基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)綠豆ssr引物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法，包括：獲得綠豆全基因組轉(zhuǎn)錄本的集合，形成序列數(shù)據(jù)庫；用Trinity將測序序列拼接成一個(gè)轉(zhuǎn)錄組，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene；Unigene序列生物信息學(xué)分析；采用MISA1.0對Unigene進(jìn)行SSR檢測；用Primer3進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)，并進(jìn)行SSR引物多態(tài)性鑒定。應(yīng)用本方法成功設(shè)計(jì)了13134對SSR引物，從中隨機(jī)選取50對引物對來源于不同國家共8份綠豆DNA進(jìn)行驗(yàn)證，其中多態(tài)引物共有32對，利用這32對SSR引物可以區(qū)分不同地理來源的綠豆材料。本發(fā)明方法方便、快捷、準(zhǔn)確且成本低廉，為綠豆SSR引物開發(fā)提供了新思路。
【專利說明】基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及生物信息學(xué)，具體地說，涉及一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]綠豆(Vigna radiata)是一種豆科、蝶形花亞科紅豆屬植物,原產(chǎn)印度、緬甸地區(qū)?，F(xiàn)在東亞各國普遍種植，非洲、歐洲、美國也有少量種植，中國是綠豆[Vigna radiata(L.)Wilczek]的發(fā)源地之一，擁有類型繁多的綠豆品種資源。中國、緬甸等國是主要的綠豆出口國。由于其生育期短、適應(yīng)性廣，且具有較好的固氮能力，所以是種植業(yè)資源合理配置、倒茬輪作、間作套種、減災(zāi)救災(zāi)不可缺少的糧食作物及貧困地區(qū)農(nóng)民致富的重要經(jīng)濟(jì)作物；同時(shí)綠豆富含蛋白、中淀粉及低脂肪，是理想的營養(yǎng)保健食品。種子和莖被廣泛食用，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值。綠豆還可產(chǎn)成多種食品如鮮食豆芽、綠豆粉絲、綠豆粉皮、綠豆酒、綠豆糕等食品，在國際市場上備受青睞。近年來，國際市場對綠豆的需求量和全世界綠豆的生產(chǎn)量均有所增加，現(xiàn)今中國的綠豆年出口量在20-30萬噸，出口價(jià)格一般400-500美元。綠豆的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值不容忽視。然而，與大宗作物如玉米、水稻相比，國內(nèi)外對綠豆的研究還相當(dāng)滯后，單產(chǎn)仍處于較低水平，分子水平的研究更顯薄弱。
[0003]分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，能在DNA水平上反映植物遺傳基礎(chǔ)的差異，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。簡單重復(fù)序列(SSR)廣泛分布于各類真核生物基因組的不同位置，由于SSR的重復(fù)次數(shù)不同和重復(fù)程度不同，使其呈現(xiàn)聞度的多態(tài)性。與其它分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR標(biāo)記具有多態(tài)信息含量聞、共顯性遺傳、技術(shù)簡單、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、操作便利、并在基因組中分散分布等優(yōu)點(diǎn)已成為最受人們歡迎的分子標(biāo)記之一，被認(rèn)為是可靠性最高的分子標(biāo)記類型之一。在許多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但SSR標(biāo)記的主要缺點(diǎn)是首先要從該物種中獲取重復(fù)序列兩側(cè)的序列信息，并設(shè)計(jì)引物，而后才能被利用。
[0004]SSR標(biāo)記可分為基因組SSR(gSSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(EST-SSR)，EST-SSR標(biāo)記源于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)，與gSSR標(biāo)記相比，其多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)，因此，比gSSR標(biāo)記具有更高通用性，更經(jīng)濟(jì)，更高效率。利用第二代測序技術(shù)可以對全基因組范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行大規(guī)模的高通量測序，并能產(chǎn)生較之EST測序更為海量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，這為功能基因組SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了更豐富和極有價(jià)值的可利用資源。
[0005]轉(zhuǎn)錄組序列的數(shù)量與日俱增，使得通過數(shù)據(jù)庫搜尋法獲得SSR成為可能。但是從第二代測序技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)往往極其巨大，對大量的EST序列進(jìn)行格式處理，剔除冗余序列等仍是一個(gè)不小的工作量。Perl是一種自由且功能強(qiáng)大的編程語言。它被用作Web編程、數(shù)據(jù)庫處理、XML處理以及系統(tǒng)管理等。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，Perl更多的應(yīng)用到了生物數(shù)據(jù)的操作和檢索中，使得對大批量數(shù)據(jù)統(tǒng)一處理成為可能。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行EST-SSR引物開發(fā)更能提高分離效率，節(jié)約時(shí)間和資金。
[0006]目前綠豆尚無全基因組序列信息，綠豆SSR引物數(shù)量較少。對于無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析，可先將測序所得的序列拼接成轉(zhuǎn)錄本，以轉(zhuǎn)錄本為參考序列，進(jìn)行后續(xù)分析。利用第二代高通量測序技術(shù)獲得綠豆內(nèi)某一材料的轉(zhuǎn)錄組序列信息，批量開發(fā)SSR引物的技術(shù)成熟，將會(huì)對綠豆重要性狀基因的定位、克隆及分子標(biāo)記輔助選擇育種和比較基因組學(xué)研究等起重要推動(dòng)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法，所述方法包括以下步驟:[0009]I)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫:提取綠豆葉片總RNA,分離出mRNA,反轉(zhuǎn)錄并合成雙鏈cDNA,純化cDNA，在cDNA末端添加腺嘌呤核苷并連接測序接頭，然后通過瓊脂糖凝膠電泳回收200-700bp片段，對回收片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即構(gòu)建得到轉(zhuǎn)錄組文庫；
[0010]2)對上述轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行測序，利用軟件Trinity將測序序列拼接成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄組，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene,并對Unigene序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；
[0011]3)采用軟件MISA1.0對上述Unigene進(jìn)行SSR檢測；
[0012]4)采用軟件Primer3進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)，并鑒定SSR引物的多態(tài)性。
[0013]其中，步驟I)中所述測序接頭為:
[0014]5' RNA Adapter:5/ -GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'
[0015]3' RNA Adapter:5/ -ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'。
[0016]步驟2)中所述軟件Trinity的版本為ν2012_10_05 ;參數(shù)設(shè)置:min_kmer_cov為
2,其它參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。
[0017]步驟2)中所述生物信息學(xué)分析包括但不限于基因注釋XDS預(yù)測和差異表達(dá)基因篩選等。所述基因注釋包括基因表達(dá)量注釋和/或基因功能注釋。所述差異表達(dá)基因篩選包括GO功能顯著性富集分析和/或Pathway顯著性富集分析。
[0018]步驟4)中進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)使用的參數(shù)為:引物長度18-22bp，Tm55_65°C，產(chǎn)物大小 100-300bp。
[0019]步驟4)中用于鑒定SSR引物多態(tài)性的綠豆選自中國中綠I號、中綠5號；泰國VC2778A、TC1966 ;俄羅斯1810、1865 ;澳大利亞ACC814、ACC41等中的至少一種。
[0020]本發(fā)明還提供根據(jù)上述方法開發(fā)出的綠豆SSR引物，所述SSR引物的序列如SEQID N0.1-64 所示。
[0021]本發(fā)明進(jìn)一步提供根據(jù)上述方法開發(fā)的綠豆SSR引物在綠豆分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0022]具體地，本發(fā)明提供的一種基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)綠豆SSR引物的方法，包括如下步驟:
[0023]I)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得
[0024]提取綠豆葉片總RNA，分離出mRNA，反轉(zhuǎn)錄并合成雙鏈cDNA，純化cDNA，進(jìn)行末端修復(fù)，加A并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM2000利用雙末端測序(Paired-End)的方法進(jìn)行測序，獲得綠豆轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品個(gè)體的測序數(shù)據(jù)量為5GbClean Data。
[0025]2) SSR序列的識別
[0026]首先安裝Perl 語言，從 http://pgrc.lpk_gatersleben.de/misa 網(wǎng)站下載est_trimmer.pi,去除轉(zhuǎn)錄組序列中過短的序列和過長的序列；從http://www.bioinformatics, org/cd-hit/ 中下載 CD_HIT 軟件，去除冗余序列。
[0027]從http://pgrc.lpk-gatersleben.de/misa 網(wǎng)站下載使用 MISA 軟件以識別和定位序列中SSR，參數(shù)設(shè)置如下:單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重復(fù)次數(shù)至少為10、6、5、3、3、3。
[0028]3) SSR引物的設(shè)計(jì)
[0029]使用Primer3 批量設(shè)計(jì) SSR 引物，網(wǎng)址:http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/l.1.4/primer3-l.1.4-ffINXP.zip/download,引物設(shè)計(jì)參數(shù)為引物長度18-22bp，Tm55-65°C，其中前后引物Tm值相差4°C，產(chǎn)物大小為100_300bp。
[0030]4) SSR引物對來源于4個(gè)不同國家的8份綠豆DNA的多態(tài)性鑒定
[0031]從所開發(fā)13134對SSR引物中隨機(jī)選取50對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
[0032]本發(fā)明提供一種無基因組參考轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方，包括如下步驟:獲得綠豆全基因組轉(zhuǎn)錄本的集合，形成序列數(shù)據(jù)庫；用Trinity將測序序列拼接成一個(gè)轉(zhuǎn)錄組，以此作為后續(xù)分析的參考序列，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene ；Unigene序列生物信息學(xué)分析；采用MISA1.0對Unigene進(jìn)行SSR檢測；用Primer3進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)，并進(jìn)行SSR引物多態(tài)性鑒定。本發(fā)明還提供了獲得綠豆的轉(zhuǎn)錄組信息及功能基因的方法。應(yīng)用本方法成功設(shè)計(jì)了 13134對SSR引物，從中隨機(jī)選取50對引物對來源于不同國家共8份綠豆DNA進(jìn)行驗(yàn)證，其中有46對SSR引物在100_300bp檢測到清晰條帶，表明引物設(shè)計(jì)成功率較高，其中多態(tài)的引物共有32對，利用這32對SSR弓丨物可以區(qū)分不同地理來源的綠豆材料。本發(fā)明方法方便、快捷、準(zhǔn)確且成本低廉，為綠豆SSR引物開發(fā)提供了新思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中建庫測序流程示意圖。
[0034]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中RNA-seq數(shù)據(jù)分析流程示意圖。
[0035]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組生物信息分析流程示意圖。
[0036]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中拼接得到的Unigene長度分布圖。
[0037]圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中SSR密度分布圖。
[0038]圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中部分SSR重復(fù)基元類型和數(shù)量。
[0039]圖7為本發(fā)明實(shí)施例3中利用部分SSR引物對來源于4個(gè)國家(中國、泰國、澳大利亞、俄羅斯各2份)共8份綠豆DNA進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0040]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0041]以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均從常規(guī)生化試劑商店購買得到。Trizol, RNase H 和 Superscript Ilreversetranscriptase 試劑盒均購自 Invitrogen 公司。DNA聚合酶I購自NEB公司。在cDNA片段上錨定的接頭序列購于由Illumina測序試劑盒。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0042]實(shí)施例lRNA-seq分析及SSR引物的設(shè)計(jì)
[0043]一、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得
[0044]利用Trizol試劑提取綠豆整株幼苗總RNA,用帶有Oligo(dT)磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板,用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈,然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)，加A并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建好的測序文庫用11 IuminaHiseq2000 進(jìn)行測序。
[0045]反轉(zhuǎn)錄并合成雙鏈cDNA，純化cDNA，進(jìn)行末端修復(fù)，加A并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。樣品的建庫測序流程見圖1。具體方法如下:
[0046]1.綠豆 Total RNA 的提取
[0047]采用常規(guī)的Trizol法提取，純化，DNA酶處理，獲得濃度≤50ng/l. 1、總量≤3μ g、0D260/280為1.8-2.2的Total RNA樣品(電泳檢測和NanoDrop初檢，再優(yōu)選擇樣品進(jìn)行Qubit 定量和 Agilent2100 檢測)。
[0048]2.mRNA的分離及隨機(jī)打斷
[0049]用帶有oligo-dT的磁珠分離出帶有polyA的mRNA,然后利用超聲波隨機(jī)打斷，回收200_700bp的片段。
[0050]3.cDNA第一鏈和第二鏈的合成
[0051]cDNA 第一鏈的合成是用隨機(jī) 6 聚物和 Superscript II reverse transcriptase試劑盒進(jìn)行。cDNA第二鏈?zhǔn)怯肦Nase H和DNA聚合酶I完成。
[0052]4.在cDNA片段上錨定的接頭序列:
[0053]5' RNA Adapter(SEQ ID NO:1):
[0054]5' -GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'；
[0055]3' RNA Adapter(SEQ ID NO:2):
[0056]5' -ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3/ 。
[0057]5.PCR擴(kuò)增用上述接頭序列中的引物進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。
[0058]6.文庫構(gòu)建及檢測利用上述步驟中得到的序列，按照Illumina公司sample prepkit進(jìn)行文庫構(gòu)建及檢測。
[0059]7.RNA-seq 的測序
[0060]將建好的文庫以5_7pM的濃度加到Illumina測序儀(Genome Analyzer II)的相應(yīng)通道上，運(yùn)行36個(gè)循環(huán)。
[0061]8.數(shù)據(jù)分析[0062]RNA-seq數(shù)據(jù)分析流程見圖2。剔除雜質(zhì)數(shù)據(jù)，對RNA-seq組裝后的結(jié)果進(jìn)行整合。之前的步驟得到的是原始數(shù)據(jù)，其中含有步驟4中加入的接頭序列，將其去除后稱為Cleanreads，就可以進(jìn)行拼接與組裝。具體方法是利用將得到的Cleanreads，采用針對轉(zhuǎn)錄組拼接的Trinity (版本:v2012-10_05 ;參數(shù)設(shè)置:min_kmer_cov為2，其它參數(shù)為默認(rèn)參數(shù))軟件進(jìn)行拼接。用Trinity將測序序列拼接成一個(gè)轉(zhuǎn)錄組，以此作為后續(xù)分析的參考序列。取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene。
[0063]9.生物信息學(xué)分析
[0064]無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組生物信息分析流程見圖3。將上述得到的Unigene序列與蛋白數(shù)據(jù)庫 nr、Swiss-Prot、KEGG 和 KOG 進(jìn)行 blastx 比對(evalue < 0.00001),取比對結(jié)果最好的蛋白確定Unigene的序列方向。如果不同庫之間的比對結(jié)果有矛盾，貝!J按nr、Swiss-Prot、KEGG和KOG的優(yōu)先級確定Unigene的序列方向，跟上述4個(gè)庫皆比不上的Unigene,用軟件ESTScan預(yù)測其編碼區(qū)并確定序列的方向。對于能確定序列方向的Unigene,給出其從5'到3'方向的序列；對于無法確定序列方向的Unigene,給出組裝軟件得到的序列。對這些基因進(jìn)行了功能注釋，包括KOG分類及GO注釋。部分分析情況如圖4所示。
[0065]二、SSR引物的識別
[0066]安裝 Perl 語言，從 http://pgrc.lpk-gatersleben.de/misa/ 下載 est_trimme;r.pl并運(yùn)行，去除轉(zhuǎn)錄組序列中小于IOObp過短的序列和大于2000bp過長的序列，運(yùn)行命令為:C:\perl\bin>perlest_trimmer, piA.fasta-amb=2, 50_tr5=T, 5, 50_tr3=A, 5, 50-cut=100, 2000o 輸出兩個(gè)文件 A.fasta.log 和 A.fasta.results (A 為文件代號)。從http://www.bioinformatics, org/cd-hit中下載CD_HIT軟件，利用其去除冗余序列:把A.fasta.results復(fù)制到cd_hit文件夾中并重命名為B.fasta,運(yùn)行cd_hit.exe, Perl環(huán)境下運(yùn)行命令為:C: \perl\bin\cd_hit>cd_hit.exe-ΙΒ.fasta-oC.fasta-cl.00-n5_M2000,輸出三個(gè)文件，其中C.fsata文件用于下一步處理(A、B和C均為文件代號)。從http://pgrc.lpk-gatersleben.de/misa/下載misa.pi程序以識別和定位序列中的SSR ;參數(shù)設(shè)置如下:單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重復(fù)次數(shù)至少為
10、6、5、3、3、3。將C.fsata文件拷貝至C盤perl\bin目錄下，Perl環(huán)境下運(yùn)行命令:C: \perl\bin>perlmisa.plC.fasta,運(yùn)行后產(chǎn)生 C.fasta.misa 和 C.fasta.statistics 兩個(gè)文件，其中C.fasta.misa用于后續(xù)引物設(shè)計(jì)。
[0067]三、SSR引物的設(shè)計(jì)
[0068]使用Perl環(huán)境下primer3模塊批量設(shè)計(jì)SSR引物:引物設(shè)計(jì)參數(shù)為Tm55_65°C，引物長度為18_22bp。運(yùn)行p3_out.pi, Perl環(huán)境下運(yùn)行命令為:C:\perl\bin>perlp3_in.plC.fasta.misa,產(chǎn)生了一個(gè)名為C.fasta.p3in的primer3的輸入文件；再復(fù)制C.fasta.p3in 文件至Ij C 盤 perl\bin\primer3\bin 根目錄下，運(yùn)行 primer3_core.exe實(shí)現(xiàn)批量的引物設(shè)計(jì)，Perl環(huán)境下運(yùn)行命令為:C: \perl\bin\primer3\bin>primer3_core.exe<C.fasta.p3in>C.fasta.p3out,產(chǎn)生一個(gè)名為 C.fasta.p3out 的文件；最后將C.fasta.p3out文件復(fù)制至C盤perl\bin目錄下，運(yùn)行p3_out.pi,其命令為:C: \perl\bin>perl p3_ out.pl C.fasta.p3out C.fasta.misa,運(yùn)行后得至丨J C.fasta.results 文件，此即為設(shè)計(jì)好的引物。[0069]實(shí)施例2綠豆高通量SSR位點(diǎn)的發(fā)掘
[0070]應(yīng)用上述方法使用綠豆葉片作為材料進(jìn)行高通量測序，利用Perl語言對綠豆轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行高通量SSR位點(diǎn)的發(fā)掘,得到83542條轉(zhuǎn)錄組序列和48693條unigenes (表I)。SSR密度分布出現(xiàn)頻率最高的是單堿基微衛(wèi)星，所占比例最高的是A/T，其次是四核苷酸(表2、圖5、圖6)。
[0071]表1拼接長度頻數(shù)分布情況
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)綠豆SSR引物的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫:提取綠豆葉片總RNA,分離出mRNA,反轉(zhuǎn)錄并合成雙鏈cDNA,純化cDNA，在cDNA末端添加腺嘌呤核苷并連接測序接頭，然后通過瓊脂糖凝膠電泳回收200-700bp片段，對回收片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即構(gòu)建得到轉(zhuǎn)錄組文庫； 2)對上述轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行測序，利用軟件Trinity將測序序列拼接成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄組，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene,并對Unigene序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析； 3)采用軟件MISA1.0對上述Unigene進(jìn)行SSR檢測； 4)采用軟件Primer3進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)，并鑒定SSR引物的多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述測序接頭為:
5' RNA Adapter:5/ -GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'
3' RNA Adapter:5/ -ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述軟件Trinity的版本為V2012-10-05 ;參數(shù)設(shè)置:min_kmer_cov為2，其它參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述生物信息學(xué)分析包括但不限于基因注釋、CDS預(yù)測和差異表達(dá)基因篩選。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因注釋包括基因表達(dá)量注釋和/或基因功能注釋。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述差異表達(dá)基因篩選包括GO功能顯著性富集分析和/或Pathway顯著性富集分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中用于鑒定SSR引物多態(tài)性的綠豆選自中國中綠I號、中綠5號；泰國VC2778A、TC1966 ;俄羅斯1810、1865 ;澳大利亞ACC814、ACC41中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)使用的參數(shù)為:引物長度 18-22bp，Tm55-65°C，產(chǎn)物大小 100_300bp。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述方法開發(fā)的綠豆SSR引物，其特征在于，所述SSR引物的序列如SEQ ID N0.1-64所示。
10.權(quán)利要求9所述綠豆SSR引物在綠豆分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103642912SQ201310629710
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】陳紅霖, 程須珍, 王素華, 王麗俠 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所