高效合成萜類化合物的重組大腸桿菌底盤細胞及其制法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效合成萜類化合物的重組大腸桿菌底盤細胞及其制法和應(yīng)用。具體地，本發(fā)明對大腸桿菌內(nèi)源2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前體途徑進行改造，利用改造后的大腸桿菌底盤細胞進行萜類化合物的高效生物合成，前體途徑的改造主要是充分挖掘自然界中其他微生物來源的MEP前體途徑基因模塊，篩選特性優(yōu)良的基因模塊在大腸桿菌中進行表達，同時在改造后的底盤細胞中集成組裝萜類化合物的下游合成途徑，包括倍半萜類化合物如紫槐二烯，二萜類化合物如貝殼烯，四萜類化合物如番茄紅素，多萜類化合物及其他萜類生物堿化合物等。本發(fā)明的大腸桿菌底盤細胞能夠顯著提高萜類化合物的合成。
【專利說明】高效合成萜類化合物的重組大腸桿菌底盤細胞及其制法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于合成生物學(xué)及工業(yè)生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，本發(fā)明涉及一種高效合成萜類化合物的重組大腸桿菌底盤細胞及其制法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]合成生物學(xué)是基于理性的設(shè)計，將標準化的生物元件進行集成與裝配，從而構(gòu)建性能優(yōu)良的人造生命系統(tǒng)。合成生物學(xué)一經(jīng)誕生，它的思想和設(shè)計就深刻地影響著工業(yè)微生物技術(shù)的發(fā)展，使微生物技術(shù)在藥物，生物燃料，精細化學(xué)品的開發(fā)與生產(chǎn)過程中發(fā)揮出更加巨大的作用。
[0003]美國加州大學(xué)伯克利分校的Keasling實驗室，將黃花蒿來源的紫槐二烯合成酶基因(ads)，紫槐二烯氧化酶基因(cyp71avl)以及細胞色素P450還原蛋白基因(cpr)置于酵母細胞調(diào)控元件下，最終在酵母工程菌中組裝了一條青蒿酸的異源合成途徑并成功地合成了青蒿酸。隨后，麻省理工學(xué)院和塔夫茨大學(xué)的合作者在大腸桿菌中重建了紫杉醇前體-紫杉二烯的合成途徑，結(jié)合對工程菌株的一系列改造，最終使得紫杉二烯的產(chǎn)量超過了 lg/L。這些研究表明結(jié)合合成生物學(xué)的設(shè)計以及成熟的微生物基因工程技術(shù)，可以打破了種屬的界限，實現(xiàn)各種來源珍稀化合物在通用微生物底盤細胞中的高效合成。
[0004]萜類化合物是種類最多，結(jié)構(gòu)最豐富，功能最多樣的天然產(chǎn)物，是藥物，芳香物質(zhì)，食品添加劑，橡膠以及生物燃料的重要來源。目前已被發(fā)現(xiàn)的萜類化合物超過40，000種，它們廣泛地存在于植物中，同時真菌和細菌中也有越來越多的萜類化合物被報道。萜類化合物由通用的異戊酰焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)前體單元(C5)通過次序疊加合成。根據(jù)疊加的前體單元數(shù)量不同，分為半萜(C5)，單萜(ClO)，倍半萜(C15)，二萜(C20)，三萜(C20)，四萜(C40)，多萜類化合物及其他萜類生物堿化合物等。越來越多的萜類化合物被發(fā)現(xiàn)具有治療和防控多種疾病的功能，比如抗癌，抗微生物，抗真菌，抗寄生蟲，抗病毒，抗炎，免疫調(diào)節(jié)等。但這些化合物在原產(chǎn)植株或微生物中的合成往往受到嚴格的調(diào)控，含量低，且具有明顯的季節(jié)性，嚴重地制約了進一步的開發(fā)利用。以太平洋紅豆杉來源的紫杉醇為例，作為有效的抗藥藥物，該化合物非常微量地分布在太平洋紅豆杉的樹皮中，1200kg的樹皮只能提取IOg純的紫杉醇。
[0005]在傳統(tǒng)的模式微生物中，大腸桿菌是一種常用的異源合成底盤細胞。它具有清晰的遺傳背景、成熟的基因操作技術(shù)與工具、豐富的基因表達元件，可靠經(jīng)濟的大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)。大腸桿菌采用2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前體途徑合成IPP/DMAPP前體單元，但原始大腸桿菌細胞的MEP途徑只有極低的表達水平，僅能維持很低的前體供應(yīng)，無法滿足萜類化合物的高效合成。Yuan等人用染色體工程的方法，采用T5啟動子替換MEP途徑相關(guān)基因的原始啟動子，以逐個強化MEP途徑基因，并鑒定了途徑中的1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(dxs)，4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤蘚糖醇合成酶基因(ispD)，2-甲基赤蘚糖醇-2，4-環(huán)焦磷酸合成酶基因(ispF)，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因(idi)是限速步驟，共同強化這四個基因的表達，能夠有效改善番茄紅素的合成?；赮uan等研究結(jié)果，MIT的研究人員將大腸桿菌內(nèi)源dxs，ispD, ispF, idi基因串聯(lián)成一個操縱子，并結(jié)合啟動子工程，基因拷貝數(shù)調(diào)節(jié)等手段，最終獲得工程菌經(jīng)補料分批發(fā)酵后獲得了 >lg/L的紫杉二烯。這一系列對MEP途徑的改造，雖取得了很大的成功，但是獲得的底盤細胞仍無法滿足萜類化合物大規(guī)模生產(chǎn)的要求。而且針對大腸桿菌內(nèi)源MEP途徑調(diào)控機制及酶學(xué)特性仍缺乏足夠的了解，僅僅依賴某些限速步驟基因表達的強化無法徹底地解除途徑中可能存在的未知調(diào)控，因此也就無法完全打開MEP途徑的代謝通量并實現(xiàn)更高產(chǎn)萜類化合物底盤細胞的構(gòu)建。
[0006]因此，本領(lǐng)域目前還沒有一種有效的可靠的合成生物學(xué)與工業(yè)微生物技術(shù)，大規(guī)模生產(chǎn)萜類化合物。因此迫切需要構(gòu)建能夠異源合成萜類化合物的重組微生物工程菌，從而實現(xiàn)廉價，全天候，大規(guī)模生產(chǎn)萜類化合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的就是提供一種高效合成萜類化合物的重組大腸桿菌底盤細胞及其制法和應(yīng)用。
[0008]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種底盤細胞，所述的底盤細胞含有提高所述底盤細胞生產(chǎn)萜類化合物能力的基因。
[0009]在另一優(yōu)選例中，所述的底盤細胞是用于生產(chǎn)萜類化合物的底盤細胞，并且所述的基因是選自下述的至少一個基因或其組合:
[0010]來源于阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)的 dxs2、id1、dxr、或 ispD 基因；
[0011]來源于紅霉糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea)的 dxr、ispD、idil、或idi2基因；
`[0012]來源于歐文氏菌ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的 ispD 基因；
[0013]來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；
[0014]來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的idi基因。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的底盤細胞為真核細胞(如酵母細胞)或原核細胞(如枯草芽孢桿菌細胞、大腸桿菌細胞)；較佳地為大腸桿菌細胞。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的真核細胞為酵母細胞。
[0017]在另一優(yōu)選例中,所述的原核細胞為大腸桿菌(Escherichia coli)細胞。
[0018]在另一優(yōu)選例中,所述的底盤細胞為大腸桿菌(Escherichia coli)細胞。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的萜類化合物選自下組:半萜(C5)類化合物、單萜(ClO)類化合物、倍半萜(C15)類化合物、二萜(C20)類化合物、三萜(C20)類化合物、四萜(C40)類化合物、多萜類化合物、其他萜類生物堿化合物或其組合。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的基因選自下組:
[0021](I)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因；(2)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 idi 基因；(3)枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因；(4)上述(1)-(3)基因的任意組合。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的底盤細胞含有多拷貝的提高所述底盤細胞生產(chǎn)萜類化合物能力的基因。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的基因為:
[0024](I)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因和阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 idi 基因的組合；(2)阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的dxs2基因和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合；(3)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的idi基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合；⑷阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的dxs2基因的疊加。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的底盤細胞還包括任選自下組的基因或其組合:
[0026]來源于阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)的 dxr、或 ispD 基因；
[0027]來源于紅霉糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea)的 dxr、ispD、idil、或idi2基因；
[0028]來源于歐文氏菌的ispD基因；
[0029]來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；和/或
[0030]所述的底盤細胞還含有其它甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和/或非甲羥戊酸途徑(MEP途徑)中的酶。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述的基因為外源基因。
[0032]在另一優(yōu)選例`中，所述的萜類化合物選自下組:半萜(C5)類化合物、單萜(ClO)類化合物、倍半萜(C15)類化合物、二萜(C20)類化合物、三萜(C20)類化合物、四萜(C40)類化合物、多萜類化合物及其他萜類生物堿化合物或其組合。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的倍半萜(C15)類化合物為紫槐二烯。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的四萜(C40)類化合物為番茄紅素。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述的二萜(C20)類化合物為貝殼烯。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述的萜類化合物選自下組:紫槐二烯、番茄紅素、貝殼烯、或其組合。
[0037]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種生產(chǎn)萜類化合物的方法，所述方法包括步驟:
[0038](a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第一方面所述的底盤細胞，獲得含有萜類化合物的培養(yǎng)物；
[0039](b)從步驟(a)的培養(yǎng)物中分離出所述的萜類化合物；
[0040]其中，在步驟(a)中所述的底盤細胞含有或不含有外源的萜類化合物合成基因模塊。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的萜類化合物選自下組:紫槐二烯、番茄紅素、貝殼烯、或其組合。
[0042]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種基因的用途，所述基因選自下組:
[0043]來源于阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)的 dxs2、id1、dxr、或 ispD基因；來源于紅霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxr、ispD、idil、或 idi2 基因；來源于歐文氏菌ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的ispD基因；來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的 idi 基因；來源于枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)的idi基因；和/或上述基因的任意組合，所述的基因用于提高底盤細胞生產(chǎn)萜類化合物的能力。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述基因用于制備生產(chǎn)萜類化合物能力被提高的底盤細胞。
[0045]在另一優(yōu)選例中，所述的基因選自下組:(I)阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的 dxs2 基因；(2)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 idi基因;(3)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因；(4)上述(1)-(3)基因的任意組合；在另一優(yōu)選例中，所述的底盤細胞為真核細胞(如酵母細胞)或原核細胞(如大腸桿菌(Escherichia coli)細胞)。
[0046]在另一優(yōu)選例中，所述的底盤細胞為大腸桿菌(Escherichia coli)細胞。
[0047]在另一優(yōu)選例中，所述的基因任選自下組:
[0048](I)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因和阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 idi 基因的組合；
[0049](2)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合；
[0050](3)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的idi基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合；
[0051](4)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因的疊加。
[0052]在另一優(yōu)選例中，所述的基因還包括任選自下組的基因或其組合:
[0053]來源于大腸桿菌(Escherichiacoli)的 dxs、dxr、ispD、ispF、或 idi 基因；
[0054]來源于阿維鏈霉菌(Streptomyc`esavermitilis)的 dxsl、dxr、ispD、或 ispF 基因；
[0055]來源于紅霉糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea)的 dxs、dxr、ispD、ispF、idil、或 idi2 基因；
[0056]來源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的 dxs、dxr、ispD、或 ispF 基因；
[0057]來源于歐文氏菌的dxs、dxr、或ispD基因；
[0058]來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因。
[0059]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種分離的基因組合，所述的基因組合為:
[0060]阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因、阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 idi 基因、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的任意組合。
[0061]在另一優(yōu)選例中，所述的組合為2個或多個基因的組合。
[0062]在另一優(yōu)選例中，所述的基因組合任選自下組:
[0063](I)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因和阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 idi 基因的組合；
[0064](2)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合；
[0065](3)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的idi基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合；
[0066](4)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因的疊加；
[0067](5)阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的idi基因的疊加；[0068](6)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的疊加。
[0069]在另一優(yōu)選例中，所述的基因組合還包括任選自下組的基因或其組合:
[0070]來源于大腸桿菌(Escherichiacoli)的 dxs、dxr、ispD、ispF、或 idi 基因；
[0071]來源于阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)的 dxsl、dxr、ispD、或 ispF 基因；
[0072]來源于紅霉糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea)的 dxs、dxr、ispD、ispF、idil、或 idi2 基因；
[0073]來源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的 dxs、dxr、ispD、或 ispF 基因；
[0074]來源于歐文氏菌的dxs、dxr、或ispD基因；
[0075]來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因。
[0076]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種載體或載體混合物，所述的載體或載體混合物含有第四方面所述的基因組合。
[0077]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0078]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
[0079]圖1為MEP 前體途徑及下游萜類合成途徑示意圖。
[0080]圖2為MEP前體途徑不同種屬來源的dxs模炔基因的表達結(jié)果，泳道M:piOteinmarker ;泳道1:ControI ;泳道2:Escherichia coli dxs ;泳道3:Bacillus subtilis dxs ；泳道 4:Erwinia taxi ATCC55669dxs ;泳道 5:Streptomyces avermitilis dxsl ;泳道 6:Streptomyces avermitilis dxs2 ;泳道 7:Saccharopolyspora erythraea dxs。
[0081]圖3為MEP前體途徑不同種屬來源的dxr模炔基因的表達結(jié)果，泳道M:piOteinmarker ;泳道1:ControI ;泳道2:Escherichia coli dxr ;泳道3:Bacillus subtilis dxr ；泳道4:Erwinia taxi ATCC55669strain dxs ;泳道5:Streptomyces avermitilis dxr ;泳道 6 -Saccharopolyspora erythraea dxr。
[0082]圖4為MEP前體途徑不同種屬來源的ispD模炔基因的表達結(jié)果，泳道M:proteinmarker;泳道 I: Contro I ;泳道 2:Escherichia coli ispD ;泳道 3:Bacillus subtilisispD ;泳道 4:Erwinia taxi ATCC55669strain ispD ;泳道 5:Streptomyces avermitilisispD ;泳道 6-Saccharopolyspora erythraea ispD。
[0083]圖5為MEP前體途徑不同種屬來源的ispF模炔基因的表達結(jié)果，泳道M:piOteinmarker;泳道 I: Contro I ;泳道 2:Escherichia coli ispF ;泳道 3:Bacillus subtilisispF ;泳道 4:Streptomyces avermitilis ispF ;泳道 6:Saccharopolyspora erythraeaispF。
[0084]圖6為MEP前體途徑不同種屬來源的idi模炔基因的表達結(jié)果；泳道M:piOteinmarker ;泳道1:ControI ;泳道2:Escherichia coli idi ;泳道3:Bacillus subtilis idi ；泳道4:Streptomyces avermitilis idi ;泳道5:Saccharopolyspora erythraea idil ;泳道 6:Saccharopolyspora erythraea idi2 ;泳道 7:Staphylococcus aureus idi。
[0085]圖7為不同dxs基因模塊對番茄紅素合成的影響。
[0086]圖8為不同dxr基因模塊對番茄紅素合成的影響。
[0087]圖9為不同ispD基因模塊對番爺紅素合成的影響。
[0088]圖10為不同ispF基因模塊對番爺紅素合成的影響。
[0089]圖11為不同idi基因模塊對番爺紅素合成的影響。
[0090]圖12為不同基因模塊共表達對番茄紅素合成的影響。
[0091]圖13為不同重要基因模塊對紫槐二烯合成的影響。
[0092]圖14為不同重要基因模塊共表達對紫槐二烯合成的影響。
[0093]圖15為不同重要模炔基因?qū)ω悮は┖铣傻挠绊憽?br> 【具體實施方式】
[0094]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次對大腸桿菌內(nèi)源2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前體途徑進行改造，利用改造后的大腸桿菌底盤細胞進行萜類化合物的高效生物合成；前體途徑的改造主要是充分挖掘自然界中其他微生物來源的MEP前體途徑基因模塊，篩選特性優(yōu)良的基因模塊在大腸桿菌中進行表達，同時在改造后的底盤細胞中集成組裝萜類化合物的下游合成途徑，包括倍半萜類化合物紫槐二烯，二萜類化合物貝殼烯，四萜類化合物番茄紅素。本發(fā)明的大腸桿菌底盤細胞能夠顯著提高萜類化合物的合成。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0095]本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0096]一種挖掘自然界MEP前體途徑基因模塊的，篩選性能優(yōu)良的基因模塊，進而將這些模塊運用于大腸桿菌MEP途徑改造的方法，包括選取了阿維鏈霉菌(dxsl，dxs2, ispD,ispF, idi)，紅霉糖多孢菌(dxs, ispD, ispF, idil, idi2)，歐文氏菌(dxs, dxr, ispD)，枯草芽孢桿菌(dxs，ispD, ispF, idi)以及金黃色葡萄球菌(idi)等基因，同時選取大腸桿菌(dxs, ispD, ispF, idi)基因作為對照。通過克隆以上基因，然后將相關(guān)質(zhì)粒與含有番茄紅素合成途徑的PAC-LYC質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞，篩選出能夠明顯改善番茄紅素產(chǎn)量的基因，然后選取能夠明顯改善番茄紅素基因，用于倍半萜前體紫槐二烯、二萜前體貝殼烯的異源合成，同時將效果特別明顯的基因進行共強化進一步提高這些萜類化合物的合成。
[0097]MEP途徑和MVA途徑
[0098]如本文所用，術(shù)語“MEP途徑”是指2-C-甲基-D-赤藻糖醇_4_磷酸途徑，術(shù)語“MVA途徑”是指甲羥戊酸途徑。MEP途徑和MVA途徑是自然中的兩條萜類化合物通用前體的合成途徑，其中MEP途徑主要存在于各種真細菌，藍藻及植物質(zhì)體中，真核細菌尤其是鏈霉菌具有比較豐富的萜類次級代謝。相對于本身不產(chǎn)萜類化合物的大腸桿菌來說，這些萜類代謝豐富微生物其MEP途徑在表達調(diào)控，酶活特性上表現(xiàn)出一定的特性。同時豐富的天然基因資源也為大腸桿菌中MEP途徑的改造提供了豐富的元件庫。因此有效的挖掘這些資源，并用于大腸桿菌MEP途徑的改造，是構(gòu)建萜類高產(chǎn)底盤細胞的有效途徑(圖1)。
[0099]底盤細胞
[0100]本發(fā)明提供 了一種用于萜類化合物的合成的底盤細胞及其應(yīng)用，
[0101]如本文所用，術(shù)語“底盤細胞” “宿主細胞” “工程細胞”可以互換使用，指合成生物學(xué)中一種可搭配不同的功能模塊從而生產(chǎn)所需產(chǎn)品或?qū)崿F(xiàn)所需功能的宿主細胞。這種細胞可以是天然來源的生物細胞，也可以是在天然來源的生物細胞基礎(chǔ)上經(jīng)過了一定改良操作得到的細胞，如基因元件的增減和優(yōu)化。
[0102]在本發(fā)明中，所述底盤細胞含有提高所述底盤細胞生產(chǎn)萜類化合物能力的基因。
[0103]所述的底盤細胞為真核細胞或原核細胞；真核細胞可以為如酵母細胞；原核細胞可以為大腸桿菌(Escherichia coli)細胞。
[0104]在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，底盤細胞為大腸桿菌(Escherichia coli)。
[0105]在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的基因選自下組:阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的 dxs2 基因;阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 idi 基因；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因；上述基因的任意組合。
[0106]在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，底盤細胞含有多拷貝的提高所述底盤細胞生產(chǎn)萜類化合物能力的基因。
[0107]優(yōu)選地，所述的基因為:阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因和阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的idi基因的組合；阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 dxs2 基因和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合；阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的idi基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合；阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的dxs2基因的疊加。
[0108]更優(yōu)選地，底盤細胞還包括任選自下組的基因或其組合:來源于阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxr、或ispD基因；來源于紅霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxr、ispD、idil、或 idi2 基因；來源于歐文氏菌(Erwinia taxi ATCC55669)的 ispD` 基因；來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的 idi 基因。
[0109]更優(yōu)選地，所述的底盤細胞還含有其它甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和/或非甲羥戊酸途徑(MEP途徑)中的酶。
[0110]在本發(fā)明中，所述的萜類化合物優(yōu)選地選自下組:半萜(C5)類化合物、單萜(ClO)類化合物、倍半萜(C15)類化合物、二萜(C20)類化合物、三萜(C30)類化合物、四萜(C40)類化合物、或多萜類化合物及其他萜類生物堿化合物。
[0111]優(yōu)選地，單萜類化合物為異戊二烯、檸檬烯、薄荷醇等；倍半萜(C15)類化合物為紫槐二烯；四萜(C40)類化合物為番茄紅素；二萜(C20)類化合物為貝殼烯(甜菊糖前體)、紫杉二烯(紫杉醇前體)、海松二烯等；四萜(C40)類化合物為番茄紅素、β -胡蘿卜素、蝦青素等；多萜類化合物為杜仲膠等，以及萜類生物堿為喜樹堿等。
[0112]本發(fā)明優(yōu)選的萜類化合物選自下組:紫槐二烯、番茄紅素、貝殼烯、或其組合。
[0113]基因用途
[0114]本發(fā)明還提供了一種基因的用途，所述基因選自下組:阿維鏈霉菌(Sti^ptomycesavermitilis)來源的 dxs2 基因;阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 idi 基因；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因；上述基因的任意組合；所述的基因用于提高底盤細胞生產(chǎn)萜類化合物的能力。
[0115]在另一優(yōu)選例中，所述的基因任選自下組:阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的 dxs2 基因和阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 idi基因的組合；阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的 idi 基因的組合；阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的idi基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合；阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 dxs2 基因的疊加。
[0116]在另一優(yōu)選例中，所述的基因還包括任選自下組的基因或其組合:來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的dxs、dxr、ispD、ispF、或idi基因；來源于阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的 dxsl、dxr、ispD、或 ispF 基因；來源于紅霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxs、dxr、ispD、ispF、idil、或 idi2 基因；來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的dxs、dxr、ispD、或ispF基因；來源于歐文氏菌(Erwiniataxi ATCC55669)的dxs、dxr、或ispD基因；來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的 idi 基因。
[0117]基因組合
[0118]本發(fā)明還提供了一種分離的基因組合，所述的基因組合為:阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 dxs2 基因、阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的idi基因、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的任
意組合。
[0119]優(yōu)選地，所述的組合為2個或多個基因的組合。
[0120]較佳地，所述的基因組合任選自下組:阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因和阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的idi基因的組合；阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的dxs2基因和枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)來源的idi基因的組合；阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的idi基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合；阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 dxs2 基因的疊加；阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的idi基因的疊加；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的疊加。
[0121]如本文所用，術(shù)語“疊加”指將某一基因A與一種或多種其他基因進行組合(combine)，從而構(gòu)成一組合形式(combination)。較佳地，進行疊加的基因是與生產(chǎn)胳類化合物相關(guān)的基因，包括本發(fā)明中提及的任一基因。此外，該術(shù)語還包括基因A與基因A進行疊加的情況。
[0122]所述的基因組合還可以包括任選自下組的基因或其組合:來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的dxs、dxr、ispD、ispF、或idi基因；來源于阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的 dxsl、dxr、ispD、或 ispF 基因；來源于紅霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxs、dxr、ispD、ispF、idil、或 idi2 基因；來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的dxs、dxr、ispD、或ispF基因；來源于歐文氏菌ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的 dxs、dxr、或 ispD 基因；來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的 idi 基因。
[0123]本發(fā)明還提供了一種載體或載體混合物，所述的載體或載體混合物含有本發(fā)明所述的基因組合。[0124]根據(jù)本文所述的各種基因或基因組合，本【技術(shù)領(lǐng)域】人員可方便地用各種已知方法制得其編碼核酸。這些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》。
[0125]作為本發(fā)明的一種實施方式，可通過PCR的方法來構(gòu)建本發(fā)明的基因序列。
[0126]載體及宿主細胞
[0127]本發(fā)明還提供了一種載體或載體混合物，所述的載體或載體混合物含有本發(fā)明所述的基因組合，還優(yōu)選地包含與基因序列操作性相連的表達調(diào)控序列。
[0128]所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)宿主細胞來選擇合適的表達載體。根據(jù)已知空載表達載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過限制性酶剪切與拼接，將本發(fā)明的基因序列插入合適的限制性位點，制得重組表達載體。
[0129]本發(fā)明還提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有本發(fā)明上述的載體；或其染色體上整合有本發(fā)明所述的基因或基因組合。
[0130]本發(fā)明的宿主細胞可以原核細胞或真核細胞(例如但不限于CHO，COS細胞，293細胞，RSF細胞等)。本發(fā)明優(yōu)選原核細胞，更優(yōu)選大腸桿菌細胞。
[0131]將所述編碼序列導(dǎo)入宿主細胞可采用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)，例如但不限于:磷酸鈣沉淀，原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，反轉(zhuǎn)錄法，噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法，堿金屬離子法。
[0132]有關(guān)宿主細胞的培養(yǎng)和表達可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》。可通過離心去除懸浮液中的細胞和殘渣，收集清液，可通過凝膠電泳技術(shù)進行鑒定。
[0133]應(yīng)用
[0134]本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)萜類化合物的方法，所述方法包括步驟:
[0135](a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第一方面所述的底盤細胞，獲得含有萜類化合物的培養(yǎng)物；
[0136](b)從步驟(a)的培養(yǎng)物中分離出所述的萜類化合物；
[0137]其中，在步驟(a)中所述的底盤細胞含有或不含有外源的萜類化合物合成基因模塊。
[0138]所述的“萜類化合物合成基因模塊”指利用萜類前體(如異戊烯焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP))合成萜類化合物、衍生物所需要的基因、基因蔟、操縱子。
[0139]在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的萜類化合物選自下組:紫槐二烯、番茄紅素、貝殼烯、或其組合。
[0140]本發(fā)明的主要優(yōu)點:
[0141](I)本發(fā)明通過對自然界MEP途徑基因的大量挖掘，提供了大腸桿菌MEP途徑改造中具有重要價值的多種基因，這些基因為大腸桿菌MEP途徑的改造提供了豐富的資源；
[0142](2)本發(fā)明提供了基因能明顯改善萜類合成的能力，可以用于大腸桿菌的精細改造，比如結(jié)合啟動子工程，染色體工程等；
[0143](3)本發(fā)明提供的聞效轉(zhuǎn)化的大腸桿菌底盤細胞，能夠有效的表達番爺紅素、紫槐二烯以及貝殼烯的合成，從而用于萜類化合物的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。[0144]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0145]實施例1
[0146]不同菌株來源MEP途徑基因的克隆
[0147]表1
[0148]
【權(quán)利要求】
1.一種底盤細胞，其特征在于，所述的底盤細胞含有提高所述底盤細胞生產(chǎn)萜類化合物能力的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的底盤細胞，其特征在于，所述的底盤細胞是用于生產(chǎn)萜類化合物的底盤細胞，并且所述的基因是選自下述的至少一個基因或其組合: 來源于阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的 dxs2、id1、dxr、或 ispD 基因； 來源于紅霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxr、ispD、idil、或 idi2 基因； 來源于歐文氏菌 ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的 ispD 基因； 來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因； 來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的idi基因。
3.如權(quán)利要求1所述的底盤細胞，其特征在于，所述的底盤細胞為真核細胞(如酵母細胞)或原核細胞(如枯草芽孢桿菌細胞、大腸桿菌細胞)；較佳地為大腸桿菌細胞。
4.如權(quán)利要求1所述的底盤細胞，其特征在于，所述的萜類化合物選自下組:半萜(C5)類化合物、單萜(ClO)類化合物、倍半萜(C15)類化合物、二萜(C20)類化合物、三萜(C20)類化合物、四萜(C40)類化合物、多萜類化合物、其他萜類生物堿化合物或其組合。
5.如權(quán)利要求1所述的底盤細胞，其特征在于，所述的基因選自下組: (1)阿維鏈霉菌(Strep`tomycesavermitilis)來源的 dxs2 基因； (2)阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的 idi 基因； (3)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)來源的idi基因； (4)上述(1)-(3)基因的任意組合； 較佳地，所述的基因是選自下組的基因組合: (1)阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的dxs2基因和阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 idi 基因的組合； (2)阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的dxs2基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合； (3)阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的idi基因和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的組合； (4)阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的dxs2基因的疊加。
6.如權(quán)利要求1或5所述的底盤細胞，其特征在于，所述的底盤細胞還含有任選自下組的基因或其組合: 來源于阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxr、或ispD基因； 來源于紅霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxr、ispD、idil、或 idi2 基因； 來源于歐文氏菌 ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的 ispD 基因； 來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；和/或所述的底盤細胞還含有其它甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和/或非甲羥戊酸途徑(MEP途徑)中的酶。
7.—種生產(chǎn)萜類化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (a)在適合表達的條件下,培養(yǎng)權(quán)利要求1-6中任一所述的底盤細胞,獲得含有職類化合物的培養(yǎng)物； (b)從步驟(a)的培養(yǎng)物中分離出所述的萜類化合物； 其中，在步驟(a)中所述的底盤細胞含有或不含有外源的萜類化合物合成基因模塊。
8.一種基因的用途，其特征在于，所述基因選自下組: 來源于阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的 dxs2、id1、dxr、或 ispD 基因； 來源于紅霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxr、ispD、idil、或 idi2 基因； 來源于歐文氏菌 ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的 ispD 基因； 來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因； 來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的idi基因；和/或 上述基因的任意組合， 其特征在于，所述的基因用于提高底盤細胞生產(chǎn)萜類化合物的能力。
9.一種基因的用途，其特征在于，所述基因選自下組: (1)阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的 dxs2 基因； (2)阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的 idi 基因； (3)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)來源的idi基因; (4)上述(1)-(3)基因的任意組合； 所述的基因用于提高底盤細胞生產(chǎn)萜類化合物的能力。
10.一種分離的基因組合，其特征在于，所述的基因組合為:阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)來源的 dxs2 基因、阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來源的idi基因、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源的idi基因的任意組合。
11.一種載體或載體混合物，其特征在于，所述的載體或載體混合物含有權(quán)利要求10所述的基因組合。
【文檔編號】C12P5/00GK103773729SQ201310501221
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月22日
【發(fā)明者】王勇, 熊智強, 李詩淵, 汪建峰 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院