一種重組微生物谷氨酰胺轉氨酶基因及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌的重組微生物谷氨酰胺轉氨酶酶基因及其表達，屬于食品工業(yè)生物【技術領域】。將來自芽孢桿菌的谷氨酰胺轉氨酶基因克隆分離后，構建了含有該基因的乳酸乳球菌重組表達載體spNZ8048-Tgase，并在乳酸乳球菌N9800菌株中獲得了表達，將該重組乳酸乳球菌命名為L.lactis；表達產物經過分離純化后，得到純度為90%左右的重組谷氨酰胺轉氨酶，活性達到2.2U/mL，高于原始菌株2倍以上。本發(fā)明利用乳酸乳球菌生產谷氨酰胺轉氨酶，具有操作簡單，產酶活性較高，生產成本低，安全性好，表達的酶易于分離純化等優(yōu)點，為谷氨酰胺轉氨酶的生產提供一條切實可行的途徑。
【專利說明】一種重組微生物谷氨酰胺轉氨酶基因及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領域及蛋白質表達領域，尤其涉及谷氨酰胺轉胺酶酶原基因在乳酸菌表達系統(tǒng)中的可溶性表達，具體為一種重組芽孢桿菌的微生物谷氨酰胺轉氨酶的制備方法。
【背景技術】
[0002]畜產品加工業(yè)是聯(lián)結畜牧生產與人民生活需要的重要產業(yè)。一方面，隨畜牧業(yè)的快速發(fā)展，我國畜產品呈現(xiàn)出供需平衡并有剩余的特點，但畜產品加工率只有5%左右，遠低于發(fā)達國家的60%~70%，畜產品加工業(yè)的嚴重滯后，制約了畜牧業(yè)的快速、高效發(fā)展。另一方面，隨人們經濟收入的增加、生活水平的提高、膳食結構的優(yōu)化及生活節(jié)奏的加快，對工業(yè)化食品特別是肉類、乳類等畜產品加工制品(多樣化、方便化、營養(yǎng)化、安全化、個性化) 的需求量不斷增加。另外，畜產品加工業(yè)作為畜牧業(yè)面向消費市場的后續(xù)加工產業(yè)，為增加產品附加值、農民就業(yè)機會及農民收入提供了途徑。因此，大力發(fā)展畜產品加工業(yè)對保障畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展、人們生活質量的提高及帶動農業(yè)增效、農民致富具有重要意義。
[0003]為提高加工畜產品的風味、口感、質地及營養(yǎng)價值，添加多種食品增味劑是畜產品加工過程中必不可少的環(huán)節(jié)。目前，我國批準許可使用的食品增味劑主要有L -谷氨酸鈉、 5’ -鳥苷酸二鈉、5’ -肌苷酸二鈉、5’ -呈味核苷酸二鈉、琥珀酸二鈉和L-丙氨酸、甘氨酸以及植物水解蛋白、動物水解蛋白、酵母抽提物等化學增味劑。這些化學增味劑雖然能夠有效改善食品風味，但其中的不少增味劑是采用化學方法進行生產的，這往往會給產品品質帶來一些不好的影響，如利用酸水解法制取水解植物蛋白時，會產生1-氯丙二醇、1，3- 二氯丙醇等致癌物，這嚴重影響了食品安全和消費者身體健康。隨著生物技術等相關學科的飛速發(fā)展，利用生物技術如植物組織培養(yǎng)法、微生物發(fā)酵法、酶轉化法等方法生產增味劑是獲得天然風味物質的有效途徑，因而生物技術在增味劑的生產中將會得到越來越廣泛的應用。隨之而來的開發(fā)安全、經濟、高效的增味劑用于動物加工產品的問題是迫切需要解決的。
[0004]谷氨酰胺轉胺酶(transglutaminase簡稱TGase),又稱轉谷氨酰胺酶,能催化酰基反應，從而導致蛋白質分子內和分子間或蛋白質分子與氨基酸分子間發(fā)生共價交 聯(lián)，生成網絡狀的超大蛋白質分子，進而發(fā)生凝膠，以此改善食品的品質、口味，提高食品的強度和穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的化學增味劑相比，新型增味劑谷氨酰胺轉胺酶具有以下優(yōu)點:(1)提高蛋白質營養(yǎng)價值，生產出滿足人們需求的新型蛋白食品；(2)本身是一種蛋白質，可被人體內的酶降解和消化，具有安全性和營養(yǎng)性；(3)采用酶法修飾對食品進行處理，具有安全、 快速、專一性強、對食品營養(yǎng)無破壞，而且對食品的色、香、味以及口感不產生副作用；(4) 可以廣泛的用于面制品、乳制品、肉制品、水產品等各個領域，可替代有致癌作用的強筋劑溴酸鉀，可部分替代硝酸鹽、亞硝酸鹽等穩(wěn)定劑，延長保質期；(5)由食品級微生物產生，可以直接將發(fā)酵液添加到食品中或是提純后添加，應用較為方便。
[0005]1989年，Ando和Motoki等人首先報道了微生物發(fā)酵法生產谷氨酰胺轉胺酶的研究情況。1993年日本味之素公司和天野公司已成功利用微生物發(fā)酵生產該酶制劑，投入市場獲得了巨大的經濟效益，2000年日本谷氨酰胺轉胺酶相關的食品銷售額達2000億日元。肉類加工等行業(yè)方面，谷氨酰胺轉胺酶在國外應用較多，而國內相對應用較少，其加工以傳統(tǒng)方式為主，這不但影響產品的美觀，還影響到產品的質量。隨著我國經濟的迅速發(fā)展，人民生活水平的不斷提高，人們對新型食品有更高的要求，而作為安全、健康的新型、高效食品添加劑和酶制劑產品，谷氨酰胺轉胺酶可以在食品加工等多個領域發(fā)揮積極的作用，并產生巨大的經濟效益。
[0006] 現(xiàn)代分子生物學技術的迅速發(fā)展，為從微觀分子水平改造基因序列，生產出高效、安全、低成本的天然食品增味劑提供了可能，利用基因工程技術構建基因工程菌來生產TGase是新的研究領域。目前，編碼TGase的完整基因和TGase蛋白質氨基酸順序已經被克隆和測序，他們得到的TGase酶活水平很低，遠不能達到工業(yè)化的水平；微生物來源的谷氨酰胺轉氨酶，因其生產不受季節(jié)和原料限制，是谷氨酰胺轉氨酶家族中最有可能進行大規(guī)模生產應用的一種，盡管有多種微生物自然狀態(tài)下能產谷氨酰胺轉氨酶，但大多數的產酶量不高；而通過常規(guī)誘變育種技術進行育種，耗時費力，又很難篩選到產谷氨酰胺轉氨酶高產菌株，這就造成了實際生產成本較高，限制了該酶的大規(guī)模工業(yè)化生產。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明解決上述問題是運用分子生物學技術和基因工程技術，將微生物谷氨酰胺轉氨酶基因克隆至大腸桿菌，然后通過誘導基因高效率表達谷氨酰胺轉氨酶，從而提高該酶的產量和降低該酶的生產成本。具體的技術方案如下:
[0008]1.首先提供一種產谷氨酰胺轉氨酶細菌的分離和谷氨酰胺轉氨酶基因的克隆的方法:提取芽孢桿菌基因組DNA后，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出谷氨酰胺轉氨酶全長基因;
[0009]2.提供一種谷氨酰胺轉氨酶基因乳酸乳球菌表達載體構建的方法:主要是利用乳酸乳球菌表達載體spNZ8048進行谷氨酰胺轉氨酶基因的表達；
[0010]3.提供重組谷氨酰胺轉氨酶分離純化的方法，主要是利用乙醇沉淀和陽離子交換柱的方法獲得高純度的谷氨酰胺轉氨酶，進而進行谷氨酰胺轉氨酶在乳酸乳球菌中的表達。
[0011]上述技術方案的進一步設置如下:
[0012]所述的谷氨酰胺轉氨酶基因的獲取步驟為:(1)提取芽孢桿菌基因組DNA ;(2)谷氨酰胺轉氨酶基因的PCR擴增；(3) PCR產物的回收純化；(4)谷氨酰胺轉氨酶基因的T/A克?。?5)谷氨酰胺轉氨酶基因雙脫氧終止法雙向測序。
[0013]所述的微生物谷氨酰胺轉氨酶基因在乳酸乳球菌中表達的具體步驟為:(1)構建表達載體；(2)重組谷氨酰胺轉氨酶的分離純化，分離純化方法為:加入終濃度約為IOng/mL的nisin誘導表達2~3h后，收集發(fā)酵液于4°C冷凍離心，上清液采用乙醇沉淀法進行分離純化，得到的沉淀蛋白通過陽離子交換柱，利用buffer A (含O~lmol/L NaCl)進行梯度洗脫，再通過測定酶活性確認純化結果。
[0014]本發(fā)明所獲得的重組芽孢桿菌的谷氨酰胺轉氨酶原基因的長度是738bp，用DNAtools5.1分析，該基因編碼為246個氨基酸組成的成熟肽，理論分子量為28.5kDa，谷氨酰胺轉氨酶全長基因序列及編碼氨基酸序列如下:
[0015]
【權利要求】
1.一種重組微生物谷氨酰胺轉氨酶原基因，其特征在于，該基因長度是738bp，該基因編碼為246個氨基酸組成的成熟肽，理論分子量為28.5kDa，谷氨酰胺轉氨酶全長基因序列及編碼氨基酸序列如下:
2.根據權利要求1所述一種重組微生物谷氨酰胺轉氨酶基因的制備方法，其特征是，包括以下步驟:A、產谷氨酰胺轉氨酶細菌的分離和谷氨酰胺轉氨酶基因的克?。籅、谷氨酰胺轉氨酶基因乳酸乳球菌表達載體構建；C、谷氨酰胺轉氨酶在乳酸乳球菌中的表達。
3.根據權利要求2所述的一種重組微生物谷氨酰胺轉氨酶基因的制備方法，其特征在于，所述的谷氨酰胺轉氨酶基因的獲取步驟為:(I)提取芽孢桿菌基因組DNA ; (2)谷氨酰胺轉氨酶基因的PCR擴增；(3) PCR產物的回收純化；(4)谷氨酰胺轉氨酶基因的T/A克?。?5)谷氨酰胺轉氨酶基因雙脫氧終止法雙向測序。
4.根據權利要求2或3所述的一種重組微生物谷氨酰胺轉氨酶基因的制備方法，其特征在于，所述的微生物谷氨酰胺轉氨酶基因在乳酸乳球菌中表達的具體步驟為:(I)構建表達載體；(2)重組谷氨酰胺轉氨酶的分離純化。
5.根據權利要求4所述的一種重組微生物谷氨酰胺轉氨酶基因的制備方法，其特征在于，所述的重組谷氨酰胺轉氨酶的分離純化方法為:加入終濃度約為10ng/mL的nisin誘導表達2~3h后，收集發(fā)酵液于4°C冷凍離心，上清液采用乙醇沉淀法進行分離純化，得到的沉淀蛋白通過陽離子交換柱，利用buffer A進行梯度洗脫，再通過測定酶活性確認純化結果。
6.根據權利要求5所述的一種重組微生物谷氨酰胺轉氨酶基因的制備方法，其特征在于:所述的 buffer A 含 0 ~lmol/L NaCl。`
【文檔編號】C12N15/74GK103555739SQ201310504755
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月23日 優(yōu)先權日:2013年10月23日
【發(fā)明者】胡春霞 申請人:紹興文理學院元培學院