高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法
【專利摘要】高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法，涉及一種改性大豆分離蛋白的制備方法。所述制備方法步驟如下：將一定量的大豆分離蛋白和葡萄糖用蒸餾水配制成混合均勻的溶液，控制溶液中蛋白與葡萄糖的質(zhì)量比為0.5～4∶1，蛋白濃度為8％(w/v)；將上述溶液密封后在70～90℃的條件下進(jìn)行糖基化反應(yīng)1～6h。本發(fā)明采用濕法糖基化改性來制備高溶解性和乳化性的改性大豆分離蛋白，容易操作，一步處理即可達(dá)到效果，節(jié)約成本和能源，為拓寬其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
【專利說明】高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種改性大豆分離蛋白的制備方法，具體涉及一種利用濕熱法糖基化改性大豆分離蛋白提高其溶解性和乳化性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆分離蛋白(soybean protein isolate, SPI)是以低溫豆柏為原料分離提取的一種高純度植物蛋白質(zhì)，由于其具有良好的功能性質(zhì)和較高的營養(yǎng)價(jià)值，成為最重要的植物蛋白資源之一。但它常常由于缺乏良好的溶解性及乳化能力使其在某些食品中的應(yīng)用受到限制，因此為了拓寬大豆分離蛋白的應(yīng)用范圍，需要對(duì)其進(jìn)行改性處理。
[0003]蛋白質(zhì)糖基化改性是以美拉德反應(yīng)為理論基礎(chǔ)的。美拉德反應(yīng)，又稱“非酶褐變反應(yīng)”，是蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸與還原糖之間的復(fù)雜反應(yīng)。法國生物化學(xué)Louis CamileMaillard于1912年發(fā)現(xiàn)了該反應(yīng)，美國化學(xué)家Hodge等人于1953年正式將該反應(yīng)命名為“MaiIIard(美拉德)反應(yīng)”，并提出了美拉德反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分類圖解，系統(tǒng)地闡述了反應(yīng)機(jī)理。
[0004]美拉德反應(yīng)可分為三個(gè)階段:
[0005](a)初級(jí)階段:還原糖(如葡萄糖)的羰基與具有自由氨基的化合物(如氨基酸、蛋白質(zhì)中賴氨酸側(cè)鏈上的ε -氨基及末端氨基酸的α -氨基)之間進(jìn)行加成反應(yīng)生成N-糖基胺(Glycosilamine),經(jīng)Amadori重排形成1-氨基_1_脫氧_2_酮糖。在Amadori產(chǎn)物形成之后，其降解取決于體系的PH值:pH ( 7，Amiadori產(chǎn)物在1，2位置上烯醇化產(chǎn)生糠醒或經(jīng)甲基糠醒(Hydroxymethylfurfural HMF) ;pH≥7, Amiadori產(chǎn)物在2, 3位置上烯醇化產(chǎn)生還原酮類和一類裂解產(chǎn)物。產(chǎn)生的這些高活性的物質(zhì)將參與后面階段的反應(yīng)。
[0006](b)中級(jí)階段:主要發(fā)生Strecker降解。羰基和自由氨基發(fā)生縮合反應(yīng)后，將氮引入終產(chǎn)物中。二羰基化合物繼續(xù)與氨基酸反應(yīng)生成醛和α-氨基酮。
[0007](c)高級(jí)階段:成環(huán)、脫水、重排、異構(gòu)等一系列反應(yīng)均在進(jìn)行；在最終反應(yīng)階段，高級(jí)美拉德反應(yīng)階段形成的眾多活性中間體，又可繼續(xù)與氨基酸反應(yīng)，最終都生成類色素-褐色含氮色素，此過程包括醇醛縮合、醛氨聚合、環(huán)化合反應(yīng)等。
[0008]目前用于蛋白質(zhì)改性的方法很多，包括物理改性、化學(xué)改性和酶法改性等。糖基化改性是化學(xué)改性的一種類型，是蛋白質(zhì)的ε -氨基酸與多羥基化合物之間發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成糖基化蛋白。由于該方法不需要外加化學(xué)試劑，是一個(gè)自然、自發(fā)的反應(yīng)，因此成為一種理想的改性方法。國內(nèi)外已有許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)糖基化改性后的蛋白質(zhì)其溶解性和乳化能力均發(fā)生較大改變。Saeki等人在40°C條件下將魚肌原纖維蛋白與葡萄糖反應(yīng)12h，它的溶解性得到顯著改善；蘇志光等人將大豆分離蛋白與甘露聚糖利用干法糖基化生成糖蛋白，經(jīng)測(cè)定其溶解性顯著提高。Moreno等人將酪蛋白與乳糖在40°C下進(jìn)行糖基化反應(yīng)，其產(chǎn)物的乳化性得到明顯改善。趙海賢等人經(jīng)研究表明在干熱條件下生成的大豆分離蛋白與葡聚糖共價(jià)結(jié)合物的乳化能力顯著提升。目前對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行糖基化改性研究主要用干熱法制備多糖-復(fù)合物，耗時(shí)較長。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對(duì)現(xiàn)有大豆分離蛋白功能性比較低的問題，本發(fā)明提供一種利用濕熱法糖基化改性大豆分離蛋白提高其溶解性和乳化性的方法。
[0010]本發(fā)明提供的利用濕熱法糖基化改性大豆分離蛋白提高其溶解性和乳化性的方法，具體步驟如下:
[0011]將一定量的大豆分離蛋白和葡萄糖用蒸餾水配制成混合均勻的溶液，溶液中大豆分離蛋白與葡萄糖的質(zhì)量比為0.5?4: 1，大豆分離蛋白濃度為8% (w/v);將上述溶液密封后在70?90°C的條件下進(jìn)行糖基化反應(yīng)I?6h，將樣品冷凍干燥后置于4°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0012]研究證明:美拉德反應(yīng)的程度和溫度、時(shí)間、系統(tǒng)中的組分及反應(yīng)物濃度有關(guān)。濕熱法進(jìn)行的接枝反應(yīng)是指蛋白質(zhì)與糖在溶液的條件下加熱進(jìn)行，一般是單糖或雙糖，因此選擇葡萄糖這種價(jià)格低廉的單糖為反應(yīng)底物。濕熱接枝反應(yīng)是在一個(gè)密閉的裝置里放入蛋白質(zhì)和糖的混合液，水浴或者油浴來控制反應(yīng)的溫度從而調(diào)節(jié)反應(yīng)的速度，在溫度< 90°C時(shí)反應(yīng)速度較慢，溫度> 100°C時(shí)較快。當(dāng)溫度> 100°C時(shí)，反應(yīng)速度很快，反應(yīng)不易控制，并且在工業(yè)生產(chǎn)中不易達(dá)到溫度要求，同時(shí)在高溫下容易形成蛋白與蛋白的聚合物，從而影響蛋白與糖的反應(yīng)，因此選擇70?90°C。又由于在< 90°C條件下反應(yīng)速度較慢，因此選擇反應(yīng)時(shí)間為I?6h。不同配比的反應(yīng)底物也會(huì)對(duì)糖基化反應(yīng)速度和產(chǎn)物的功能性質(zhì)產(chǎn)生一定的影響，因此選擇多個(gè)底物配比進(jìn)行研究。之前研究表明，在高水分活度食品中，反應(yīng)底物濃度被稀釋，不易發(fā)生美拉德反應(yīng)，但在反應(yīng)底物濃度較高時(shí)，又會(huì)由于溶液粘度過高而不易流動(dòng)，從而影響反應(yīng)的進(jìn)行，因此選擇蛋白濃度為8%。
[0013]201210540762.5公開了 一種復(fù)合改性制備高效蛋白乳化劑的方法，該方法是利用物理改性(超聲波處理)與化學(xué)改性(糖基化改性)相結(jié)合的方式來制備高效蛋白乳化劑。而本發(fā)明中只單一用了濕法糖基化改性來制備高溶解性和乳化性的改性大豆分離蛋白，只經(jīng)此一種化學(xué)改性同樣顯著改善了大豆分離蛋白的溶解性和乳化性。與201210540762.5相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于容易操作，一步處理即可達(dá)到效果，節(jié)約成本和能源，并且超聲波處理由于其成本較高，一般在實(shí)驗(yàn)室使用，目前工業(yè)上還較少使用。同時(shí)，本發(fā)明與201210540762.5在反應(yīng)底物的濃度、配比及反應(yīng)溫度和時(shí)間范圍均有不同。201210540762.5中使用緩沖溶液是要使反應(yīng)在固定的pH值下進(jìn)行，而本發(fā)明中是在自然條件下研究大豆分離蛋白糖基化改性對(duì)其溶解性和乳化性的影響，本發(fā)明使用去離子水同時(shí)也是為了排除離子對(duì)糖基化反應(yīng)的影響。
[0014]本發(fā)明通過測(cè)定各糖基化產(chǎn)物的溶解度、乳化活性和乳化穩(wěn)定性，研究糖基化溫度和時(shí)間、蛋白-葡萄糖質(zhì)量比對(duì)大豆分離蛋白溶解性和乳化能力的影響。結(jié)果表明:蛋白與葡萄糖質(zhì)量比為1: 2，反應(yīng)溫度為80°C，反應(yīng)時(shí)間為2h制得的糖基化大豆分離蛋白的溶解度最高，高達(dá)92.93%，是未改性SPI的4.38倍；蛋白與葡萄糖質(zhì)量比為1: 1，反應(yīng)溫度為90°C，反應(yīng)時(shí)間為6h制得的糖基化大豆分離蛋白的乳化活性最高，高達(dá)0.63，是未改性SPI的3.94倍；蛋白與葡萄糖質(zhì)量比為1: 2，反應(yīng)溫度為90°C，反應(yīng)時(shí)間為3h制得的糖基化大豆分離蛋白的乳化穩(wěn)定性最高，高達(dá)50.92，是未改性SPI的1.98倍。糖基化改性可顯著提高大豆分離蛋白的溶解性和乳化性能，這為拓寬其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(4: I)對(duì)大豆分離蛋白溶解性的影響；
[0016]圖2為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(2:1)對(duì)大豆分離蛋白溶解性的影響；
[0017]圖3為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(I: I)對(duì)大豆分離蛋白溶解性的影響；
[0018]圖4為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(I: 2)對(duì)大豆分離蛋白溶解性的影響；
[0019]圖5為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(4: I)對(duì)大豆分離蛋白乳化活性的影響；
[0020]圖6為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(2:1)對(duì)大豆分離蛋白乳化活性的影響；
[0021]圖7為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(I: I)對(duì)大豆分離蛋白乳化活性的影響；
[0022]圖8為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(I: 2)對(duì)大豆分離蛋白乳化活性的影響；
[0023]圖9為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(4: I)對(duì)大豆分離蛋白乳化穩(wěn)定性的影響；
[0024]圖10為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(2:1)對(duì)大豆分離蛋白乳化穩(wěn)定性的影響；
[0025]圖11為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(I: I)對(duì)大豆分離蛋白乳化穩(wěn)定性的影響；
[0026]圖12為不同糖基化溫度和時(shí)間及蛋白-葡萄糖質(zhì)量比(I: 2)對(duì)大豆分離蛋白乳化穩(wěn)定性的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0028]本發(fā)明利用濕熱法制備葡萄糖-SPI復(fù)合物，通過測(cè)定產(chǎn)物的溶解度、乳化活性和乳化穩(wěn)定性，研究糖基化溫度和時(shí)間、蛋白與葡萄糖質(zhì)量比對(duì)大豆分離蛋白溶解性和乳化能力的影響，確定最佳工藝條件。
[0029]1、材料與方法
[0030]1.1材料與試劑
[0031]大豆分離蛋白(蛋白含量≥90% ):哈爾濱高科大豆食品公司；九三非轉(zhuǎn)基因大豆油:九三集團(tuán)哈爾濱惠康食品有限公司；牛血清白蛋白:Sigma公司；SDS:Solarbio公司；葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0032]1.2儀器與設(shè)備
[0033]AL-104型精密電子天平:上海梅特勒_托利多儀器設(shè)備有限公司；DK_8B型電熱恒溫水浴鍋:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；冷凍干燥機(jī):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；QT-1旋渦混合器:上海琪特分析儀器有限公司；TGL-16C型高速離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠；721型可見分光光度計(jì):上海元析儀器有限公司；T18高速勻漿機(jī):德國IKA公司。
[0034]1.3試驗(yàn)方法
[0035]1.3.1糖基化大豆分離蛋白的制備
[0036]將一定量的大豆分離蛋白和葡萄糖用蒸餾水配制成混合均勻的溶液，溶液中蛋白與葡萄糖的質(zhì)量比分別為4: 1、2: 1、1: 1、1: 2，其中蛋白濃度為8% (w/v) 0將上述溶液用保鮮膜密封放置在70°C、80°C和90°C的恒溫水浴鍋中進(jìn)行糖基化反應(yīng)，分別在反應(yīng)開始的0、l、2、3、4、5、6h取出一定量的樣品,將樣品冷凍干燥后置于4°C下保存?zhèn)溆谩ｋp縮脲法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量。
[0037]1.3.2糖基化大豆分離蛋白溶解性的測(cè)定
[0038]參照孫煥等人的雙縮脲法，并稍作修改。將制備得到的樣品配制成蛋白濃度1%(w/v)的溶液,充分?jǐn)嚢韬螅?000r/min離心30min,取上清液ImL于試管中，加入雙縮脲試劑4mL，振蕩后放置30min，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出上清液中蛋白含量。
[0039]1.3.3糖基化大豆分離蛋白乳化能力的測(cè)定
[0040]參照Tang等人的濁度法，并稍作修改。將樣品溶于0.2mol/L (pH7.0)的磷酸鹽緩沖溶液中，使蛋白濃度為lmg/mL，將2mL大豆油和8mL樣品溶液放入直徑為2.5cm的塑料離心管中高速勻漿lmin，分別于O和IOmin從離心管底部吸取50 μ L勻漿液加入到5mL0.1 %SDS溶液中，振蕩混勻后在500nm處測(cè)定吸光值，記作Atl和A1(l。用0.1 % SDS溶液作為空白對(duì)照。用零時(shí)刻的吸光值A(chǔ)tl表示乳化活性(emulsifying activity, EA),乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability, ES)用如下公式表示:
[0041]
【權(quán)利要求】
1.高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法，其特征在于所述制備方法步驟如下:將一定量的大豆分離蛋白和葡萄糖用蒸餾水配制成混合均勻的溶液，控制溶液中大豆分離蛋白與葡萄糖的質(zhì)量比為0.5?4: I ;將上述溶液密封后在70?90°C的條件下進(jìn)行糖基化反應(yīng)I?6h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法，其特征在于所述大豆分離蛋白濃度為8% (w/v) 0
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法，其特征在于所述大豆分離蛋白與葡萄糖質(zhì)量比為1: 2，反應(yīng)溫度為80°C，反應(yīng)時(shí)間為2h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法，其特征在于所述大豆分離蛋白與葡萄糖質(zhì)量比為1: 1，反應(yīng)溫度為90°C，反應(yīng)時(shí)間為6h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法，其特征在于所述大豆分離蛋白與葡萄糖質(zhì)量比為1: 2，反應(yīng)溫度為90°C，反應(yīng)時(shí)間為3h。
【文檔編號(hào)】A23J3/16GK103652316SQ201310697737
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】夏秀芳, 孔保華, 呂鴻鵠, 韓建春, 鄭環(huán)宇, 李芳菲 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)