一種不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純（s）-1-萘基-1-乙醇的方法及篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純（S）-1-萘基-1-乙醇的方法，步驟如下：將白地霉發(fā)酵培養(yǎng)后，收集白地霉菌絲體；稱取一定量的白地霉菌絲體，用磷酸緩沖液制成白地霉菌懸液；在菌懸液中添加底物1-萘乙酮，然后50～180r/min、25～40℃下反應(yīng)5min～48h，得反應(yīng)液；取反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取1～5次，將混合液在10000r/min下離心10min，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物，其中（S）-1-萘基-1-乙醇的光學(xué)純度（e.e值）可達到99%。本方法白地霉不對稱還原1-萘乙酮，可獲得光學(xué)純（S）-1-萘基-1-乙醇，經(jīng)還原后獲得產(chǎn)率為84%，e.e值99%的（S）-1-萘基-1-乙醇，反應(yīng)的產(chǎn)率高，產(chǎn)物純度高，耗時短，該方法具有簡單、高效、選擇性高、光學(xué)純度高、環(huán)境友好的優(yōu)點。
【專利說明】—種不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S) -1-萘基-1-乙酉孚的方法及篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)合成【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的合成，尤其是一種不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S) -1-萘基-1-乙醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]手性芳香醇是一類具有芳香族基團的手性醇，是多種芳香醇胺類藥物的重要中間體。(S)-1-萘基-1-乙醇(S (-)-1- (l-napthyl)ethanol)是合成降膽固醇藥物 HMG-CoA還原酶抑制劑的重要手性中間體。手性芳香醇通常以化學(xué)不對稱還原的方法獲得，但化學(xué)不對稱還原方法有一定難度，反應(yīng)步驟較多，并且要使用價昂的手性催化試劑(二磷配體與銥、銠、釕的絡(luò)化物等)，反應(yīng)過程或產(chǎn)物造成環(huán)境污染等缺點。 [0003]手性芳香醇通常采用不對稱還原的方法獲得，不對稱還原又分為化學(xué)不對稱還原和生物不對稱還原?；瘜W(xué)催化不對稱還原主要分為手性試劑控制的不對稱還原和手性催化劑控制的不稱還原。目前，(S) -1-萘基-1-乙醇可以通過化學(xué)催化CBS還原反應(yīng)獲得，即1-萘乙酮在手性惡唑硼烷(CBS催化劑)和乙硼烷的醚溶液催化下被立體選擇性還原為(S)-1-萘基-1-乙酉享(MP Krzeminskij A Wojtczakj Chiral terpene auxiliaries.Partl:Highly enantioselective reduction of ketones with borane catalyzed by anoxazaborolidine derived from β -pinene.Tetrahedron letters，2005)。
[0004]生物法不對稱合成主要是應(yīng)用生物催化劑對前手性羰基化合物進行不對稱還原，得到手性醇的方法。根據(jù)使用催化劑的形式，可分為酶催化法和生物活性細胞催化法，二者的反應(yīng)實質(zhì)都是通過能夠催化不對稱還原的酶來進行反應(yīng)。由于酶對底物有精確的識別能力，因此，生物催化劑可以達到很高的對映體選擇性、化學(xué)選擇性和區(qū)域選擇性。此外，生物催化還具有反應(yīng)活性高、易于控制、反應(yīng)條件溫和安全、對環(huán)境的壓力小、生物催化劑大部分可再生等特點。生物不對稱還原中活性細胞催化是研究的熱點，其中活性細胞催化還原中應(yīng)用最多的為微生物細胞。生物不對稱還原1-萘乙酮獲得(S)-1-萘基-1-乙醇的研究國外已有報道，Bucciarelli M利用酵母細胞不對稱還原獲得了(S)-1-萘基-1-乙醇，但其產(chǎn)率僅僅為 25% (Bucciarelli Mj Forni A，Moretti I, Torre, G.Asymmetric reductionof trifluoromethyl and methyl ketones by yeast.Synthesisl983;11:897 - 9.)。Y.Naoshima等利用固定化的胡蘿卜細胞還原1_萘乙酮獲得(S) _1_萘基-1-乙醇產(chǎn)率為 54% ~70%，e.e.值 89% ~99%。(Y.Naoshimaj Y.Akakabej Biotransformationof aromatic ketones with cell cultures of carrot, tobacco and Gardenia.Phytochemistry30 (1991) 3595.)。NeetaA.Salvi 等利用少根根霉(Rhizopus arrhizus)還原1-萘乙酮獲得(S)-1-萘基-1-乙醇，產(chǎn)率18%，e.e.74%，耗時14d (N.A.SalvijS.Chattopadhyayj Studies on Rhizopus arrhizus mediated enantioselective reductionof arylalkanones， Tetrahedron57 (2001)2833)。 Annemarie Hagej 以 Meruliustremellosus ono991還原1-蔡乙麗獲得產(chǎn)率51%，e.e.值90%的(S)-1-蔡基-1-乙醇(A.Hage, Η.E.Asymmetric reduction of ketones via whole cell bioconversions andtransfer hydrogenation: complementary approaches.Microbiol.Biotechnol.57 (2001)79)。AshwiniL.Kamble,利用維斯假絲酵母菌(Candida viswanathii)還原1-萘乙酮獲得了 e.e.值 99% 的(S)-1-萘基-1-乙醇，反應(yīng)時間 12h (AshwiniL.Kamble, PankajSoni,Biocatalytic synthesis ofS (-)-1- (l_-naphthyl)ethanol by a novel isolateof Candida viswanathi1.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic35 (2005)1-6)。國內(nèi)尚未見白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮為(S) -1-萘基-1-乙醇的研究報道。
[0005]化學(xué)不對稱還原獲得手性芳香醇通常需要昂貴的手性催化劑，反應(yīng)過程復(fù)雜，技術(shù)難度高，反應(yīng)器具要求高，投資大，反應(yīng)過程或反應(yīng)副產(chǎn)物污染環(huán)境。酶法還原所需要的酶要經(jīng)過復(fù)雜的分離純化，且在不對稱還原時還需要加入昂貴的輔酶以保證反應(yīng)的進行。與純酶催化相比，利用微生物細胞進行催化反應(yīng)的生物還原具有明顯優(yōu)點，一般情況下，微生物細胞含有可以接受廣泛非天然底物的多種脫氫酶、所有必需的輔酶及其再生途徑，輔酶循環(huán)再生由細胞自動完成。進行不對稱還原反應(yīng)時只需要加入少量的能源物質(zhì)如葡萄糖或醇類等作為輔助底物即可，同時，所有的酶和輔酶處在天然的細胞環(huán)境中，可減少環(huán)境因素對酶活的影響。并且，全細胞生物催化省去復(fù)雜的酶分離和純化的步驟，在利用它的還原能力時極為方便。但目前使用的微生物細胞不對稱還原獲得(S)-1-萘基-1-乙醇的方法要么產(chǎn)物產(chǎn)率低，要么e.e值低，要么反應(yīng)耗時長，采用的微生物種類也相對有限。
[0006]通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關(guān)的專利公開文獻。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種在水相中利用微生物細胞不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，該方法簡單、高效、選擇性高、光學(xué)純度高、環(huán)境友好，經(jīng)還原后獲得產(chǎn)率為84%，e.e值99%的(S)-1-萘基-1-乙醇，豐富了微生物活細胞不對稱還原反應(yīng)的微生物種類。
[0008]本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案是:
[0009]一種不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S) -1-萘基-1-乙醇的方法，步驟如下:
[0010]⑴菌絲體的制備:將白地霉發(fā)酵培養(yǎng)后,收集白地霉菌絲體；
[0011]⑵白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇:
[0012]稱取白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為2~11的磷酸緩沖液制成菌體濃度為20~200mg/mL的白地霉菌懸液；
[0013]在菌懸液中以I~10mmol/100mL的濃度添加底物1-萘乙酮，然后50~180r/min、25~40°C下反應(yīng)5min~48h，得反應(yīng)液；
[0014]取反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取I~5次，將混合液在10000r/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物，其中(S) -1-萘基-1-乙醇的光學(xué)純度(e.e值)可達到99%。
[0015]而且，所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué) 純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，步驟如下:
[0016]⑴菌絲體的制備:將白地霉發(fā)酵培養(yǎng)后,收集白地霉菌絲體；[0017]⑵白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇:
[0018]稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為4的磷酸緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液；
[0019]在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，然后180r/min、30°C下反應(yīng)4h,得反應(yīng)液；
[0020]取反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取I~5次，將混合液在10000r/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物，其中(S) -1-萘基-1-乙醇的光學(xué)純度(e.e值)可達到99%。
[0021]而且，所述步驟⑵中在菌懸液中以I~lOmmol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，再進行如下處理:向添加有1-萘乙酮的菌懸液中以5~30g/L的添加量添加輔助底物，輔助底物為丙醇、乙醇、異丙醇、甲醇、甘油、葡萄糖或者果糖，然后180r/min、3(TC下反應(yīng)4h，得反應(yīng)液。
[0022]而且，所述輔助底物的添加量為20g/L。
[0023]而且，所述步驟⑴中白地霉發(fā)酵培養(yǎng)的具體步驟如下:
[0024]將斜面上的白地霉接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，180r/min，30°C下培養(yǎng)24h ;再以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，180r/min，30°C下培養(yǎng)48h。
[0025]而且，所述種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉3g/L，麥芽汁浸粉 3g/L ；
[0026]發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，麥芽汁浸粉3g/L ；
[0027]或者，發(fā)酵培養(yǎng)基組成:甘油為5~15g/L，酵母浸粉為5~10g/L，硫酸鎂為I~3g/L。
[0028]而且，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:甘油10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO4.7H202g/L。
[0029]而且，所述步驟⑴中菌絲體的制備的具體步驟為:將白地霉發(fā)酵培養(yǎng)后，得白地霉發(fā)酵液，將發(fā)酵獲得的白地霉發(fā)酵液過濾并用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液洗滌兩次，收集白地霉菌絲體。
[0030]而且，所述白地霉為白地霉WGK2-1菌株。
[0031]如上所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法的篩選方法，步驟如下:
[0032]⑴反應(yīng)體系反應(yīng)溫度的選擇
[0033]獲取白地霉WGK2-1菌絲體，稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L的pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為160mg/mL的白地霉菌懸液，在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1-萘乙酮，180r/min，不同的反應(yīng)溫度下反應(yīng)24h，反應(yīng)溫度分別為25°C、30°C、35°C、40°C，取一定體積的反應(yīng)液，用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在10000r/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率、e.e.值，選擇e.e.值最高的作為反應(yīng)溫度；
[0034]⑵反應(yīng)體系反應(yīng)轉(zhuǎn)速的選擇
[0035]獲取白地霉菌絲體，稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為160mg/mL的白地霉菌懸液，在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1-萘乙酮，30°C，不同轉(zhuǎn)速下反應(yīng)24h,轉(zhuǎn)速分別為50r/min、100r/min、180r/min,取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e.e值，選擇e.e.值最高的作為反應(yīng)轉(zhuǎn)速；
[0036]⑶反應(yīng)體系底物濃度的選擇
[0037]按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉獲取白地霉菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為160mg/mL的白地霉菌懸液。在菌懸液中添加不同濃度的底物1-萘乙酮，分別為l、2、4、5、7、10mmol/100mL，180r/min，3(TC下反應(yīng)24h。取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測，計算(S) -1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e.e值，選擇e.e.值最高的作為1_萘乙酮添加濃度；
[0038]⑷反應(yīng)體系菌體底物濃度的選擇
[0039]按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉獲取白地霉菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成不同菌體濃度的白地霉菌懸液，分別為20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL> 160mg/mL>200mg/mL 的白地霉菌懸液。在菌懸液中以lmmol/lOOmml的濃度添加底物1_萘乙酮,30°C, 180r/min下反應(yīng)24h。取一定體積的反應(yīng)液，用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算(S) -1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e .e值，選擇e.e.值最高的作為反應(yīng)液菌體濃度；
[0040](5)反應(yīng)體系反應(yīng)時間的篩選
[0041]獲取白地霉菌絲體，稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液，在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1-萘乙酮，180r/min,30°C下反應(yīng),每隔一定的時間取反應(yīng)液，分別在反應(yīng)5min、10min、20min、30min、60min、4h、8h、24h、48h取樣。將取得的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e.e.值,選擇e.e.值最高的作為反應(yīng)時間；
[0042](6)反應(yīng)體系反應(yīng)液pH的選擇
[0043]獲取白地霉菌絲體，稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH不同的緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液，pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9，在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，180r，30°C下反應(yīng)24h，取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在10000r/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測，計算(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率、e.e.值，選擇e.e.值最高的作為反應(yīng)體系的pH ;
[0044](7)反應(yīng)體系中輔助底物的添加和添加水平的選擇
[0045]獲取白地霉菌絲體，稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol的pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液，在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1-萘乙酮，以10g/L的添加量添加不同的輔助底物，分別丙醇、乙醇、異丙醇、甲醇、甘油、葡萄糖、果糖，在180r/min，30°C下反應(yīng)24h，取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算產(chǎn)率、e.e.值，選擇e.e.值最高的輔助底物；
[0046]添加不同水平的該輔助底物，添加量分別為5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L，選擇e.e.值最聞的添加量；
[0047](8)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同水平的硫酸鎂對白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的影響
[0048]在發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加不同水平的硫酸鎂，分別為0g、lg、2g、3g、4g，發(fā)酵并收集白地霉菌絲體；將收獲的白地霉菌絲體在60°C下烘至恒重，稱重得到不同發(fā)酵培養(yǎng)基可收獲的菌體干重，按步驟⑵對各個發(fā)酵培養(yǎng)基收獲的白地霉菌絲體進行1-萘乙酮的不對稱還原，并計算產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e值，選擇e.e值最高的作為硫酸鎂的添加量；
[0049](9)不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化
[0050]以葡萄糖為碳源(10g/L)，分別以酵母浸粉、蛋白胨、麥芽浸粉、黃豆粉、硫酸銨、硝酸銨、甲酸銨為氮源(5g/L)做為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵并收集白地霉菌絲體，將收獲的白地霉菌絲體在60°C下烘至恒重，稱重得到不同發(fā)酵培養(yǎng)基可收獲的菌體干重(g/L)，按步驟⑵對各個發(fā)酵培養(yǎng)基收獲的白地霉菌絲體進行1-萘乙酮的不對稱還原，并計算產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e值,選擇e.e.值最高的作為氮 源添加；
[0051](10)不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化
[0052]以酵母浸粉為氮源(5g/L)，分別以蔗糖、果糖、乳糖、甘油、甘露醇、葡萄糖、淀粉為碳源(10g/L),做為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)白地霉菌絲體按步驟⑴收集白地霉菌絲體，將收獲的白地霉菌絲體在60°C下烘至恒重，稱重得到不同發(fā)酵培養(yǎng)基可收獲的菌體干重(g/L)，按步驟⑵對各個發(fā)酵培養(yǎng)基收獲的白地霉菌絲體進行1-萘乙酮的不對稱還原，并計算產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e值,選擇e.e.值最高的作為碳源添加。
[0053]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為:
[0054]1.本發(fā)明方法利用白地霉菌株發(fā)酵獲得的白地霉菌絲體，在水相系統(tǒng)中，一定的反應(yīng)條件下對底物1-萘乙酮進行生物不對稱還原，獲得較高產(chǎn)率和對映體過量值e.e.值(%e.e.越高光學(xué)純度越高)的(S)-1-萘基-1-乙醇。白地霉不對稱還原1-萘乙酮，可獲得光學(xué)純(S) -1-萘基-1-乙醇，經(jīng)還原后獲得產(chǎn)率為84%，e.e值99%的(S) -1-萘基-1-乙醇，反應(yīng)的產(chǎn)率高，產(chǎn)物純度高，耗時短，該方法具有簡單、高效、選擇性高、光學(xué)純度高、環(huán)境友好的優(yōu)點。
[0055]2.本發(fā)明方法不但將廉價的1-萘乙酮不對稱還原為具有較高價值的降低膽固醇藥物重要手性中間體一 (S) -1-萘基-1-乙醇，而且有助于了解微生物細胞不對稱還原合成手性化合物，豐富了不對稱還原的微生物種類，對今后專用的手性微生物和手性微生物酶源的開發(fā)和不對稱還原具有重要意義。
[0056]3.本發(fā)明篩選方法經(jīng)不對稱還原體系反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了該菌不對稱還原萘乙酮獲得(S)-1-萘基-1-乙醇的反應(yīng)條件，建立了反應(yīng)體系，確定了該菌株不對稱還原反應(yīng)時添加的輔助底物種類及水平，提高了不對稱還原水平；經(jīng)過培養(yǎng)基的優(yōu)化，培養(yǎng)基發(fā)酵獲得白地霉菌絲體量和不對稱還原能力均有所提高，確定了白地霉的發(fā)酵培養(yǎng)基組成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]圖1為本發(fā)明中反應(yīng)溫度對白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的影響圖；
[0058]圖2為本發(fā)明中轉(zhuǎn)速對白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的影響圖；
[0059]圖3為本發(fā)明中底物添加濃度對白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的影響圖；
[0060]圖4為本發(fā)明中菌體濃度對白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的影響圖；
[0061]圖5為本發(fā)明中白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的時間進程圖；
[0062]圖6為本發(fā)明中緩沖液pH對白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的影響圖；
[0063]圖7為本發(fā)明中不同輔助底物對白地霉不對稱還原1-萘乙酮的影響圖；
[0064]圖8為本發(fā)明中異丙醇添加濃度對白地霉不對稱還原1-萘乙酮的影響圖；
[0065]圖9為本發(fā)明中硫酸鎂添加水平對白地霉菌體干重和不對稱還原的影響圖；
[0066]圖10為本發(fā)明中不同氮 源對白地霉生長的影響圖；
[0067]圖11為本發(fā)明中不同氮源對白地霉不對稱還原1-萘乙酮的影響圖；
[0068]圖12為本發(fā)明中不同碳源對白地霉生長的影響圖；
[0069]圖13不同碳源對白地霉不對稱還原-萘乙酮的影響圖。
【具體實施方式】
[0070]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0071 ] 如無特殊說明，本發(fā)明中所使用的試劑為常規(guī)試劑；如無特殊說明，所使用的方法為常規(guī)方法。
[0072]本發(fā)明對該白地霉的不對稱還原反應(yīng)中的各項反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，建立了反應(yīng)體系，考察了反應(yīng)體系中加入不同輔助底物和輔助底物的添加濃度的造成的影響，并且對培養(yǎng)具有高選擇性白地霉菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。
[0073]本發(fā)明中1-萘乙酮和(S)-1-萘基-1-乙醇分析方法的檢測如下:
[0074]采用安捷倫高效液相色譜1200系統(tǒng)對標品1-萘乙酮和1-萘基-1-乙醇進行檢測分析。通過安捷倫C-18柱對1-萘乙醇、1-萘基-1-乙醇標品進行分析，兩者的保留時間分別為8.46min、6.21min,具體液相條件為色譜柱AgilentTC-18 (4.6X250mm),流動相體積比為乙腈:水=6:4，流速1.0mL/min，柱溫25°C，柱壓常壓；檢測波長UV225nm，進樣量20 μ L0通過ChiraIFisienS SCDP手性柱對(R) -1-萘基-1-乙醇和(S) -1-萘基-1-乙醇標品進行分析，兩者的保留時間分別為4.20min、6.62min。具體的液相色譜條件為:手性柱ChiralFistcn? SCDP (4.6X 150mm),流動相體積比為正己燒:異丙醇=90:10,流速為0.5mL/min,柱溫為25°C，柱壓常壓；檢測波長為UV210nm。
[0075]產(chǎn)物(S) -1-萘基-1-乙醇的光學(xué)純度通過對映體過量值(％e.e.)來評價:
[0076]對映體過量值(％e.e.)=[ (Ss-Se) / (Ss+SE) ] X 100% ；
[0077]產(chǎn)率(％)= (C/C。)X 100% ；
[0078]式中Ss為(S) -1-萘基-1-乙醇的峰面積，Sk為(R) _1_萘基_1_乙醇的峰面積，C為反應(yīng)后體系中的(S) -1-萘基-1-乙醇摩爾濃度，C0為初始1-萘乙酮的摩爾濃度。
[0079]本發(fā)明中不對稱還原反應(yīng)白地霉的確定:將實驗室保存的從新疆傳統(tǒng)乳制品中分離出的白地霉菌株WGK2-1對1-萘乙酮在水相中進行不對稱還原，以(S)-1-萘基-1-乙醇的產(chǎn)率和光學(xué)純度(e.e.值)為指標，考察其不對稱還原萘乙酮的能力。結(jié)果表明，其不對稱還原萘乙酮獲得萘乙醇的產(chǎn)率為57%，e.e值為99%。
[0080]本發(fā)明白地霉菌絲體不對稱還原反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化的總體思路如下:
[0081]1.白地霉菌的培養(yǎng)及白地霉菌絲體的制備
[0082]將平板上的白地霉菌絲體接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h獲得種子液。以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，180r/min培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液中的菌絲體過濾并用pH為7的0.2mol/L磷酸緩沖液洗滌兩次，將收集的白地霉菌絲體用于還原反應(yīng)。
[0083]2.白地霉菌絲體的不對稱還原反應(yīng)
[0084]將得到的白地霉菌絲體用一定pH的0.2mol/L緩沖液制成一定濃度的白地霉菌絲懸液，反應(yīng)在菌懸液中進行?？疾旆磻?yīng)體系PH2~11，反應(yīng)溫度25~40°C，轉(zhuǎn)速50~180r/min,菌懸液濃度20~200mg/mL,底物濃度I~lOmmol/lOOmL,反應(yīng)時間5min~48h對白地霉菌絲體不對稱還原萘乙酮的影響(以產(chǎn)率和e.e值為指標)。
[0085]3.不同輔助底物及輔助底物濃度對白地霉菌絲體不對稱還原萘乙酮的影響
[0086](I)在白地霉菌絲體不對稱還原萘乙酮的反應(yīng)體系中加入不同的輔助底物，如丙醇、乙醇、甲醇、異丙醇、甘油、葡萄糖、果糖等，不同輔助底物對不對稱還原反應(yīng)的影響。
[0087](2)在考察不同輔助底物種類的基礎(chǔ)上考察某種輔助底物添加濃度對不對稱還原反應(yīng)的影響，如異丙醇添加5~30g/L對不對稱還原反應(yīng)的影響。
[0088]4.菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)優(yōu)化
[0089](1)不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基如蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、甘油、淀粉等對白地霉菌體培養(yǎng)(以菌體干重為指標)及不對稱還原的影響；碳源添加水平對白地霉培養(yǎng)及不對稱還原反應(yīng)的影響。
[0090](2)不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基如酵母浸粉、蛋白胨、黃豆粉、硫酸銨、硝酸銨等對白地霉菌體培養(yǎng)和不對稱還原反應(yīng)的影響；氮源添加水平對白地霉培養(yǎng)及不對稱還原反應(yīng)的影響。
[0091](3)添加硫酸鎂及添加水平對白地霉菌體培養(yǎng)和不對稱還原反應(yīng)的影響
[0092](4)培養(yǎng)基中添加其他金屬離子對白地霉培養(yǎng)和不對稱還原反應(yīng)的影響，如硫酸錳、硫酸銅、硫酸鋅、氯化鈣等。
[0093](5)采用正交實驗最終確定白地霉發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。優(yōu)化后白地霉菌絲體不對稱還原萘乙酮為(S) -1-萘基-1-乙醇的產(chǎn)率為84%，e.e值為99%。
[0094]本發(fā)明所使用的白地霉為具有不對稱還原能力的微生物白地霉，其為可以不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌株，菌株的名稱為WGK2-1，分類命名為:白地霉Geotrichum candidum，保存編號為:CGMCCN0.5259，保藏日期:2011年09月20日，保藏單位為:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。(專利號:ZL201110439277.0，發(fā)明創(chuàng)造名稱:一種高產(chǎn)胞外多糖的產(chǎn)香白地霉菌株及胞外多糖和揮發(fā)性風味物質(zhì)。)
[0095]一種不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S) -1-萘基-1-乙醇的方法，步驟如下:[0096]⑴白地霉WGK2-1菌株的培養(yǎng):
[0097]將斜面上的白地霉接種于IOOmL種子液培養(yǎng)基中，180r/min，30°C下培養(yǎng)24h ；再以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝液lOOmL)，180r/min，30°C下培養(yǎng)48h ；
[0098]其中，種子培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸粉3，麥芽汁浸粉3 ;
[0099]發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸粉5，麥芽汁浸粉3 ;
[0100]或者，發(fā)酵培養(yǎng)基組成:甘油為5~15g/L，酵母浸粉為5~10g/L，硫酸鎂為I~3g/L ；
[0101]發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)選:甘油10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO4 ? 7H202g/L。
[0102]白地霉WGK2-1菌絲體的制備:將發(fā)酵獲得的白地霉發(fā)酵液過濾并用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液洗滌兩次，收集白地霉菌絲體。
[0103]⑵白地霉WGK2-1菌絲體不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇:
[0104]稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為2~9的磷酸緩沖液制成菌體濃度為20~200mg/mL的白地霉菌懸液；
[0105]在菌懸液中 以I~lOmmol/lOOmL的濃度添加底物1-萘乙酮，50~180r/min, 25~40°C下反應(yīng)5min~48h,得反應(yīng)液；
[0106]取反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在10000r/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物，其中(S) -1-萘基-1-乙醇的光學(xué)純度(e.e值)可達到99%。
[0107]檢測結(jié)果:
[0108]將光學(xué)純(S) -1-萘基-1-乙醇用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，產(chǎn)物(S) -1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率為57%，e.e.值為99%。
[0109]以上檢測結(jié)果表明，白地霉菌株WGK2-1具有不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇的能力，且產(chǎn)物有較高的e.e.值。
[0110]上述白地霉菌株WGK2-1菌絲體的不對稱還原反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)條件的篩選方法，步驟如下:
[0111](I)白地霉WGK2-1菌株的培養(yǎng):
[0112]將斜面上的白地霉接種于IOOmL種子液培養(yǎng)基中，180r/min，30°C下培養(yǎng)24h。再以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝液lOOmL)，180r/min，30°C下培養(yǎng)48h。種子培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸粉3，麥芽汁浸粉3。發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸粉5，麥芽汁浸粉3。
[0113]白地霉WGK2-1菌絲體的制備:將發(fā)酵獲得的白地霉發(fā)酵液過濾并用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液洗滌兩次，收集白地霉菌絲體。
[0114]⑵白地霉WGK2-1菌絲體不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇:
[0115]稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為I的磷酸緩沖液制成菌體濃度為160mg/mL的白地霉菌懸液。在菌懸液中以I~lOmmol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，180r/min, 25~40°C下反應(yīng)24h。取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物，用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，產(chǎn)物(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率為57%，e.e.值為99%。白地霉菌株WGK2-1具有不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇的能力，且產(chǎn)物有較高的e.e.值。
[0116]⑶反應(yīng)體系反應(yīng)溫度的選擇
[0117]按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉獲取白地霉WGK2-1菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L的pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為160mg/mL的白地霉菌懸液。在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，180r/min,不同的反應(yīng)溫度下反應(yīng)24h，反應(yīng)溫度分別為25V、30 V、35°C、40 V。取一定體積的反應(yīng)液，用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率、e.e.值。結(jié)果如圖1所示。
[0118]根據(jù)圖1，選擇30°C為白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的反應(yīng)溫度。
[0119]⑷反應(yīng)體系反應(yīng)轉(zhuǎn)速的選擇
[0120]按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉WGK2-1，獲取白地霉菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為160mg/mL的白地霉菌懸液。在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，30°C，不同轉(zhuǎn)速下反應(yīng)24h，轉(zhuǎn)速分別為50r/min、100r/min、180r/min。取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次,將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢 測分析，計算(S) -1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e.e值。結(jié)果如圖2所示。
[0121 ] (5)反應(yīng)體系底物濃度的選擇
[0122]按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉獲取白地霉菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用
0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為160mg/mL的白地霉菌懸液。在菌懸液中添加不同濃度的底物1-萘乙酮，分別為l、2、4、5、7、10mmol/100mL，180r/min，3(TC下反應(yīng)24h。取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測，計算(S) -1-萘基-1-乙醇廣率和e.e值。結(jié)果如圖3所不。
[0123]根據(jù)圖3，選擇Immol/lOOmL為1-萘乙酮添加濃度。
[0124](6)反應(yīng)體系菌體底物濃度的選擇
[0125]按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉獲取白地霉菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用
0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成不同菌體濃度的白地霉菌懸液，分別為20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL> 160mg/mL>200mg/mL 的白地霉菌懸液。在菌懸液中以lmmol/lOOmml的濃度添加底物1_萘乙酮,30°C, 180r/min下反應(yīng)24h。取一定體積的反應(yīng)液，用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算(S) -1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e.e值。結(jié)果如圖4所示。
[0126]根據(jù)圖4,選擇60mg/mL為反應(yīng)液菌體濃度。
[0127](7)反應(yīng)體系反應(yīng)時間的篩選
[0128]按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉獲取白地霉菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用
0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液。在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，180r/min, 30°C下反應(yīng)48h,每隔一定的時間取反應(yīng)液，分別在反應(yīng)5min、10min、20min、30min、60min、4h、8h、24h、48h取樣。將取得的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在10000r/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算
(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e.e.值。結(jié)果如圖5所示。
[0129]根據(jù)圖5，選擇4h為反應(yīng)終止時間。
[0130]⑶反應(yīng)體系反應(yīng)液pH的選擇
[0131]按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉獲取白地霉菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用
0.2mol/L、pH不同的緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液，pH分別為2、3、4、5、
6、7、8、9。在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1-萘乙酮，180r，30°C下反應(yīng)24h。取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測，計算(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率、e.e.值。結(jié)果如圖6所示。
[0132]根據(jù)圖6，選擇反應(yīng)體系的pH為4。
[0133]⑶反應(yīng)體系中輔助底物的添加和添加水平的選擇
[0134]按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉獲取白地霉菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用
0.2mol的pH值為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液。在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，以10g/L的添加量添加不同的輔助底物，分別丙醇、乙醇、異丙醇、甲醇、甘油、葡萄糖、果糖，在180r/min，3(TC下反應(yīng)24h。取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算產(chǎn)率、e.e.值。檢測結(jié)果顯示添加不同的輔助底物參與反應(yīng)，產(chǎn)物e.e.值均大于99%，產(chǎn)率不同，產(chǎn)率結(jié)果如圖7所示。
[0135]根據(jù)圖7，選擇異丙醇為輔助底物。并添加不同水平的輔助底物異丙醇，添加量分別為5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L。結(jié)果如圖8所示，選擇合適的添加量為20g/L。
[0136](W)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同水平的硫酸鎂對白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的影響
[0137]在發(fā)酵培養(yǎng)基中(葡萄糖10g/L，酵母浸粉5g/L)，添加不同水平的硫酸鎂(MgSO4 ? 7H20)，分別為0g、lg、2g、3g、4g，按步驟⑴發(fā)酵并收集白地霉菌絲體。將收獲的白地霉菌絲體在60°C下烘至恒重，稱重得到不同發(fā)酵培養(yǎng)基可收獲的菌體干重(g/L)。按步驟⑵對各個發(fā)酵培養(yǎng)基收獲的白地霉菌絲體進行1-萘乙酮的不對稱還原，并計算產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e值。結(jié)果顯示，添加不同水平硫酸鎂進行發(fā)酵收獲的白地霉菌絲體進行不對稱還原反應(yīng)，收獲菌體干重相似，產(chǎn)物的e.e.值均大于99%，但產(chǎn)率不同，結(jié)果如圖9所示。
[0138](11)不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化
[0139]以葡萄糖為碳源(10g/L)，分別以酵母浸粉、蛋白胨、麥芽浸粉、黃豆粉、硫酸銨、硝酸銨、甲酸銨為氮源(5g/L)做為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，按步驟⑴發(fā)酵并收集白地霉菌絲體。將收獲的白地霉菌絲體在60°C下烘至恒重，稱重得到不同發(fā)酵培養(yǎng)基可收獲的菌體干重(g/L)。按步驟⑵對各個發(fā)酵培養(yǎng)基 收獲的白地霉菌絲體進行1-萘乙酮的不對稱還原，并計算產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e值。結(jié)果如圖10、11所示。
[0140]根據(jù)圖10、11，選取酵母浸粉為氮源。
[0141](12)不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化
[0142]以酵母浸粉為氮源(5g/L)，分別以蔗糖、果糖、乳糖、甘油、甘露醇、葡萄糖、淀粉為碳源(10g/L),作為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)白地霉菌絲體按步驟⑴收集白地霉菌絲體。將收獲的白地霉菌絲體在60°C下烘至恒重，稱重得到不同發(fā)酵培養(yǎng)基可收獲的菌體干重(g/L)。按步驟⑵對各個發(fā)酵培養(yǎng)基收獲的白地霉菌絲體進行1-萘乙酮的不對稱還原，并計算產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e值。結(jié)果如圖12、13所示。
[0143]根據(jù)以上結(jié)果，選取甘油為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源。
[0144](13)正交試驗優(yōu)化不對稱還原1-萘乙酮的白地霉發(fā)酵培養(yǎng)基
[0145]對白地霉發(fā)酵培養(yǎng)基進行三因素三水平的正交實驗，三因素分別為甘油、酵母浸粉、硫酸鎂，甘油水平分別為5g/L、10g/L、15g/L，酵母水平分別為5g/L、7g/L、10g/L，硫酸鎂水平為lg/L、2g/L、3g/L，正交表如表1所示。按正交設(shè)計表配置發(fā)酵培養(yǎng)基并按實施例1中的發(fā)酵方法進行培養(yǎng)，并收集白地霉菌絲體。菌絲體60°C下烘至恒重，稱重得到菌體干重。白地霉菌絲體按實施例2進行不對稱還原1-萘乙酮的反應(yīng)，計算產(chǎn)物產(chǎn)率，實驗結(jié)果和正交結(jié)果分析如表2、3所示。根據(jù)正交結(jié)果及分析，確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:甘油IOg/L，酵母浸粉10g/L，MgSO4 WH2C^gzl15在此培養(yǎng)基下按步驟⑴培養(yǎng)收集白地霉菌絲體，按步驟⑵進行白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的反應(yīng)，產(chǎn)物(S) -1-萘基-1-乙醇的產(chǎn)率為84%, e.e 值為 99%。
[0146]表1
[0147]
【權(quán)利要求】
1.一種不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S) -1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:步驟如下: ⑴菌絲體的制備:將白地霉發(fā)酵培養(yǎng)后，收集白地霉菌絲體； ⑵白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇: 稱取白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為2~11的磷酸緩沖液制成菌體濃度為20~200mg/mL的白地霉菌懸液； 在菌懸液中以I~lOmmol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，然后50~180r/min、25~40°C下反應(yīng)5min~48h，得反應(yīng)液； 取反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取I~5次,將混合液在10000r/min下離心IOmin,取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物，其中(S) -1-萘基-1-乙醇的光學(xué)純度(e.e值)可達到99%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:步驟如下: ⑴菌絲體的制備:將白地霉發(fā)酵培養(yǎng)后，收集白地霉菌絲體； ⑵白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮為(S) -1-萘基-1-乙醇: 稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為4的磷酸緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液； 在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，然后180r/min、30°C下反應(yīng)4h,得反應(yīng)液； 取反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取I~5次,將混合液在10000r/min下離心IOmin,取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物，其中(S) -1-萘基-1-乙醇的光學(xué)純度(e.e值)可達到99%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述步驟⑵中在菌懸液中以I~lOmmol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，再進行如下處理:向添加有1-萘乙酮的菌懸液中以5~30g/L的添加量添加輔助底物，輔助底物為丙醇、乙醇、異丙醇、甲醇、甘油、葡萄糖或者果糖，然后180r/min、3(TC下反應(yīng)4h，得反應(yīng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述輔助底物的添加量為20g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述步驟⑴中白地霉發(fā)酵培養(yǎng)的具體步驟如下: 將斜面上的白地霉接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，180r/min，30°C下培養(yǎng)24h ;再以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，180r/min，30°C下培養(yǎng)48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉3g/L，麥芽汁浸粉3g/L ； 發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，麥芽汁浸粉3g/L ;或者，發(fā)酵培養(yǎng)基組成:甘油為5~15g/L，酵母浸粉為5~10g/L，硫酸鎂為I~3g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:甘油10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO4.7H202g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述步驟⑴中菌絲體的制備的具體步驟為:將白地霉發(fā)酵培養(yǎng)后，得白地霉發(fā)酵液，將發(fā)酵獲得的白地霉發(fā)酵液過濾并用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液洗滌兩次，收集白地霉菌絲體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述白地霉為白地霉WGK2-1菌株。
10.一種如權(quán)利要求1至9任一項所述的不對稱還原1-萘乙酮為光學(xué)純(S) -1-萘基-1-乙醇的方法的篩選方法，其特征在于:步驟如下: ⑴反應(yīng)體系反應(yīng)溫度的選擇 獲取白地霉WGK2-1菌絲體，稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L的pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為160mg/mL的白地霉菌懸液，在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1-萘乙酮，180r/min，不同的反應(yīng)溫度下反應(yīng)24h，反應(yīng)溫度分別為25°C、30°C、35°C、40°C，取一定體積的反應(yīng)液，用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在10000r/min下離心IOmin,取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率、e.e.值，選擇e.e.值最高的作為反應(yīng)溫度； ⑵反應(yīng)體系反應(yīng)轉(zhuǎn)速的選擇 獲取白地霉菌絲體，稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為160mg/mL的白地霉菌懸液，在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1-萘乙酮，30°C，不同轉(zhuǎn)速下反應(yīng)24h,轉(zhuǎn)速分別為50r/min、100r/min、180r/min,取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e.e值，選擇e.e.值最高的作為反應(yīng)轉(zhuǎn)速； ⑶反應(yīng)體系底物濃度的選擇 按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉獲取白地霉菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用.0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為160mg/mL的白地霉菌懸液。在菌懸液中添加不同濃度的底物1-萘乙酮，分別為l、2、4、5、7、10mmol/100mL，180r/min，3(TC下反應(yīng)24h。取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心IOmin,取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測，計算(S) -1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e.e值，選擇e.e.值最高的作為1_萘乙酮添加濃度； ⑷反應(yīng)體系菌體底物濃度的選擇 按步驟⑴的方法培養(yǎng)白地霉獲取白地霉菌絲體。稱取一定量的白地霉菌絲體，用.0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成不同菌體濃度的白地霉菌懸液，分別為20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL> 160mg/mL>200mg/mL 的白地霉菌懸液。在菌懸液中以lmmol/lOOmml的濃度添加底物1_萘乙酮,30°C, 180r/min下反應(yīng)24h。取一定體積的反應(yīng)液，用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算(S) -1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e.e值，選擇e.e.值最高的作為反應(yīng)液菌體濃度； (5)反應(yīng)體系反應(yīng)時間的篩選 獲取白地霉菌絲體，稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液，在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，180r/min,30°C下反應(yīng)，每隔一定的時間取反應(yīng)液，分別在反應(yīng)5min、10min、20min、30min、60min、4h、8h、24h、48h取樣。將取得的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率和e.e.值，選擇e.e.值最高的作為反應(yīng)時間； (6)反應(yīng)體系反應(yīng)液pH的選擇 獲取白地霉菌絲體，稱取一定量的白地霉菌絲體，用0.2mol/L、pH不同的緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液，pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9，在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1_萘乙酮，180r，30°C下反應(yīng)24h，取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在10000r/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測，計算(S)-1-萘基-1-乙醇產(chǎn)率、e.e.值，選擇e.e.值最高的作為反應(yīng)體系的pH ; (7)反應(yīng)體系中輔助底物的添加和添加水平的選擇 獲取白地霉菌絲體，稱取一定量 的白地霉菌絲體，用0.2mol的pH為7的磷酸緩沖液制成菌體濃度為60mg/mL的白地霉菌懸液，在菌懸液中以Immol/lOOmL的濃度添加底物1-萘乙酮，以10g/L的添加量添加不同的輔助底物，分別丙醇、乙醇、異丙醇、甲醇、甘油、葡萄糖、果糖，在180r/min，30°C下反應(yīng)24h，取一定體積的反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，將混合液在lOOOOr/min下離心lOmin，取有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸有機相得到油狀物并用乙醇溶解，將樣品用高效液相檢測分析，計算產(chǎn)率、e.e.值，選擇e.e.值最高的輔助底物； 添加不同水平的該輔助底物，添加量分別為5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L，選擇e.e.值最聞的添加量； ⑶在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同水平的硫酸鎂對白地霉菌絲體不對稱還原1-萘乙酮的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加不同水平的硫酸鎂，分別為Og、lg、2g、3g、4g，發(fā)酵并收集白地霉菌絲體；將收獲的白地霉菌絲體在60°C下烘至恒重，稱重得到不同發(fā)酵培養(yǎng)基可收獲的菌體干重，按步驟⑵對各個發(fā)酵培養(yǎng)基收獲的白地霉菌絲體進行1-萘乙酮的不對稱還原，并計算產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e值，選擇e.e值最高的作為硫酸鎂的添加量； (9)不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化 以葡萄糖為碳源(10g/L)，分別以酵母浸粉、蛋白胨、麥芽浸粉、黃豆粉、硫酸銨、硝酸銨、甲酸銨為氮源(5g/L)做為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵并收集白地霉菌絲體，將收獲的白地霉菌絲體在60°C下烘至恒重，稱重得到不同發(fā)酵培養(yǎng)基可收獲的菌體干重(g/L)，按步驟⑵對各個發(fā)酵培養(yǎng)基收獲的白地霉菌絲體進行1-萘乙酮的不對稱還原，并計算產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e值,選擇e.e.值最高的作為氮源添加；(10)不對稱還原1-萘乙酮為(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化 以酵母浸粉為氮源(5g/L)，分別以蔗糖、果糖、乳糖、甘油、甘露醇、葡萄糖、淀粉為碳源(10g/L)，作為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)白地霉菌絲體按步驟⑴收集白地霉菌絲體，將收獲的白地霉菌絲體在60°C下烘至恒重，稱重得到不同發(fā)酵培養(yǎng)基可收獲的菌體干重(g/L)，按步驟⑵對各個發(fā)酵培養(yǎng)基收獲的白地霉菌絲體進行1-萘乙酮的不對稱還原，并計算產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e值,選擇e.e.值最高的 作為碳源添加。
【文檔編號】C12P7/22GK103642849SQ201310684508
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】王昌祿, 郭敏, 李貞景, 陳勉華, 李風娟 申請人:天津市食品加工工程中心