利用秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法。該方法包括如下步驟：（1）利用氨氣爆破法預(yù)處理秸稈粉，得到預(yù)處理后的秸稈粉；（2）用纖維素酶、β-半乳糖苷酶和果膠酶酶解所述預(yù)處理后的秸稈粉，得到秸稈水解液；（3）向所述秸稈水解液中加入培養(yǎng)基，然后接入裂殖壺菌（Aurantiochytrium）進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得裂殖壺菌發(fā)酵液；（4）用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壺菌發(fā)酵液，得到提取液；所述提取液經(jīng)干燥即得二十二碳六烯酸。本發(fā)明制備的DHA產(chǎn)量穩(wěn)定，在不添加外源葡萄糖情況下，采用本發(fā)明獲得的菌體干重可達(dá)58～66g/L，油脂占細(xì)胞干重的40.8～53.3%，DHA占油脂干重的42.1～45.3%，DHA產(chǎn)量為10.3～15.4g/L。
【專利說明】利用秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,簡稱DHA)是人體必需的一種長鏈高度不飽和脂肪酸，具有顯著的抗心血管疾病、降血脂、降血壓、預(yù)防各種癌癥、促進(jìn)嬰幼兒智力發(fā)育，改善成年人的大腦機(jī)能和防止老年癡呆等重要生理功能，已被開發(fā)成各種藥品、保健品、高級化妝品、食品及飼料等，市場巨大。DHA的傳統(tǒng)資源是深海魚油，但是由于過度開發(fā)捕撈深海魚類，魚油資源難以滿足人們對DHA日益增長的需求。近年來，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)富含DHA的油脂成為熱點(diǎn)。海洋真菌一裂殖壺菌不僅像細(xì)菌一樣二分裂繁殖，生長速度快，而且其油脂含量高，提取簡單，極具有產(chǎn)業(yè)開發(fā)前途。國內(nèi)外許多機(jī)構(gòu)正在或已經(jīng)申請裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的相關(guān)專利:申請?zhí)枮?01010104774.0的專利公布了利用豆柏水解物生產(chǎn)裂殖壺菌菌體的工藝，其所使用的碳源為葡萄糖70~80g/L ；申請?zhí)枮?00910130628.2的專利公布了利用高密度培養(yǎng)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的工藝，所使用的培養(yǎng)基碳源為葡萄糖120~125g/L ;申請?zhí)枮?01010150460.4的專利公布了全合成培養(yǎng)基用于培養(yǎng)裂殖壺菌的方法，所使用的培養(yǎng)基碳源為葡萄糖60~150g/L ；申請?zhí)枮?01010237946.1的專利公布了以裂殖壺菌為生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)多烯不飽和脂肪酸的方法，其特征是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甘氨酸甜菜堿或海藻糖以提高油脂含量。上述申請并公開的專利，主要以裂殖壺菌利用葡萄糖或淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)DHA，而利用廉價(jià)碳源，如木質(zhì)纖維素水解物生產(chǎn)DHA的方法尚未見報(bào)道。
[0003]秸桿是農(nóng)村常見的木質(zhì)纖維素原料，目前我國農(nóng)村對秸桿的常見處理方式有焚燒、堆肥、還田、制作簡易材料等方式，利用率低且不利于工業(yè)化推廣。此外，秸桿資源的綜合利用方法還有直接發(fā)酵生產(chǎn)沼氣、發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇、乳酸等，但附加值較低，無法真正實(shí)現(xiàn)秸桿資源的高效綜合利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，本發(fā)明利用廉價(jià)的秸桿木質(zhì)纖維素為原料，經(jīng)水解得到水溶性碳水化合物，經(jīng)裂殖壺菌轉(zhuǎn)化獲取DHA，將顯著降低DHA的生產(chǎn)成本，形成節(jié)約耕地、可連續(xù)生產(chǎn)DHA的工藝，并且還有利于環(huán)境保護(hù)和社會經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展。
[0005]本發(fā)明所提供的一種利用秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，包括如下步驟:
[0006](I)利用氨氣爆破法預(yù)處理秸桿粉，得到預(yù)處理后的秸桿粉；
[0007](2)用纖維素酶、P -半乳糖苷酶和果膠酶酶解所述預(yù)處理后的秸桿粉，得到秸桿水解液；
[0008](3)向所述稻桿水解液中加入培養(yǎng)基,然后接入裂殖壺菌(Aurantiochytrium)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得裂殖壺菌發(fā)酵液；
[0009](4)用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壺菌發(fā)酵液，得到提取液；所述提取液經(jīng)干燥即得二十二碳六烯酸。
[0010]上述的方法中，步驟(1)中，所述秸桿粉由玉米秸桿、水稻秸桿、甘蔗秸桿、小麥秸桿、棉花秸桿和高粱秸桿中至少一種制成；
[0011 ] 所述秸桿粉的粒徑小于5mm ；
[0012]在制備所述秸桿粉之前，最好將秸桿進(jìn)行干燥，如可在鼓風(fēng)烘箱中于80°C下干燥約2天。
[0013]上述的方法中，步驟(1)中，所述氨氣爆破法包括如下步驟:
[0014]將所述秸桿粉調(diào)控至質(zhì)量含水量為40%~60%，具體可為40%、45%、50%、55%或60%,然后加入高壓反應(yīng)器中；然后利用氨氣在3.0~4.0MPa下處理所述秸桿粉，可采用夾套蒸汽加熱的方式進(jìn)行，具體可在3.0MPa, 3.5MPa或4.0MPa下進(jìn)行；
[0015]上述的方法中，步驟(1)中，所述處理的溫度可為80°C~100°C，具體可為80°C、90。。、95。?；?00°C，時(shí)間可為30~60分鐘，具體可為30分鐘、45分鐘或60分鐘；
[0016]所述預(yù)處理后的秸桿粉的質(zhì)量含水量可為60%~70%，具體可為60%、65%或70% ；
[0017]所述處理結(jié)束 后，即可打開放氣閥，讓高壓反應(yīng)器中的壓力聚降；將所述預(yù)處理后的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發(fā)，存于4°C保存，用于下一步的反應(yīng)。
[0018]上述的方法中，步驟(2)中，所述纖維素酶、半乳糖苷酶和果膠酶酶解的用量可為=IKg所述預(yù)處理后的秸桿粉需要加入125000~225000CMC U所述纖維素酶、32500~58500pNPG U所述β -半乳糖苷酶和1550~3100U所述果膠酶，如IKg所述預(yù)處理后的秸桿粉加入125000CMC U所述纖維素酶、32500pNPG U所述β -半乳糖苷酶和1550U所述果膠酶、175000CMC U所述纖維素酶、45500pNPG U所述β -半乳糖苷酶和2325U所述果膠酶、225000CMC U所述纖維素酶、58500pNPG U所述β -半乳糖苷酶和2325U所述果膠酶、150000CMC U所述纖維素酶、39000pNPG U所述β -半乳糖苷酶和1550U所述果膠酶或150000CMC U所述纖維素酶、39000pNPG U所述β -半乳糖苷酶和3100U所述果膠酶；具體可米用加入Accellerasel500和Multifect pectinase的方式進(jìn)行酶解；
[0019]酶活單位的定義:1CMC U纖維素酶活為在50°C、pH為4.8的條件下，I分鐘水解羧甲基纖維素生成Iymol葡萄糖等量物所需的酶量；IpNPG U β -半乳糖苷酶活為在50°C、pH為4.8的條件下，I分鐘水解對硝基酚-β -葡萄糖苷生成I μ mo I對硝基酚所需的酶量;1U果膠酶活為在50°C、pH為4.3的條件下，I分鐘分解果膠產(chǎn)生I μ mol葡萄糖等量物所需的酶量。
[0020]上述的方法中，所述酶解的條件如下:
[0021]在pH為4.0~5.5和溫度為50°C~55°C的條件下處理6~7天，具體可在pH為
4.0和溫度為50°C的條件下處理7天、pH為4.5和溫度為55°C的條件下處理6天、在pH為
5.0和溫度為50°C的條件下處理7天、在pH為5.0和溫度為55°C的條件下處理6天、在pH為5.5和溫度為55°C的條件下處理7天或在pH為5.0和溫度為50°C的條件下處理6天。
[0022]上述的方法中，步驟(3)中，每IOOmL所述培養(yǎng)基的組成如下:
[0023]1.0~2.0g蛋白胨；L O~2.0g酵母浸出粉；2.0~3.0g海水晶；0.04~0.06gKH2PO4 ；0.02 ~0.03g (NH4)2SO4 ；0.2 ~0.4g Na2SO4 ;和余量的水；[0024]每IOOmL所述培養(yǎng)基的組成具體可為下述任一種:
[0025]I) 1.0~1.8g蛋白胨；1.0~1.8g酵母浸出粉；2.0~2.5g海水晶；()? 04~0.06gKH2P04 ；0.02 ~0.03g (NH4)2SO4 ；0.2 ~0.4g Na2SO4 ;和余量的水；
[0026]2) 1.0g 蛋白胨；1.0g 酵母浸出粉；2.0g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.02g(NH4)2SO4 ；0.2g Na2SO4 ;和余量的水；
[0027]3) 1.5g 蛋白胨；1.5g 酵母浸出粉；2.0g 海水晶；0.06g KH2PO4 ；0.03g(NH4)2SO4 ；0.4g Na2SO4 ;和余量的水；
[0028]4) 2.0g 蛋白胨；2.0g 酵母浸出粉；3.0g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.03g(NH4)2SO4 ；0.3g Na2SO4 ;和余量的水；
[0029]5) 1.0g 蛋白胨；1.0g 酵母浸出粉；2.0g 海水晶；0.06g KH2PO4 ；0.03g(NH4)2SO4 ；
0.4g Na2SO4 ;和余量的水；
[0030]6) 1.8g 蛋白胨；1.8g 酵母浸出粉；2.5g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.03g(NH4)2SO4 ；
0.4g Na2SO4 ;和余量的水。
[0031]上述的方法中，步驟(3)中，所述裂殖壺菌(Aurantiochytrium)接入的初始濃度為每IOOmL所述培養(yǎng)基接入10~12mL所述裂殖壺菌菌種。
[0032]上述的方法 中，步驟(3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件如下:
[0033]在所述發(fā)酵培養(yǎng)開始至75~85小時(shí)內(nèi)，控制所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為27.5~28.5°C，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至85~95小時(shí)內(nèi)，控制所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為24.5~25.5°C ;繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，控制所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為19.5~20.50C ；
[0034]且在所述發(fā)酵培養(yǎng)開始至55~65小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加氨水以維持體系pH為5.8~
6.2，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至95~105小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加所述秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當(dāng)檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時(shí)，停止發(fā)酵，即獲得裂殖壺菌發(fā)酵液。
[0035]上述的方法中，步驟(4)中，所述乙醇與所述正已烷的體積比可為1:2~5，如1:
2.6。
[0036]上述的方法中，步驟(4)中，在用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壺菌發(fā)酵液之前，所述方法還包括如下步驟:
[0037]將所述裂殖壺菌發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，得到上清液；用生理鹽水洗滌所述上清液后再懸于鹽酸溶液中。
[0038]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0039](I)原料易購，價(jià)格低廉。
[0040]秸桿是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)物，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國年產(chǎn)量達(dá)億噸，目前尚未得到充分利用，部分地區(qū)還造成了環(huán)境污染。秸桿易于收集，加工粉碎和水解相對容易，水解液主要是纖維素和半纖維素降解的糖，可作為裂殖壺菌生產(chǎn)高附加值DHA的碳源。
[0041](2)本發(fā)明制備的DHA產(chǎn)量穩(wěn)定，在不添加外源葡萄糖情況下，采用本發(fā)明獲得的菌體干重可達(dá)58~66g/L，油脂占細(xì)胞干重的40.8~53.3%，DHA占油脂干重的42.1~45.3%, DHA 產(chǎn)量為 10.3 ~15.4g/L。
[0042](3)水解與發(fā)酵過程簡單易行，操作簡便，容易控制，適合工業(yè)化生產(chǎn)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0043]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0044]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045]下述實(shí)施例中所用到的裂殖壺菌(Aurantiochytrium limacinum SR21)購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，菌株號為MYA-1381。
[0046]實(shí)施例1、玉米秸桿水解液生產(chǎn)DHA
[0047]( I)氨氣爆破法預(yù)處理玉米秸桿
[0048]將玉米秸桿在80°C鼓風(fēng)烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(jī)(河南鴻運(yùn)機(jī)械制造廠)進(jìn)行研磨，用5_孔徑的網(wǎng)篩進(jìn)行過濾得到玉米秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調(diào)節(jié)含水量至40%，置于Im3高壓反應(yīng)器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達(dá)到3.0MPa后，通入裝有玉米秸桿粉的Im3高壓反應(yīng)器。用夾套蒸汽加熱至80°C，維持60min。接著打開放氣閥，讓高壓反應(yīng)器中的壓力聚降。將氨水預(yù)處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發(fā)，存于4°C備用。
[0049](2)酶法水解玉米秸桿
[0050]將步驟(1)氨水預(yù)處理過的玉米秸桿粉30kg (含水量約為60%)，用IM pH4.0的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)磷酸鹽終濃度 至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至50°C后，用10mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.0，再加入15g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC U/g ； β -半乳糖苷酶含量約為650pNPG U/g，則Ikg玉米秸桿粉需要加入125000CMC U纖維素酶和32500pNPG υβ-半乳糖苷酶)和3g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg玉米秸桿粉需要加入1550U果膠酶)，50°C處理7天。將水解液用管式離心機(jī)(上海天本管式離心機(jī)GQ145)進(jìn)行離心,貯存于4°C。2個(gè)月內(nèi)可使用。使用之前,用NaOH調(diào)pH至6.0。
[0051](3) DHA 發(fā)酵
[0052]在步驟(2)得到的玉米秸桿水解液中加入培養(yǎng)基，每IOOmL所述培養(yǎng)基的組成如下:
[0053]1.0g 蛋白胨；1.0g 酵母浸出粉；2.0g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.02g (NH4)2SO4 ；0.2gNa2SO4 ;和余量的水。
[0054]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養(yǎng)基接入IOmL裂殖壺菌液體菌種，培養(yǎng)約120小時(shí)。其中在發(fā)酵開始到80小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為28.0±0.50C ；80小時(shí)到90小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為25.0±0.50C ；90小時(shí)到發(fā)酵結(jié)束，控制培養(yǎng)溫度為20.0±0.5°C。同時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)開始至60小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加氨水以維持體系pH為6.0 ± 0.2，且在發(fā)酵培養(yǎng)開始至100小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當(dāng)檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時(shí)，停止發(fā)酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發(fā)酵液。
[0055](4) DHA 的提取
[0056]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發(fā)酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復(fù)2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發(fā)酵液體中細(xì)胞干重為62g/L。
[0057]取5mL裂殖壺菌發(fā)酵液于IOmL離心管中，8000r/min, 4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復(fù)三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，80°C水浴I小時(shí)左右,冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復(fù)3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細(xì)胞干重的41.5%。
[0058]稱取IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時(shí)，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件為:6890C_5975N氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫)，HP-1NN0WAX極性毛細(xì)管柱，0.25iimX250iimX30m ;載氣:氦氣；載氣流量:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比20:1 ;進(jìn)樣量I y L ;進(jìn)樣口溫度為280°C ;檢測器溫度為280°C;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至220°C，保持5min。240°C后運(yùn)行3min。
[0059]測得油脂中，十四烷酸含量為6.9%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為28.2%，二十碳五烯酸含量為15.2%，DHA含量為44.7%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
5.0%, DHA 產(chǎn)量為 11.5g/L。
[0060]實(shí)施例2、水稻稻桿水解液生產(chǎn)DHA[0061 ] (I)氨氣爆破法預(yù)處理水稻秸桿
[0062]將水稻秸桿在80°C鼓風(fēng)烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(jī)(河南鴻運(yùn)機(jī)械制造廠)進(jìn)行研磨，用5_孔徑的網(wǎng)篩進(jìn)行過濾得到水稻秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調(diào)節(jié)含水量至45%，置于Im3高壓反應(yīng)器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達(dá)到3.5MPa后，通入裝有水稻秸桿粉的Im3高壓反應(yīng)器。用夾套蒸汽加熱至90°C，維持45min。接著打開放氣閥，讓高壓反應(yīng)器中的壓力聚降。將氨水預(yù)處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發(fā)，存于4°C備用。
[0063]( 2 )酶法水解水稻秸桿
[0064]將步驟(1)氨水預(yù)處理過的玉米秸桿粉30kg (含水量約為60%)，用IM pH4.5的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)磷酸鹽終濃度至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至55°C后，用10mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，加入21g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC UH半乳糖苷酶含量約為650pNP⑶/g，則Ikg玉米秸桿粉需要加入175000CMC U纖維素酶和45500pNPG UP-半乳糖苷酶)和4.5g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg玉米秸桿粉需要加A 2325U果膠酶)，55°C處理6天。將水解液用管式離心機(jī)(上海天本管式離心機(jī)GQ145)進(jìn)行離心,貯存于4°C。2個(gè)月內(nèi)可使用。使用之前,用NaOH調(diào)pH至6.0。
[0065](3) DHA 發(fā)酵
[0066]在步驟(2)得到的水稻秸桿水解液中加入培養(yǎng)基，每IOOmL所述培養(yǎng)基的組成如下:
[0067]1.5g 蛋白胨；1.5g 酵母浸出粉；2.5g 海水晶；0.06g KH2PO4 ；0.03g (NH4)2SO4 ；0.4gNa2SO4 ;和余量的水。
[0068]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養(yǎng)基接入12mL裂殖壺菌液體菌種，培養(yǎng)約120小時(shí)。其中在發(fā)酵開始到75小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為28.0±0.50C ；75小時(shí)到85小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為25.0±0.50C ；85小時(shí)到發(fā)酵結(jié)束，控制培養(yǎng)溫度為20.0±0.5°C。在發(fā)酵培養(yǎng)開始至55小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加氨水以維持體系pH為6.0 ± 0.2,且在發(fā)酵培養(yǎng)開始至95小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當(dāng)檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時(shí)，停止發(fā)酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發(fā)酵液。[0069](4) DHA 的提取
[0070]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發(fā)酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復(fù)2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發(fā)酵液體中細(xì)胞干重為66g/L。
[0071]取5mL裂殖壺菌發(fā)酵液于IOmL離心管中，8000r/min, 4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復(fù)三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，70°C水浴I小時(shí)左右,冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復(fù)3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細(xì)胞干重的53.5%。
[0072]稱取IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時(shí)，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件為:6890C_5975N氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫)，HP-1NNOWAX極性毛細(xì)管柱，0.25 μ mX 250 μ mX 30m ;載氣:氦氣；載氣流量:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比20:1 ;進(jìn)樣量I μ L ;進(jìn)樣口溫度280°C ;檢測器溫度280°C;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至220°C，保持5min。240 °C 后運(yùn)行 3min。
[0073]測得油脂中，十四烷酸含量為6.7%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為28.5%，二十碳五烯酸含量為14.9%，DHA含量為43.7%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
6.2%, DHA 產(chǎn)量為 15.4g/L。
[0074]實(shí)施例3、甘蔗秸桿水解液生產(chǎn)DHA
[0075](I)氨氣爆破法預(yù) 處理甘蔗秸桿
[0076]將甘蔗秸桿在80°C鼓風(fēng)烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(jī)(河南鴻運(yùn)機(jī)械制造廠)進(jìn)行研磨，用5_孔徑的網(wǎng)篩進(jìn)行過濾得到甘蔗秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調(diào)節(jié)含水量至50%，置于Im3高壓反應(yīng)器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達(dá)到4.0MPa后，通入裝有甘蔗秸桿粉的Im3高壓反應(yīng)器。用夾套蒸汽加熱至95°C，維持30min。接著打開放氣閥，讓高壓反應(yīng)器中的壓力聚降。將氨水預(yù)處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發(fā)，存于4°C備用。
[0077](2)酶法水解甘蔗秸桿
[0078]將步驟(1)氨水預(yù)處理過的玉米秸桿粉30kg (含水量約為65%)，用IM pH5.0的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)磷酸鹽終濃度至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至50°C后，用10mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，加入27g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC U/g ； β -半乳糖苷酶含量約為650ρΝΡ⑶/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入225000CMC U纖維素酶和58500pNPG U β -半乳糖苷酶)和4.5g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入2325U果膠酶)，50°C處理7天。將水解液用管式離心機(jī)(上海天本管式離心機(jī)GQ145)進(jìn)行離心,貯存于4°C。2個(gè)月內(nèi)可使用。使用之前,用NaOH調(diào)pH至6.0。
[0079](3) DHA 發(fā)酵
[0080]在步驟(2)得到的甘蔗秸桿水解液中加入培養(yǎng)基，每IOOmL所述培養(yǎng)基的組成如下:
[0081]2.0g 蛋白胨;2.0g 酵母浸出粉；3.0g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.03g (NH4)2SO4 ；0.3gNa2SO4 ;和余量的水。[0082]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養(yǎng)基接入IlmL裂殖壺菌液體菌種，培養(yǎng)約120小時(shí)。其中在發(fā)酵開始到85小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為28.0 + 0.50C ；85小時(shí)到95小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為25.0±0.50C ；95小時(shí)到發(fā)酵結(jié)束，控制培養(yǎng)溫度為20.0±0.5°C。且在發(fā)酵培養(yǎng)開始至65小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加氨水以維持體系pH為6.0±0.2,且在發(fā)酵培養(yǎng)開始至105小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當(dāng)檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時(shí)，停止發(fā)酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發(fā)酵液。
[0083](4) DHA 的提取
[0084]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發(fā)酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復(fù)2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發(fā)酵液體中細(xì)胞干重為61g/L。
[0085]取5mL裂殖壺菌發(fā)酵液于IOmL離心管中，8000r/min, 4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復(fù)三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，75°C水浴I小時(shí)左右,冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復(fù)3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細(xì)胞干重的51.6%。
[0086]稱取IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時(shí)，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件為:6890C_5975N氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫)，HP-1NNOWAX極性毛細(xì)管柱，0.25iimX250iimX30m ;載氣:氦氣；載氣流量:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比20:1 ;進(jìn)樣量I y L ;進(jìn)樣口溫度280°C ;檢測器溫度280°C;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至220°C，保持5min。240 °C 后運(yùn)行 3min。
[0087]測得油脂中，十四烷酸含量為7.2%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為28.6%，二十碳五烯酸含量為15.1%，DHA 含量為45.3%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
3.8%, DHA 產(chǎn)量為 14.3g/L。
[0088]實(shí)施例4、小麥稻桿水解液生產(chǎn)DHA
[0089]( I)氨氣爆破法預(yù)處理小麥秸桿
[0090]將小麥秸桿在80°C鼓風(fēng)烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(jī)(河南鴻運(yùn)機(jī)械制造廠)進(jìn)行研磨，用5_孔徑的網(wǎng)篩進(jìn)行過濾得到小麥秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調(diào)節(jié)含水量至60%，置于Im3高壓反應(yīng)器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達(dá)到4.0MPa后，通入裝有小麥秸桿粉的Im3高壓反應(yīng)器。用夾套蒸汽加熱至100°C，維持30min。接著打開放氣閥，讓高壓反應(yīng)器中的壓力聚降。將氨水預(yù)處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發(fā)，存于4°C備用。
[0091](2)酶法水解小麥秸桿
[0092]將步驟(1)氨水預(yù)處理過的小麥秸桿粉30kg (含水量約為70%)，用IM pH5.0的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)磷酸鹽終濃度至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至55°C后，用10mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，加入15g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC UH半乳糖苷酶含量約為650pNP⑶/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入125000CMC U纖維素酶和32500pNPG -半乳糖苷酶)和3.0g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加A 1550U果膠酶)，55°C處理6天。將水解液用管式離心機(jī)(上海天本管式離心機(jī)GQ145)進(jìn)行離心,貯存于4°C。2個(gè)月內(nèi)可使用。使用之前,用NaOH調(diào)pH至6.0。
[0093](3) DHA 發(fā)酵
[0094]在步驟(2)得到的小麥秸桿水解液中加入培養(yǎng)基，每IOOmL所述培養(yǎng)基的組成如下:
[0095]1.0g 蛋白胨；1.0g 酵母浸出粉；2.0g 海水晶；0.06g KH2PO4 ；0.03g (NH4)2SO4 ；0.4gNa2SO4 ;和余量的水。
[0096]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養(yǎng)基接入12mL裂殖壺菌液體菌種，培養(yǎng)約120小時(shí)。其中在發(fā)酵開始到80小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為28.0±0.50C ；80小時(shí)到90小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為25.0±0.50C ；90小時(shí)到發(fā)酵結(jié)束，控制培養(yǎng)溫度為20.0±0.5°C。在發(fā)酵培養(yǎng)開始至60小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加氨水以維持體系pH為6.0±0.2,且在發(fā)酵培養(yǎng)開始至100小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當(dāng)檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L，停止發(fā)酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發(fā)酵液。
[0097](4) DHA 的提取
[0098]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發(fā)酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復(fù)2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發(fā)酵液體中細(xì)胞干重為65g/L。
[0099]取5mL裂殖壺菌發(fā)酵液于IOmL離心管中，8000r/min, 4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復(fù)三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，70~80°C水浴I小時(shí)左右，冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復(fù)3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細(xì)胞干重的50.7%。
[0100]稱取IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時(shí)，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件:6890C_5975N氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫)，HP-1NNOWAX極性毛細(xì)管柱，0.25 μ mX 250 μ mX 30m ;載氣:氦氣；載氣流量:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比20:1 ;進(jìn)樣量為I μ L ;進(jìn)樣口溫度為280°C ;檢測器溫度為280°C ;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至220°C，保持 5min。240°C后運(yùn)行 3min。
[0101]測得油脂中，十四烷酸含量為6.3%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為29.5%，二十碳五烯酸含量為14.8%，DHA含量為42.1%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
7.3%, DHA 產(chǎn)量為 13.9g/L。
[0102]實(shí)施例5、棉花秸桿水解液生產(chǎn)DHA
[0103](I)氨氣爆破法預(yù)處理棉花秸桿
[0104]將棉花秸桿在80°C鼓風(fēng)烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(jī)(河南鴻運(yùn)機(jī)械制造廠)進(jìn)行研磨，用5_孔徑的網(wǎng)篩進(jìn)行過濾得到棉花秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調(diào)節(jié)含水量至55%，置于Im3高壓反應(yīng)器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達(dá)到3.5MPa后，通入裝有棉花秸桿粉的Im3高壓反應(yīng)器。用夾套蒸汽加熱至100°C，維持30min。接著打開放氣閥，讓高壓反應(yīng)器中的壓力聚降。將氨水預(yù)處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發(fā)，存于4°C備用。
[0105](2)酶法水解棉花秸桿
[0106]將步驟(1)氨水預(yù)處理過的棉花秸桿粉30kg (含水量約為65%)，用IM pH5.5的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)磷酸鹽終濃度至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至55°C后，用10mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.5，加入18g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC UH半乳糖苷酶含量約為650pNP⑶/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入150000CMC U纖維素酶和39000pNPG -半乳糖苷酶)和3.0g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加A 1550U果膠酶)，55°C處理7天。將水解液用管式離心機(jī)(上海天本管式離心機(jī)GQ145)進(jìn)行離心,貯存于4°C。2個(gè)月內(nèi)可使用。使用之前,用NaOH調(diào)pH至6.0。
[0107](3) DHA 發(fā)酵
[0108]在步驟(2)得到的棉花秸桿水解液中加入培養(yǎng)基，每IOOmL所述培養(yǎng)基的組成如下:
[0109]1.Sg 蛋白胨；1.Sg 酵母浸出粉；2.5g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.03g (NH4)2SO4 ；0.4gNa2SO4 ;和余量的水。
[0110]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養(yǎng)基接入IOmL裂殖壺菌液體菌種，培養(yǎng)約120小時(shí)。其中在發(fā)酵開始到75小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為28.0±0.50C ；75小時(shí)到85小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為25.0±0.50C ；85小時(shí)到發(fā)酵結(jié)束，控制培養(yǎng)溫度為20.0±0.5°C。且在發(fā)酵培養(yǎng)開始至55小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加氨水以維持體系pH為6.0 ± 0.2,且在發(fā)酵培養(yǎng)開始至95小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當(dāng)檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時(shí)，停止發(fā)酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發(fā)酵液。
[0111](4) DHA 的提取
[0112]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發(fā)酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復(fù)2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發(fā)酵液體中細(xì)胞干重為58g/L。
[0113]取5mL裂殖壺菌發(fā)酵液于IOmL離心管中，8000r/min,4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復(fù)三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，80°C水浴I小時(shí)左右,冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復(fù)3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細(xì)胞干重的48.5%。
[0114]稱取IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時(shí)，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件為:6890C_5975N氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫)，HP-1NN0WAX極性毛細(xì)管柱，0.25iimX250iimX30m;載氣:氦氣；載氣流量:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比為20:1 ;進(jìn)樣量為Iu L ;進(jìn)樣口溫度為2800C ;檢測器溫度為280°C ;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至220°C，保持5min。240°C后運(yùn)行3min。
[0115]測得油脂中，十四烷酸含量為6.2%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為28.5%，二十碳五烯酸含量為13.8%，DHA含量為43.6%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
7.9%, DHA 產(chǎn)量為 12.3g/L。
[0116]實(shí)施例6、高粱秸桿水解液生產(chǎn)DHA
[0117](I)氨氣爆破法預(yù)處理高粱秸桿
[0118]將高粱秸桿在80°C鼓風(fēng)烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(jī)(河南鴻運(yùn)機(jī)械制造廠)進(jìn)行研磨，用5_孔徑的網(wǎng)篩進(jìn)行過濾得到高粱秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調(diào)節(jié)含水量至50%，置于Im3高壓反應(yīng)器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達(dá)到4.0MPa后，通入裝有高粱秸桿粉的Im3高壓反應(yīng)器。用夾套蒸汽加熱至95°C，維持45min。接著打開放氣閥，讓高壓反應(yīng)器中的壓力聚降。將氨水預(yù)處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發(fā)，存于4°C備用。
[0119](2)酶法水解高粱秸桿
[0120]將步驟(1)氨水預(yù)處理過的高粱秸桿粉30kg (含水量約為60%)，用IM pH5.0的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)磷酸鹽終濃度至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至50°C后，用10mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，加入18g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC U/g ； β -半乳糖苷酶含量約為650ρΝΡ⑶/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入150000CMC U纖維素酶和39000pNPG U β -半乳糖苷酶)和6.0g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入3100U果膠酶)，50°C處理6天。將水解液用管式離心機(jī)(上海天本管式離心機(jī)GQ145)進(jìn)行離心,貯存于4°C。2個(gè)月內(nèi)可使用。使用之前,用NaOH調(diào)pH至6.0。
[0121](3) DHA 發(fā)酵
[0122]在步驟(2)得到的高粱秸桿水解液中加入培養(yǎng)基，每IOOmL所述培養(yǎng)基的組成如下:
[0123]2.0g 蛋白胨;2.0g 酵母浸出粉；2.5g 海水晶；0.06g KH2PO4 ；0.03g (NH4)2SO4 ；0.4gNa2SO4 ;和余量的水。
[0124]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養(yǎng)基接入IOmL裂殖壺菌液體菌種，培養(yǎng)約120小時(shí)。其中在發(fā)酵開始到85小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為28.0 + 0.5°C ；85小時(shí)到95小時(shí)內(nèi)，控制培養(yǎng)溫度為25.0±0.50C ；95小時(shí)到發(fā)酵結(jié)束，控制培養(yǎng)溫度為20.0±0.5°C。且在發(fā)酵培養(yǎng)開始至65小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加氨水以維持體系pH在6.0 ± 0.2,且在發(fā)酵培養(yǎng)開始至105小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當(dāng)檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時(shí)，停止發(fā)酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發(fā)酵液。
[0125](4) DHA 的提取
[0126]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發(fā)酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復(fù)2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發(fā)酵液體中細(xì)胞干重為60g/L。
[0127]取5mL裂殖壺菌發(fā)酵液于IOmL離心管中，8000r/min, 4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復(fù)三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，70~80°C水浴I小時(shí)左右，冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復(fù)3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細(xì)胞干重的40.8%。
[0128]稱取 IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時(shí)，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件:6890C_5975N氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫)，HP-1NN0WAX極性毛細(xì)管柱，0.25 μ mX 250 μ mX 30m ;載氣:氦氣；載氣流量為:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比為20:1 ;進(jìn)樣量為I μ L ;進(jìn)樣口溫度280°C ；檢測器溫度為280°C;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至 220°C，保持 5min。240°C后運(yùn)行 3min。
[0129]測得油脂中，十四烷酸含量為7.2%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為29.5%，二十碳五烯酸含量為13.2%，DHA含量為42.1%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
·8.0%, DHA 產(chǎn)量為 10 .3g/L。
【權(quán)利要求】
1.一種利用秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，包括如下步驟: (1)利用氨氣爆破法預(yù)處理秸桿粉，得到預(yù)處理后的秸桿粉； (2)用纖維素酶、β-半乳糖苷酶和果膠酶酶解所述預(yù)處理后的秸桿粉，得到秸桿水解液； (3)向所述稻桿水解液中加入培養(yǎng)基,然后接入裂殖壺菌(Aurantiochytrium)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得裂殖壺菌發(fā)酵液； (4)用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壺菌發(fā)酵液，得到提取液；所述提取液經(jīng)干燥即得二十二碳六烯酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述秸桿粉由玉米秸桿、水稻秸桿、甘蔗秸桿、小麥秸桿、棉花秸桿和高粱秸桿中至少一種制成； 所述秸桿粉的粒徑小于5mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述氨氣爆破法包括如下步驟: 將所述秸桿粉調(diào)控至質(zhì)量含水量為40%~60%，然后加入高壓反應(yīng)器中；然后利用氨氣在3.0~4.0MPa下處理所述秸桿粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述處理的溫度為80°C~100°C，時(shí)間為30~60分鐘； 所述預(yù)處理后的稻桿粉的質(zhì)量含水量為60%~70%。`
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述纖維素酶、所述β-半乳糖苷酶和所述果膠酶的用量為=IKg所述預(yù)處理后的秸桿粉需要加入125000~225000CMC U所述纖維素酶、32500~58500pNPG U所述β -半乳糖苷酶和1550~3100U所述果膠酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述酶解的條件如下: 在pH為4.0~5.5和溫度為50°C~55°C的條件下處理6~7天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，每IOOmL所述培養(yǎng)基的組成如下: 1.0~2.0g蛋白胨;1.0~2.0g酵母浸出粉;2.0~3.0g海水晶;0.04~0.06g KH2PO4 ；0.02 ~0.03g (NH4)2SO4 ；0.2 ~0.4g Na2SO4 ;和余量的水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述裂殖壺菌(Aurantiochytrium)接入的初始濃度為每IOOmL培養(yǎng)基接入10~12mL所述裂殖壺菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件如下: 在所述發(fā)酵培養(yǎng)開始至75~85小時(shí)內(nèi)，控制所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為27.5~28.5°C,繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至85~95小時(shí)內(nèi)，控制所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為24.5~25.5°C ;繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，控制所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為19.5~20.50C ； 且在所述發(fā)酵培養(yǎng)開始至55~65小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加氨水以維持體系pH為5.8~6.2，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至95~105小時(shí)內(nèi)，通過補(bǔ)加所述秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當(dāng)檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時(shí)，停止發(fā)酵，即獲得裂殖壺菌發(fā)酵液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，在用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壺菌發(fā)酵液之前，所述方法還包括如下步驟: 將所述裂殖壺菌發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，得到上清液；用生理鹽水洗滌所述上清液后再懸于鹽酸溶液中。
【文檔編號】C12P7/64GK103614427SQ201310571413
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】黃建忠, 江賢章, 張明亮 申請人:福建師范大學(xué)