一種四川省松茸的產(chǎn)地屬性dna指紋圖譜的建立方法
【專利摘要】一種四川省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，本發(fā)明包括如下步驟：1）樣品DNA提取：對(duì)四川各松茸產(chǎn)區(qū)的松茸樣品進(jìn)行DNA提??；2）按順序使用pL281/pS48引物、pDGSL313-1/pS48引物、pDGSL719-2/pS48引物對(duì)提取的松茸樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3）運(yùn)用QIAxcel全自動(dòng)DNA分析系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)；4）獲得四川松茸的產(chǎn)地特征屬性DNA指紋圖譜。本發(fā)明提供一種針對(duì)中國(guó)四川松茸主產(chǎn)區(qū)松茸的地屬性DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，以及由此方法得到的松茸的產(chǎn)地屬性的DNA指紋圖譜。從而能夠?yàn)闅埩舯O(jiān)控中的問(wèn)題松茸的四川原產(chǎn)地溯源提供理論參考依據(jù)。
【專利說(shuō)明】—種四川省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中國(guó)四川松茸主產(chǎn)區(qū)的松茸產(chǎn)地屬性的DNA指紋圖譜的建立方法，以及由該方法所得相應(yīng)的DNA指紋圖譜。
【背景技術(shù)】
[0002]松鸞隸屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、傘菌目(Agaricales)、口薦科(Tricholoma)、口薦屬(Tricholoma) [1]。全球已報(bào)道了 15 個(gè)種，我國(guó)已記載了 5個(gè)種一個(gè)變種，即松鸞(T.matsutake)、假松鸞(T.bakamatsukake)、青崗覃(T.quercicola)、粗壯口蘑(T.robustum)、黃褐口蘑(T.fulvoeastaneum)和臺(tái)灣松鸞變種(T.matsutake),松鸞是一種外生菌根真菌類，由菌絲體、子實(shí)體和孢子組成,本發(fā)明所指的松茸是T.matsutake這個(gè)品種，且指可食用的子實(shí)體部分，也就是人們?cè)谑袌?chǎng)上見到的松茸菌。
[0003]松茸是一種味道鮮美、口感上乘、氣味濃郁獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、具有食療效果的純天然食用菌。目前尚不能人工馴化栽培，基本上都野生菌，所以來(lái)自不同分布區(qū)域的松茸擁有產(chǎn)地屬性。本發(fā)明只針對(duì)新鮮松茸，松茸加工制品中，DNA可能發(fā)生斷裂和降解，且目前多數(shù)松茸加工品不具有產(chǎn)地屬性，沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)地溯源的需要。
[0004]日本是松茸的最大消費(fèi)國(guó)，也是最大的進(jìn)口國(guó)。我國(guó)松茸主要出口至日本，其中鮮松茸的出口量占日本進(jìn)口量的43%，具有巨大的海外貿(mào)易價(jià)值。
[0005]我國(guó)松茸的主產(chǎn)區(qū)是云南、四川、吉林和黑龍江，其中云南的產(chǎn)量最大，吉林和黑龍江第二，四川第三。
[0006]目前東北生產(chǎn)的鮮松鸞從吉林口岸出口，云南、四川和西藏鮮松鸞從云南出入境口岸出口，但有時(shí)東北產(chǎn)的松茸也會(huì)從云南口岸出口。因此做好松茸的資源保護(hù)以及針對(duì)性出口管理，對(duì)松茸出口產(chǎn)業(yè)事關(guān)重大。
[0007]中國(guó)四川地區(qū)的松茸的多分布在甘孜州和涼山州的海拔為3000-4000米的原始森林區(qū)。交通不便，氣候寒冷，人煙稀少，多是高山少數(shù)名族居住于附近。目前多是由當(dāng)?shù)馗呱截毨贁?shù)民族開始對(duì)其進(jìn)行采摘并賣給當(dāng)?shù)氐乃扇壮隹谑召?gòu)商，這已成為這些少數(shù)民族特別是藏族和彝族脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源。因此，松茸的順利出口關(guān)系到這些少數(shù)民族的經(jīng)濟(jì)收入，關(guān)系到此地民族的團(tuán)結(jié)和政治穩(wěn)定。
[0008]松茸雖然是純天然的野生食用菌，但是生長(zhǎng)地分散，采摘人員多半是居住于附近的當(dāng)?shù)鼐用瘛簦瑥牟蓴X到出口還要經(jīng)歷很多環(huán)節(jié)，面對(duì)出口國(guó)特別是日本苛刻的進(jìn)口食品貿(mào)易壁壘，檢驗(yàn)檢疫部門必須對(duì)松茸的采摘到出口的全過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量安全控制和溯源管理，盡可能保證松茸的順利出口。另外，日本也要求我國(guó)提供對(duì)日出口的松茸的官方原產(chǎn)地證明。
[0009]中國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局制定了《出口鮮松茸質(zhì)量安全控制要求》指出“在強(qiáng)化檢驗(yàn)把關(guān)中指出“指導(dǎo)出口企業(yè)避免從農(nóng)殘和重金屬污染嚴(yán)重的地區(qū)收購(gòu)原料，降低農(nóng)殘和重金屬含量超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)”。雖然檢驗(yàn)檢疫監(jiān)督管理部門按照溯源管理措施，要求企業(yè)對(duì)產(chǎn)地進(jìn)行編號(hào)管理，按照原料來(lái)源分產(chǎn)地加工、存儲(chǔ)堆放，在報(bào)檢時(shí)必須提供該批出口松茸原料溯源管理網(wǎng)絡(luò)圖，但實(shí)際情況是企業(yè)履行得并不嚴(yán)格，這給經(jīng)出口口岸檢驗(yàn)檢疫部門檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殘留監(jiān)控不合格的松茸的溯源造成困難，為了保護(hù)云南口岸出口的持續(xù)性，以及更有效、更有針對(duì)性對(duì)某個(gè)地區(qū)進(jìn)行松茸質(zhì)量的管理，管理監(jiān)管部門除了依靠企業(yè)誠(chéng)信備案登記外，還需要能識(shí)別松茸的產(chǎn)地屬性的技術(shù)手段，用于區(qū)別產(chǎn)地來(lái)自云南以及產(chǎn)地來(lái)自非云南的松茸貨品。
[0010]中國(guó)整個(gè)西南地區(qū)的松茸外觀相近，氣味相同，微有口感上的差異，且不同成熟期松茸子實(shí)體外觀會(huì)發(fā)生變化，受此影響，僅從感官判斷不易辨別產(chǎn)地。王明富等研究者就認(rèn)為中國(guó)西南地區(qū)的松茸和日 本的松茸即使地理跨度較大，但形態(tài)接近，菌絲體不拮抗，屬同一品系的松鸞。
[0011]以松茸含有的總蛋白以及多糖類進(jìn)行分析，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在松茸的不同成熟期表達(dá)量的不同，受此影響，由此得到的化學(xué)分析數(shù)據(jù)不能用于產(chǎn)地溯源。
[0012]相對(duì)于感官以及營(yíng)養(yǎng)成分的分析，遺傳物質(zhì)的特性不會(huì)隨著菌體生長(zhǎng)而發(fā)生顯著改變，相對(duì)于一個(gè)個(gè)體，遺傳物質(zhì)從幼到老基本都是穩(wěn)定的。
[0013]但沙濤等認(rèn)為滇產(chǎn)松茸的IGS1-RFLP與日產(chǎn)松茸的主要類型十分相似，認(rèn)為滇產(chǎn)的和日產(chǎn)的松茸可能是同源的。
[0014]直到Murata等(2008)創(chuàng)建了并運(yùn)用這兩套引物pDGSL313_l/pS48和pDGSL719-2/pS48,序列為:pS48:GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ;pDGSL313_l:CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT ;pDGSL719_2:TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT ;采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，對(duì)日本、北朝鮮、中國(guó)東北省區(qū)、中國(guó)西南省區(qū)、不丹的松茸進(jìn)行了地理原產(chǎn)地的追溯，開創(chuàng)了利用遺傳物質(zhì)進(jìn)行松茸原產(chǎn)地溯源的局面。其中對(duì)中國(guó)東北省的松茸進(jìn)行pDGSL719-2/pS48的PCR擴(kuò)增有PCR產(chǎn)物，而對(duì)中國(guó)西南省區(qū)的松茸進(jìn)行pDGSL719_2/PS48的PCR擴(kuò)增沒(méi)有PCR產(chǎn)物，這是區(qū)分中國(guó)西南省區(qū)和東北省區(qū)的松茸關(guān)鍵。
[0015]瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)電泳方法自身重復(fù)性不佳、分辨率低下、操作時(shí)間長(zhǎng)，操作人員易接觸可能致畸的基因染料，不適宜將來(lái)運(yùn)用于新鮮松茸的溯源檢測(cè)過(guò)程。全自動(dòng)DNA分析系統(tǒng)基于全自動(dòng)毛細(xì)管電泳的原理，是一種用樣量少，環(huán)境友好，操作快速，分辨率高，電泳條件固定的PCR產(chǎn)物分離系統(tǒng)，所得出的DNA指紋圖譜在數(shù)據(jù)的重復(fù)性和穩(wěn)定性、量化確定性、以及質(zhì)量的控制等方面都比瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)得出的DNA指紋圖譜更加可靠。
[0016]Murata 等(2006)設(shè)計(jì)的 pL281/pS48PCR 反應(yīng)系統(tǒng)，序列為 pL281:
[0017]CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG ；pS48:
[0018]GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ；利用一對(duì)引物就可以得到豐富的遺傳多態(tài)信息，當(dāng)時(shí)Murata等用于區(qū)分是否為T.matsutake類的松鸞并未用這套引物進(jìn)行松鸞原產(chǎn)地的追溯。
[0019]目前除本發(fā)明外無(wú)任何學(xué)者對(duì)中國(guó)四川松茸主產(chǎn)區(qū)的松茸建立過(guò)產(chǎn)地屬性的DNA指紋圖譜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明的目的是針對(duì)出口松茸的原產(chǎn)地溯源管理的現(xiàn)實(shí)需求，補(bǔ)填我國(guó)目前沒(méi)有對(duì)中國(guó)四川松茸原產(chǎn)地溯源的DNA技術(shù)的缺口，提供一種針對(duì)中國(guó)四川松茸主產(chǎn)區(qū)松茸的地屬性DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，以及由此方法得到的松茸的產(chǎn)地屬性的DNA指紋圖譜。從而能夠?yàn)闅埩舯O(jiān)控中的問(wèn)題松茸的四川原產(chǎn)地溯源提供理論參考依據(jù)。
[0021]本發(fā)明的中國(guó)四川松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立具體包括下列步驟:
[0022]一種四川省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、pDGSL313-l/pS48引物、pDGSL719_2/pS48引物的引物序列，引物序列分別為:pL281:
【權(quán)利要求】
1.一種四川省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，使用以下PL281/PS48引物、pDGSL313-l/pS48引物、pDGSL719_2/pS48引物的引物序列，引物序列分別為:pL281:

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四川省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，該方法的具體參數(shù)為， 1)樣品DNA提取:取每個(gè)地區(qū)的鮮松茸樣本菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性指套中捻碎；必須選擇使用非過(guò)柱離心的可破碎細(xì)胞壁的商業(yè)DNA提取試劑盒提取新鮮樣本的DNA ； 2)按順序使用pL281/pS48 引物、pDGSL313_l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物對(duì)提取的松茸樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，PCR的反應(yīng)體系和檢測(cè)條件:Premix TaqVersion2.0lO μ L，上游引物 0.5 μ M，下游引物 0.5 μ M，DNA25_50ng，補(bǔ) ddH20 至 20 μ L，混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火溫度 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pL281/pS48 引物體系 64°C，pDGSL313_l/pS48 引物體系 64°C，pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5 °C ； 3)運(yùn)用QIAxcel全自動(dòng)DNA分析系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè):pDGSL719_2/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA Screening kit卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313-l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾執(zhí)行分辨率適度的0M500程序進(jìn)行核酸分析； 4)獲得四川省松茸的產(chǎn)地特征屬性DNA指紋圖譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種四川省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，按照該步驟即得到四川省甘孜藏族自治州稻城縣日瓦鄉(xiāng)亞丁村地區(qū)的松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種四川省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，該方法在步驟3)后還包括如下步驟: a)單酶限制性酶切體系:10XQuickCut?Bufferl μ L, QuickCut? EcoR V0.1 μ L,DNA25-50ng,補(bǔ) ddH20 至 10 μ L，混合均勻后，37°C IOmin ； b)再次進(jìn)行pL281/pS48的PCR反應(yīng)體系:限制性酶切體系10μ L，Premix TaqVersion2.09.8 μ L，上游引物 0.5 μ M，下游引物 0.5 μ M ; 即得到四川省涼山彝族自治州西昌市磨盤鄉(xiāng)、四川省甘孜藏族自治州鄉(xiāng)城縣尼斯鄉(xiāng)、四川省甘孜藏族自治州得榮縣奔都鄉(xiāng)的松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種四川省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，該方法在步驟3)后還包括如下步驟: a)混合酶限制性酶切體系:10XQuickCut? Bufferl μ L, 10 X QuickCut? Bufferl μ L,QuickCut? EcoR V0.1 μ L, QuickCut? Sph 10.1 μ L, DNAl μ L,補(bǔ) ddH20 至 10 μ L，混合均勻后，37°C 1Omin ； b)再次進(jìn)行pL281/pS48的PCR反應(yīng)體系:限制性酶切體系10μ L，Premix TaqVersion2.09.8 μ L，上游引物 0.5 μ M，下游引物 0.5 μ M ; 即得到四川省涼山彝族族自治州木里藏族自治縣的松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103571965SQ201310594630
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】陳麗萍, 劉忠民, 陳蕓, 趙永昌, 陳立佼, 陳衛(wèi)民, 李樹紅, 岳亮亮, 李旻, 丁元明, 楊玲春, 滕平, 王裔耿, 李云飛, 殷紅, 陳宏仙, 顏慶, 傅士華 申請(qǐng)人:云南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心