一種檢測(cè)和鑒定沙門氏菌1,4,[5],12:i:-的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)和鑒定沙門氏菌1,4,[5],12:i:-的方法。它對(duì)待檢的沙門氏菌菌株進(jìn)行O和H抗血清凝集反應(yīng)，鑒定出菌株完整的O抗原，并且當(dāng)遇到第Ⅱ相H抗原為陰性時(shí)，采用第Ⅰ相H抗原“Hi”進(jìn)行鞭毛誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，如果誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第Ⅱ相H抗原為陰性時(shí)，確定為疑似菌株；提取疑似菌株的DNA，采用引物一、二和三進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，如果多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物中同時(shí)出現(xiàn)1389bp、1000bp、261bp條帶，則證明菌株是鼠傷寒沙門氏菌，如果多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物中只含有1000bp、261bp條帶或僅出現(xiàn)261bp條帶，則確認(rèn)疑似菌株為沙門氏菌1,4,[5],12:i:-，出現(xiàn)其它的帶型組合則是其它沙門氏菌。本方法操作簡單，成本低廉，反應(yīng)快速，高效，準(zhǔn)確，無環(huán)境污染，是食品常規(guī)檢測(cè)或疾病暴發(fā)檢測(cè)的重要快速檢測(cè)工具。
【專利說明】—種檢測(cè)和鑒定沙門氏菌1, 4, [5], 12:1:-的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測(cè)和鑒定沙門氏菌1，4，[5],的方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]沙門氏菌(Salmonella spp)是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病病原菌，在世界各地的食物中毒事件中，沙門氏菌引起的中毒病例常列榜首。目前全世界已發(fā)現(xiàn)約2600種沙門氏菌血清型，其中腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)是引起人類感染最多的兩種血清型。20世紀(jì)90年代初以來,一種與鼠傷寒沙門氏菌具有相似的抗原式，并在遺傳關(guān)系上與之緊密聯(lián)系的新的血清型——沙門氏菌1，4，[5]，不斷被檢出。且近十年，在全球多個(gè)國家其檢出率大幅度增加，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，引起危害嚴(yán)重的人類疾病和暴發(fā)流行。
[0003]由于很長一段時(shí)間內(nèi)，沙門氏菌1，4，[5], 12:1:_—直錯(cuò)誤地被歸為鼠傷寒沙門氏菌，所以在20世紀(jì)90年代之前，很少有“沙門氏菌1，4，[5]，12:1:-”的報(bào)道。文獻(xiàn)資料顯示，最早是在1946年由Edwards和Brunner分離了 3株僅具有第I相鞭毛抗原的“鼠傷寒沙門氏菌”，然后Kauffmann于1965年記錄了 I株“鼠傷寒沙門氏菌I相單相菌”。20世紀(jì)90年代以來，沙門氏菌1，4，[5]，在全球多個(gè)國家被分離和鑒定。在世界范圍內(nèi)，沙門氏菌1，4，[5]，12:1:-分布廣泛，這種新發(fā)現(xiàn)的血清型不僅在人類糞便、血液中分離，而且在雞 、牛、豬、甲魚等動(dòng)物和禽肉、豬肉和香腸等食品中分離，并在多個(gè)國家引起特定的沙門氏菌病的暴發(fā)和流行。在亞洲，沙門氏菌1，4，[5],較早分離于泰國，之后由其引起的患病人數(shù)不斷增加，被列為泰國引起沙門氏菌病的5種主要血清型之一。沙門氏菌1，4，[5], 在臺(tái)灣，韓國，中國等國家均有引起食源性疾病的報(bào)道。在歐洲，一些研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌1，4，[5]，12:1:_引起人類的感染與豬肉及其制品有關(guān)。自沙門氏菌1，4，[5], 于1997年在西班牙正式被報(bào)道后，檢出率不斷增加，被列為西班牙引起疾病的5種主要血清型之一，更成為西班牙豬中最常見和豬肉制品中第二常見的血清型。2006年，盧森堡發(fā)生了兩起因食用被僅具有第I相鞭毛抗原的I相單相菌
I,4，[5], 12:1;-DT193污染的豬肉食品而導(dǎo)致的沙門氏菌病暴發(fā)流行，133人致病，24人住院治療，I人死亡。2005-2008年，沙門氏菌1，4，[5], 12:1;-的檢出率在法國從第11位上升到第3位，并分別在2010、2011年發(fā)生兩次由污染了沙門氏菌4，[5], 12:1 的干豬肉香腸引起的沙門氏菌病暴發(fā)流行。在美洲，沙門氏菌1，4，[5]，12:1:_已被列為美國6種引起人類疾病主要血清型之一。2007年污染了沙門氏菌4，5，12:1:_的冷凍禽肉派引起波及多個(gè)州的沙門氏菌病暴發(fā)流行。
[0004]沙門氏菌1，4，[5]，12:1:_引起人類食源性疾病的快速增長，帶來嚴(yán)重危害，因此研究這種新血清型的產(chǎn)生、來源，以及與其它血清型的遺傳關(guān)系的研究尤為重要。通過包括曬菌體分型(Phage Typing)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis,PFGE)>多位點(diǎn)序列分析(Multilocus Sequence Typing, MLST),隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA analysis, RAPD)以及 PCR 法分析特有基因片段等研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌1，4，[5]，12:1:_與鼠傷寒沙門氏菌具有很高的遺傳相似度，推測(cè)
I,4，[5], 12:1:_血清型可能是鼠傷寒沙門氏菌的I相菌單相變種。
[0005]鑒于沙門氏菌1，4，[5]，12:1:_對(duì)食品安全和人類健康的嚴(yán)重威脅，目前世界各國政府已開始進(jìn)行沙門氏菌1，4，[5],的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作，但大部分處于探索階段。加上O抗原(1，4，[5], 12)抗原式的不完整，導(dǎo)致很難對(duì)不同國家和不同研究者報(bào)道的菌株進(jìn)行比較分析和流行病學(xué)調(diào)查，無法判斷進(jìn)化方向和流行趨勢(shì)。鑒于此種情況，建立一種區(qū)分和鑒定沙門氏菌1，4，[5], 12:1 與鼠傷寒沙門氏菌和其它血清型的檢測(cè)方法，是及時(shí)、準(zhǔn)確地了解我國沙門氏菌1，4，[5]，的流行情況的技術(shù)保障，可為采取措施預(yù)防及控制食品中沙門氏菌1，4，[5]，12:1:-的污染提供重要依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】
: [0006]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、成本低廉、反應(yīng)快速、高效、準(zhǔn)確和無環(huán)境污染的非疾病的診斷和治療目的的檢測(cè)和鑒定沙門氏菌1，4，[5]，12:1:-的方法。
[0007]本發(fā)明的非疾病的診斷和治療目的的檢測(cè)和鑒定沙門氏菌1，4，[5],的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008]a、血清分型初步確定單相菌抗原式:對(duì)待檢的沙門氏菌菌株進(jìn)行O和H抗血清凝集反應(yīng)，鑒定出菌株完整的O抗原，并且當(dāng)遇到第II相H抗原為陰性時(shí)，采用第I相H抗原“Hi”進(jìn)行鞭毛誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，如果誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第II相H抗原為陰性時(shí)，確定為疑似菌株；
[0009]b、提取疑似菌株的DNA，采用下述表中的引物一、二和三進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，如果多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物中同時(shí)出現(xiàn)1389bp、1000bp、26Ibp條帶，則證明菌株是鼠傷寒沙門氏菌，如果多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物中只含有1000bp、261bp條帶或僅出現(xiàn)261bp條帶，則確認(rèn)疑似菌株為沙門氏菌1，4，[5],出現(xiàn)其它的帶型組合則是其它沙門氏菌；
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種非疾病的診斷和治療目的的檢測(cè)和鑒定沙門氏菌1，4，[5]，12:1:_的方法，其特征在于， 包括以下步驟: a、血清分型初步確定單相菌抗原式:對(duì)待檢的沙門氏菌菌株進(jìn)行O和H抗血清凝集反應(yīng)，鑒定出菌株完整的O抗原，并且當(dāng)遇到第II相H抗原為陰性時(shí)，采用第I相H抗原“Hi ”進(jìn)行鞭毛誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，如果誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第II相H抗原為陰性時(shí)，確定為疑似菌株； b、提取疑似菌株的DNA，采用下述表中的引物一、二和三進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，如果多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物中同時(shí)出現(xiàn)1389bp、1000bp、26Ibp條帶，則證明菌株是鼠傷寒沙門氏菌，如果多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物中只含有1000bp、261bp條帶或僅出現(xiàn)261bp條帶，則確認(rèn)疑似菌株為沙門氏菌1，4，[5],出現(xiàn)其它的帶型組合則是其它沙門氏菌；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多重PCR反應(yīng)，采用25yL的PCR反應(yīng)體系，含有2XPCR MIX12.5yL,10ymol/L的引物一和引物三上游引物和下游引物各0.2 μ L，10 μ mol/L的引物二上游引物和下游引物各0.6 μ L，待檢的沙門氏菌的DNA模版0.5 μ L，補(bǔ)齊ddH20至25 μ L，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，然后95°C 30s, 53°C 30s，72°C 30s，共30次循環(huán)后，72°C最后延伸lOmin。
【文檔編號(hào)】C12Q1/10GK103725780SQ201310700325
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】楊小鵑, 吳清平, 張菊梅 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所