一種提高阿尼芬凈前體化合物Echinocandin B產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種提高阿尼芬凈前體化合物Echinocandin?B（ECB）產(chǎn)量的方法，所述方法為：配制用于培養(yǎng)構(gòu)巢曲霉（Aspergillus?nidulans）合成ECB的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入構(gòu)巢曲霉，在28～37℃下培養(yǎng)3天后，繼續(xù)在25℃下培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明方法與恒溫培養(yǎng)相比，采用前三天37℃培養(yǎng)，后9天25℃培養(yǎng)的策略使ECB產(chǎn)量由728mg/L提高至1237mg/L；除此之外，第6天添加2g/L脯氨酸可以使ECB的產(chǎn)量由540mg/L提高至850mg/L；在培養(yǎng)基中添加2g/L蘇氨酸或2g/L鳥氨酸可使ECB產(chǎn)量分別提高21.9%和55.2%。
【專利說明】一種提高阿尼芬凈前體化合物Echinocandin B產(chǎn)量的方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高阿尼芬凈前體化合物Echinocandin B產(chǎn)量的培養(yǎng)方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]近年來，器官移植手術(shù)導(dǎo)致免疫抑制劑的大量使用，化療和更具有侵襲性的醫(yī)療方法的應(yīng)用等多種原因造成免疫低下患者增多，真菌感染發(fā)病率顯著升高，尤其是深部真菌感染的發(fā)病率和病死率逐年增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 2004年的統(tǒng)計(jì)估計(jì)，全球每年的系統(tǒng)性真菌感染人數(shù)為33.5萬。其中最常見的是系統(tǒng)性念珠菌病，約占所有此類感染的70%左右，而其引起的死亡率又聞達(dá)40%左右。隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，20世紀(jì)90年代后，各種抗真菌藥物不斷問世，為治療各類真菌疾病帶來革命性的進(jìn)步。由于對抗真菌藥物的需求逐年攀升，使得其市場規(guī)模越加旺盛。
[0003]棘白菌素(Echinocandin)類抗生素是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一組天然產(chǎn)物，具有類似的環(huán)狀多肽核心和不同的脂肪酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)特征，能夠非競爭性地抑制真菌細(xì)胞壁β -1, 3-葡聚糖合成酶的活性,從而達(dá)到抗真菌的目的。其中阿尼芬凈(Anidulafungin)是繼卡泊芬凈(Caspofungin)、米卡芬凈(Micafungin)之后的第三代全身抗真菌類棘白菌素衍生物藥物，2006年2月21日，由輝瑞公司生產(chǎn)的阿尼芬凈通過了美國FDA認(rèn)證，主要治療念珠菌血癥和其他 形式的念珠菌感染(腹腔膿腫、腹膜炎)和食管念珠菌等。阿尼芬凈是由前體化合物Echinocandin B (ECB)經(jīng)猶他游動放線菌產(chǎn)生的?；缸饔妹撊?cè)鏈亞油?；缓笤贒MF中與活性中間體4〃-戊氧基-[1，1’，4’，1〃]三苯基-4-甲酸-2，4，5-三氯-苯基酯反應(yīng)制得。阿尼芬凈與ECB的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式1、2所示。
[0004]
【權(quán)利要求】
1.一種提高阿尼芬凈前體化合物Echinocandin B (ECB)產(chǎn)量的方法,所述方法為:配制用于培養(yǎng)構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)合成ECB的發(fā)酵培養(yǎng)基,接入構(gòu)巢曲霉,在28~37°C下培養(yǎng)3天后，繼續(xù)在25°C下培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)在第O~9天時(shí)添加前體氨基酸，所述前體氨基酸為下列之一或其中兩種以上的混合物:脯氨酸、鳥氨酸、蘇氨酸、亞油酸，添加量為2~8g/L發(fā)酵培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:花生油20g/L,甘油 10g/L，蛋白胨 10g/L，L-脯氨酸 2g/L，甘露醇 90g/L，豆粉 40g/L，K2HPO4.3H208g/L,MgSO4.7Η200.5g/L，MnSO4.H2O0.lg/L, FeSO4.7Η200.05g/L, CaCl20.3g/L，溶劑為水，pH7.0。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下: (1)構(gòu)巢曲霉接種至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25V，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)2天，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基組成如下:葡萄糖10g/L，甘油10g/L，棉籽粉25g/L，溶劑為水，ρΗ6.8 ~7.0，115°C滅菌 30min ； (2)種子液以10%體積比接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在28~37°C、搖床轉(zhuǎn)速220r/min條件下培養(yǎng)3天后，繼續(xù)在25°C、搖床轉(zhuǎn)速220r/min條件下培養(yǎng)直至總發(fā)酵時(shí)間為12天，并在發(fā)酵第6天時(shí)添加2g/L的脯氨酸，或者在發(fā)酵第O天添加2g/L的蘇氨酸或鳥氨酸；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:花生油20g/L，甘油10g/L，蛋白胨10g/L，L-脯氨酸2g/L，甘露醇 90g/L,豆粉 40g/L, K2HPO4.3H208g/L, MgSO4.7Η200.5g/L, MnSO4.H2O0.lg/L,FeSO4.7H200.05g/L, CaCl20.3g/L，溶劑為水，ρΗ7.0 ； (3)發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)分離`純化獲得所述阿尼芬凈前體化合物EchinocandinB。
【文檔編號】C12R1/66GK103509840SQ201310478251
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】鄭裕國, 牛坤, 鄒樹平, 毛健, 鐘偉, 沈寅初 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)