L。
[0025]步驟〈5>中DGGE電泳按以下操作進(jìn)行:PCR產(chǎn)物通過(guò)DGGE進(jìn)行分離，使用40%丙烯酰胺/甲叉基雙丙烯酰胺溶液(37.5/1)制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠，變性梯度范圍為30%~70%，使用的電泳緩沖液為ΙχΤΑΕ，電壓180V，60°C電泳6h ;聚丙烯酰胺凝膠用GelRed染料染色，得DGGE圖譜。
[0026]步驟〈6>按以下操作進(jìn)行:電泳完后用于回收條帶的聚丙烯酰胺凝膠用Gel Red染料染色約30min，去離子水漂洗10s，在紫外燈下用無(wú)菌手術(shù)刀片切下含有目的片段的膠塊，裝入一干凈滅菌的1.5mL EP管中；用滅菌槍頭將凝膠搗碎，加20 μ L滅菌雙蒸水，放置4°C冰箱過(guò)夜；12000rpm離心10min，取I μ L上清為模板，用不帶GC夾子的同一通用引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min，94°C 50sec，52°C 30sec，72°C lmin，循環(huán)36次，72°C延伸IOmin ;擴(kuò)增的目的DNA片段送測(cè)序；目的條帶測(cè)序后，在RDP (RibosomalDatabase ProjectI1-Release9, http: //rdp.cme.msu.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)中用 Classifier 軟件包對(duì)序列進(jìn)行歸類(lèi)，并在GeneBankChttp: //www.ncb1.nlm.nih.gov)講行序列同源件比較;序列和所比對(duì)的同源性高的序列一起，用MEGA5.0軟件按距離矩陣法中的鄰接法(N-J法，Neighbor-joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),通過(guò)自展(bootstrap)方法重復(fù)抽樣1000次進(jìn)行可靠性測(cè)試。
[0027]研究表明，六堡茶渥堆發(fā)酵中起主要作用的微生物以真菌為主(楊錦泉.微生物與六堡茶渥堆發(fā)酵.云南茶葉.1987，(4)，32-34)。據(jù)此，發(fā)明人采用PCR-DGGE技術(shù)建立了六堡茶加工過(guò)程中真 菌菌群的檢測(cè)方法，直接從六堡茶中提取真菌總DNA，避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)不能分離鑒定六堡茶中未培養(yǎng)真菌微生物的缺陷，能在較短的時(shí)間內(nèi)得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大大減少工作量和工作時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可信。該法適應(yīng)于六堡茶及六堡茶加工過(guò)程中的茶葉樣品，檢測(cè)的真菌菌群能全面包括六堡茶中的真菌種類(lèi)，能客觀有效地反映茶加工過(guò)程中六堡茶真菌菌群動(dòng)態(tài)變化，為有效揭示六堡茶發(fā)酵過(guò)程中微生物的作用機(jī)制和改進(jìn)六堡茶生產(chǎn)工藝奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1是六堡茶真菌總DNA的PCR產(chǎn)物圖，圖中:M為Marker，第I~VI為不同編號(hào)的抽取茶葉樣品。
[0029]圖2是六堡茶真菌總DNA的PCR產(chǎn)物DGGE電泳圖，圖中:第I~VI為不同編號(hào)的抽取茶葉樣品。
[0030]圖3是六堡茶真菌DGGE電泳回收條帶PCR產(chǎn)物電泳圖，圖中:M為marker，I~11為圖2中對(duì)應(yīng)標(biāo)注的回收條帶。
[0031 ] 圖4是六堡茶中真菌DGGE電泳回收條帶測(cè)序結(jié)果圖，圖中上下兩段相同編號(hào)合為測(cè)序的結(jié)果，I~11為圖2中對(duì)應(yīng)標(biāo)注的回收條帶。
[0032]圖5是DGGE回收條帶測(cè)序結(jié)果的聚類(lèi)分析結(jié)果圖，圖中:bandl~bandll為真菌DGGE電泳回收序列對(duì)應(yīng)的六堡茶真菌。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1
[0034]<1>取不同發(fā)酵過(guò)程中的六堡茶樣品
[0035]抽取梧州茶廠2012年第266批次發(fā)酵車(chē)間的渥堆茶葉，該茶堆重量約20噸。該茶堆高度約60cm，抽取其上層(包括堆面和面下5cm的茶葉)、中層(距離堆面約20-30cm)的茶葉、下層(包括堆底和地面上5cm)的茶葉)。上、中、下三層各取其四角和中間點(diǎn)共5個(gè)點(diǎn)，然后于無(wú)菌室內(nèi)將其混勻，制成包含上、中、下層茶葉的茶葉混樣。抽取陳化倉(cāng)庫(kù)的剛進(jìn)入陳化期的大蘿茶葉，每件約50kg，用刀劈開(kāi)取中間部分，共取2件，無(wú)菌室中將其混勻。取樣時(shí)間依次為發(fā)酵前、渥堆第5天、渥堆第13天、渥堆第16天、渥堆第28天、陳化第3天。茶葉樣品抽樣情況如表1。
[0036]表1茶葉樣品抽樣情況
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，其特征在于:直接從加工過(guò)程中的六堡茶中提取真菌總DNA，然后采用PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)其中的真菌菌群組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟: 〈I>取不同發(fā)酵過(guò)程中的六堡茶樣品 <2>收集茶樣品的微生物菌體 <3>提取真菌總DNA <4>真菌18S rRNA的PCR擴(kuò)增 以待測(cè)樣品的真菌總DNA為模板，使用帶GC夾子的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)目的片段進(jìn)行回收及純化； <5>DGGE電泳分析 純化的PCR產(chǎn)物通過(guò)DGGE進(jìn)行分離，染色后得到DGGE指紋圖譜，通過(guò)指紋圖譜分析真菌菌群構(gòu)成及菌群相對(duì)數(shù)量； <6>DGGE條帶回收及序列分析 從凝膠中回收條帶，并以此為模板，使用不帶GC夾子的同一通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)目的片段進(jìn)行回收、純化及測(cè)序；測(cè)序結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定六堡茶的真菌菌群結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，其特征在于步驟〈1>按以下操作進(jìn)行:抽取大生產(chǎn)的茶堆的上層、中層和下層的茶葉，然后于無(wú)菌室內(nèi)將其混勻，制成包含上、中、下層茶葉的混樣。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，其特征在于步驟〈2>按以下操作進(jìn)行:采用玻璃珠震蕩法，先稱(chēng)量50g混勻的茶葉于500mL的錐形瓶里面，加少量滅菌過(guò)的玻璃珠，再添加0.85%磷酸鹽緩沖液450mL，200rpm震蕩15min，然后用雙層紗布過(guò)濾掉茶葉，濾液使用500mL的離心瓶收集，1000Orpm離心10min，收集沉淀。
5.根據(jù)權(quán)利要求4 所述的六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，其特征在于步驟〈3>按以下操作進(jìn)行:采用液氮研磨裂解菌體，將沉淀從離心瓶轉(zhuǎn)移至滅菌的研缽，倒進(jìn)適量的液氮，用力研磨，反復(fù)直至粉末狀，轉(zhuǎn)移粉末至50mL離心管，加入15mL的總DNA提取液，同時(shí)加入7.5mL的氯仿、7.5mL的Tris-平衡酹，輕輕上下顛倒混勻，1000Orpm離心IOmin ;取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等量的氯仿,上下顛倒混勻后，1000Orpm離心IOmin ;取上清，加入等量的異丙醇沉淀，13000rpm，離心15min ;收集的DNA用75%酒精洗滌2遍，加入約0.3mL的ddH20溶解，置_20°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，其特征在于步驟〈4>按以下操作進(jìn)行: 所述引物為對(duì)大多數(shù)真菌18S rRNA基因5'末端具有特異性的帶GC發(fā)夾的通用引物，引物序列 NLl (F)為 5’ -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，引物序列 NLl (F) -GC 為 5’ -CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，引物序列 LS2(R)為 5，-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3，； 所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min，94°C 50sec,58.4°C 30sec,72°C lmin，循環(huán) 36次，72。。延伸 IOmin ；所述 PCR 擴(kuò)增體系為GoTaq? Green Master Mix 25 μ L，引物 NLl (F)-GC I μ L、濃度10 μ M/L，引物 LS2 (R) I μ L、濃度 10 μ M/L，樣品 DNA 模板 I μ L, ddH20 補(bǔ)足至 50 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，其特征在于步驟<5>中DGGE電泳按以下操作進(jìn)行:PCR產(chǎn)物通過(guò)DGGE進(jìn)行分離，使用40%丙烯酰胺/甲叉基雙丙烯酰胺溶液(37.5/1)制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠，變性梯度范圍為30%~70%，使用的電泳緩沖液為lxTAE，電壓180V，600C電泳6h ;聚丙烯酰胺凝膠用Gel Red染料染色，得DGGE圖譜。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的六堡茶加工過(guò)程中真菌菌群的檢測(cè)方法，其特征在于步驟〈6>按以下操作進(jìn)行:電泳完后用于回收條帶的聚丙烯酰胺凝膠用Gel Red染料染色約30min,去離子水漂洗10s，在紫外燈下用無(wú)菌手術(shù)刀片切下含有目的片段的膠塊，裝入一干凈滅菌的1.5mL EP管中；用滅菌槍頭將凝膠搗碎，加20 μ L滅菌雙蒸水，放置4°C冰箱過(guò)夜；12000rpm離心10min，取I μ L上清為模板，用不帶GC夾子的同一通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min，94°C 50sec,52°C 30sec,72°C lmin，循環(huán) 36 次，72°C延伸IOmin ;擴(kuò)增的目的DNA片段送測(cè)序；測(cè)序后，在RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中用Classifier軟件包對(duì)序列進(jìn)行歸類(lèi)，并在GeneBank進(jìn)行序列同源性比較；序列和所比對(duì)的同源性高的序列一起，用MEGA5.0軟件按距離矩陣法中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)自展方法重復(fù)抽樣1000次進(jìn)行可靠性測(cè)試。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103937874SQ201310703366
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】盧潔, 溫志杰, 施向東, 莫祺紅, 李小娟, 吳志勇, 吳平, 何志強(qiáng), 白先放, 何勇強(qiáng) 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)