一種褐飛虱細胞的原代培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種褐飛虱細胞的原代培養(yǎng)方法，該方法首先獲取發(fā)育時間在3天到4天的褐飛虱胚胎，然后配制褐飛虱細胞培養(yǎng)基，采用機械法結合消化法分離褐飛虱胚胎的組織和細胞，最后進行褐飛虱胚胎細胞的原代培養(yǎng)；本發(fā)明是對半翅目昆蟲細胞培養(yǎng)的重要補充；褐飛虱為水稻重要害蟲，本發(fā)明有助于在離體條件下研究褐飛虱，為其防治途徑的研究和開發(fā)提供幫助。
【專利說明】一種褐飛虱細胞的原代培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及屬于昆蟲細胞培養(yǎng)【技術領域】，尤其涉及一種褐飛虱細胞的體外培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]隨著生命科學的迅猛發(fā)展，在生物工程【技術領域】中，細胞工程已愈來愈受到重視。從某種意義上說，基因工程是現(xiàn)代生物技術的核心，而細胞工程是現(xiàn)代生物技術的基礎和公用平臺。自從Grace在1962年首次建立天蠶蛾細胞系以來，昆蟲細胞培養(yǎng)技術得到了迅速發(fā)展，400多株昆蟲細胞系得以建立，這包括常用的黑腹果蠅
ter) S2 細胞系、粉紋夜蛾/?i)的 BT1-Tn-5B1_4 (High Five)細胞系和草地貪夜蛾(5?o￡/o/7i6?ra /r^§7>6?r￡/a)Sf21細胞系及其克隆株Sf9。昆蟲細胞系的建立，不但促進了昆蟲生物學方面的基礎研究，也大大促進了基于昆蟲細胞的應用性研究。其中，昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)(BEVS)是當今最具高效的真核表達系統(tǒng)，已廣泛應用于β_干擾素等外源基因的表達。但是，現(xiàn)在已建立起的昆蟲細胞系多來源于鱗翅目昆蟲，來源于半翅目昆蟲的細胞系為數(shù)不多，目前只有玻璃葉蝶(//OffiaTrOiZi1Sca coagulata)熱灰飛M人LaodeIphax有細胞系建成的報道,這極大地限制了半翅目昆蟲相關生物學的研究及其應用。
[0003]褐飛風(brownplanthopper, BPH, Nilaparvata lugens (Stil))屬于半翅目昆蟲，是亞洲稻區(qū)的主要害蟲之一。它主要通過吸食水稻韌皮部汁液、傳播水稻病毒兩種方式對水稻造成危害。褐飛虱的大面積暴發(fā)會引起水稻葉片干枯，分蘗枯萎，甚至形成“虱燒”。褐飛虱有很強的適應能力，能快速適應不利環(huán)境(如水稻抗性品種和殺蟲劑)，其致害性能快速變異，這可能與褐飛虱體內(nèi)存在大量的共生菌有關。雖然通過高溫或添加抗生素等方式可以獲得少菌的褐飛虱種群，但是由于這兩種方式對褐飛虱本身就有一定的副作用，因而在活體條件下難以研究褐飛虱和其共生菌的關系。而若有離體培養(yǎng)的褐飛虱細胞，則可以在離體條件下研究褐飛虱和其共生菌的互作，從而有助于闡明褐飛虱的致害性機制。另一方面，若有離體培養(yǎng)的褐飛虱細胞，也可以通過在細胞水平研究殺蟲劑對褐飛虱的作用機制，有助于當前殺蟲劑的改進和新殺蟲劑的發(fā)明。但目前，關于褐飛虱細胞的體外培養(yǎng)技術，還未見報道。因此，建立起一種褐飛虱細胞的離體培養(yǎng)方法，有助于褐飛虱防治工作的開展，并最終有利于糧食的安全生產(chǎn)，這具有重要的社會和經(jīng)濟效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種褐飛虱細胞的原代培養(yǎng)方法。
[0005]本發(fā)明目的是通過以下技術方案得以實現(xiàn)的。
[0006]一種褐飛虱細胞的原代培養(yǎng)方法，按以下步驟進行:
(O獲取發(fā)育時間在3天到4天的褐飛虱胚胎:褐飛虱雌成蟲和雄成蟲配對后放入裝有水稻(ASD7水稻)葉鞘的試管中，使它們在280C條件下(白天黑夜時間比為L: D=16h: 8h)產(chǎn)卵，在第二天的同一時間從葉鞘中剝出褐飛虱所產(chǎn)的卵，此卵定義為I天卵，依次獲得褐飛虱的3天卵和4天卵；在解剖鏡下，3天卵可看到明顯的黃斑，而4天卵可觀察到眼點；此3天卵或4天卵的發(fā)育時期處于反轉(zhuǎn)期前后，適合于后續(xù)的胚胎細胞培養(yǎng)。
[0007](2)褐飛虱細胞培養(yǎng)基的配制:本發(fā)明所述的褐飛虱細胞培養(yǎng)基的配制方法:分別稱取 Schneider，s insect medium (SIGMA, S9895) 12.25g, Medium 199 (Applichem,A1327,9010) 5.35g ；Medium CMRL 1066 (IX) (Gibco，11530-037) 25mL ;L_His.HCI.H2O(SIGMA, H5659) 2.36g ；L-His (SIGMA, H6034) 2.135g ;胎牛血清(Hyclone，SV30087.02)149mL-248mL ；CaCl2 (分析純)0.3g ；NaHCO3 (分析純)0.2g ;氨芐青霉素鈉(上海生工，A0339)62mg ;硫酸鏈霉素(上海生工，S0382) 62mg ;上述各成分混合，用超純水充分溶解后，用2MNaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-6.6，而后用超純水定容至1240 mL,經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾后置于4°C備用；過濾過程采用無菌操作，胎牛血清的體積終濃度為12%-20%。
[0008](3)機械法結合消化法分離褐飛虱胚胎的組織和細胞:取100粒褐飛虱3天卵或4天卵，用體積百分比為75%酒精表面消毒5-10分鐘，接著用無菌的IX PBS (磷酸鹽緩沖液，pH = 7.2)漂洗3遍，而后把卵轉(zhuǎn)移到小細胞培養(yǎng)皿(直徑35 mm)中，加入100 μ L的無菌IX PBS (pH = 7.2)，用無菌的彎尖眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎組織裸露到PBS中。用無菌的ImL槍頭把含有胚胎組織的PBS吸到1.5 mL的無菌離心管中，800-1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，去除上部PBS，獲得胚胎組織沉淀。用100 μ L質(zhì)量體積比0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液(含或不含EDTA)懸浮胚胎組織，37°C條件下消化1-5分鐘；往胰蛋白酶溶液加入一倍體積以上的步驟2配置的褐飛虱細胞培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，800-1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，去除上清液，獲得消化后的胚胎組織和細胞沉淀。整個過程采用無菌操作。
[0009](4)褐飛虱胚胎細胞的原代培養(yǎng):用褐飛虱細胞培養(yǎng)基1200 μ L懸浮上述褐飛虱胚胎組織和細胞沉淀，將其轉(zhuǎn)移到小細胞培養(yǎng)皿(直徑35mm)或6孔細胞培養(yǎng)板中，用Paraf ilm封口膜包好后放置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天，待組織和細胞貼壁后，更換新鮮褐飛虱細胞培養(yǎng)基，并視貼壁細胞生長情況，每隔5-8天更換一次褐飛虱細胞培養(yǎng)基。I個月后，即可以得到貼壁生長的褐飛虱細胞群。整個過程采用無菌操作。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:現(xiàn)有的昆蟲細胞培養(yǎng)多局限于鱗翅目昆蟲，而半翅目昆蟲細胞的培養(yǎng)只是其中的一小部分，本發(fā)明是對半翅目昆蟲細胞培養(yǎng)的重要補充。褐飛虱為水稻重要害蟲，本發(fā)明有助于在離體條件下研究褐飛虱，為其防治途徑的研究和開發(fā)提供幫助。
【具體實施方式】
[0011]以下結合實例對本發(fā)明作進一步的詳細說明: 實施例1:取100粒褐飛虱3天卵，用75%酒精表面消毒5分鐘，之后用無菌的IX PBS(pH = 7.2)漂洗3遍。表面消毒完畢后，把卵轉(zhuǎn)移到小細胞培養(yǎng)皿(直徑35 mm)中，加入100 μ L無菌IX PBS (pH = 7.2)，用無菌的彎尖眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎組織裸露到PBS中。用無菌的ImL槍頭把含有胚胎組織的PBS吸到1.5 mL的無菌離心管中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘后，去除上部PBS，獲得胚胎組織沉淀。用IOOyL質(zhì)量體積比
0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液(含0.02 % EDTA)懸浮胚胎組織，并在37度條件下消化2分鐘。消化后，往消化液中加入100 μ L的含有20%胎牛血清的褐飛虱細胞培養(yǎng)基終止消化，之后，以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘后，小心用200 μ L槍頭吸走上清液，獲得消化后的胚胎組織和細胞沉淀。用1200 μ L上述含有20%胎牛血清的褐飛虱細胞培養(yǎng)基懸浮胚胎組織和細胞沉淀，并轉(zhuǎn)移至小細胞培養(yǎng)皿(直徑35_)中。第2天，更換新鮮的褐飛虱細胞培養(yǎng)基。3天之后，在10倍物鏡下每個視野平均可以觀察到76個細胞團。每隔I周更換一次含有20%胎牛血清的褐飛虱細胞培養(yǎng)基。結果，I個月后，在10倍物鏡視野下可見大量的貼壁細胞，細胞團重疊現(xiàn)象較多。
[0012]實施例2:取100粒褐飛虱3天卵，用75%酒精表面消毒10分鐘，之后用無菌的IX PBS (pH = 7.2)漂洗3遍。表面消毒完畢后，把卵轉(zhuǎn)移到小細胞培養(yǎng)皿(直徑35 mm)中，加入100 μ L無菌IX PBS (pH = 7.2)，用彎尖的眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎組織裸露到PBS中。用無菌的ImL槍頭把含有胚胎組織的PBS吸到1.5 mL的無菌離心管中，以800轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10分鐘后，去除上部PBS，獲得胚胎組織沉淀。用100 μ L質(zhì)量體積比
0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液(不含EDTA)懸浮胚胎組織，并在37度條件下消化5分鐘。消化后，往消化液中加入100 μ L的含有12%胎牛血清的褐飛虱細胞培養(yǎng)基終止消化，之后，以800轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10分鐘后,小心用200 μ L槍頭吸走上清液,獲得消化后的胚胎組織和細胞沉淀。用1200 μ L上述含有12%胎牛血清的褐飛虱細胞培養(yǎng)基懸浮胚胎組織和細胞沉淀，并轉(zhuǎn)移至小細胞培養(yǎng)皿(直徑35mm)中。第2天，更換新鮮培養(yǎng)基。3天之后，在10倍物鏡下每個視野平均可以觀察到56個細胞團。每隔6天更換一次含有12%胎牛血清的褐飛虱細胞培養(yǎng)基。結果，I個月后，在10倍物鏡視野下也可見大量的貼壁細胞，但細胞團重疊的情況與實施例1相比少了約一半。
[0013]實施例3:取100粒褐飛虱產(chǎn)后4天卵，用75%酒精表面消毒10分鐘，之后用無菌的IX PBS (pH = 7.2)漂洗3遍。表面消毒完畢后，把卵轉(zhuǎn)移到小細胞培養(yǎng)皿(直徑35mm)中，加入100 μ L無菌IX PBS (pH = 7.2)，用無菌的彎尖眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎組織裸露到PBS中。用無菌的ImL槍頭把含有胚胎組織的PBS吸到1.5 mL的無菌離心管中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘后，去除上部PBS，獲得胚胎組織沉淀。用IOOyL質(zhì)量體積比0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液(不含EDTA)懸浮胚胎組織，并在37度條件下消化I分鐘。消化后，往消化液中加入100 μ L的含有20%胎牛血清的褐飛虱細胞培養(yǎng)基終止消化，之后，以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘后，小心用200 μ L槍頭吸走上清液，獲得消化后的胚胎組織和細胞沉淀。用1200 μ L上述`含有20%胎牛血清的褐飛虱細胞培養(yǎng)基懸浮胚胎組織和細胞沉淀，并轉(zhuǎn)移至小細胞培養(yǎng)皿(直徑35mm)中。第2天，更換新鮮培養(yǎng)基。3天之后，在10倍物鏡下每個視野平均可以觀察到34個細胞團，但細胞團相教實施例1和實施例2的細胞團要大。每隔8天更換一次含有20%胎牛血清的褐飛虱細胞培養(yǎng)基。結果，I個月后，在10倍物鏡視野下也可見大量的貼壁細胞，但細胞團之間的重疊情況較少。
[0014]上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種褐飛虱細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (O獲取發(fā)育時間在3天到4天的褐飛虱胚胎:褐飛虱雌成蟲和雄成蟲配對后放入裝有水稻葉鞘的試管中，使它們在28°C條件下產(chǎn)卵；在第二天的同一時間從葉鞘中剝出褐飛虱所產(chǎn)的卵，定義為I天卵；依次獲得褐飛虱的3天卵和4天卵；在解剖鏡下，3天卵可看到明顯的黃斑，而4天卵可觀察到眼點；此3天卵或4天卵的發(fā)育時期處于反轉(zhuǎn)期前后，適合于后續(xù)的胚胎細胞培養(yǎng)； (2)褐飛風細胞培養(yǎng)基的配制:分別稱取12.25g的Schneider’ s insect medium、.5.35g 的 Medium 199、25mL 的 Medium CMRL 1066 (IX ),2.36g 的 L-His.HCl.Η20、2.135g的 L-His、149mL-248mL 胎牛血清、0.30g 的 CaCl2、0.20g 的 NaHC03、62mg 的氨芐青霉素鈉、62mg的硫酸鏈霉素等成分；上述各成分混合,加入超純水至1000 mL使上述成分充分溶解，再用2M NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-6.6，而后用超純水定容至1240 mL，經(jīng)0.22μπι微孔濾膜過濾后置于4°C備用；過濾過程采用無菌操作； (3)機械法結合消化法分離褐飛虱胚胎的組織和細胞:取約100粒褐飛虱3天卵或4天卵，用體積百分比約為75%的酒精表面消毒5-10分鐘，接著用無菌的IX PBS漂洗3遍，而后把卵轉(zhuǎn)移到小細胞培養(yǎng)皿中，加入100 μ L的無菌IX PBS，用無菌的彎尖眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎組織裸露到PBS中；用無菌的ImL槍頭把含有胚胎組織的PBS吸到1.5 mL的無菌離心管中，800-1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，去除上部PBS，獲得胚胎組織沉淀；用.100 μ L質(zhì)量體積比0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液懸浮胚胎組織，37°C條件下消化1_5分鐘；往胰蛋白酶溶液加入一倍體積以上的步驟2配置的褐飛虱細胞培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，800-1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，去除上清液，獲得消化后的胚胎組織和細胞沉淀；整個過程采用無菌操作； (4)褐飛虱胚胎細胞的原代培養(yǎng):用褐飛虱細胞培養(yǎng)基1200μ L懸浮上述褐飛虱胚胎組織和細胞沉淀，將其轉(zhuǎn)移到小細胞培養(yǎng)皿或6孔細胞培養(yǎng)板中，用ParafiIm封口膜包好后放置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第2天，待組織和細胞貼壁后，更換新鮮褐飛虱細胞培養(yǎng)基，并視貼壁細胞生長情況，每隔5-8天更換一次褐飛虱細胞培養(yǎng)基；I個月后，即可以得到貼壁生長的褐飛虱細胞群；整個過程采用無菌操作。
【文檔編號】C12N5/07GK103667173SQ201310608825
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權日:2013年11月27日
【發(fā)明者】許益鵬, 俞曉平, 申屠旭萍, 郝培應 申請人:中國計量學院