一株產(chǎn)雷公藤甲素的內(nèi)生細(xì)菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株產(chǎn)雷公藤甲素的內(nèi)生細(xì)菌，菌株號(hào)為L(zhǎng)Y-3，經(jīng)鑒定該菌株為菠蘿泛菌（Pantoeaananatis），其微生物保藏號(hào)是CGMCCNo.7371。應(yīng)用本發(fā)明雷公藤內(nèi)生細(xì)菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)雷公藤甲素，每升發(fā)酵液中可獲得甲素82.1mg，本發(fā)明菌株所得雷公藤甲素含量高，可作為工業(yè)發(fā)酵用菌株，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一株產(chǎn)雷公藤甲素的內(nèi)生細(xì)菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株具有雷公藤甲素合成功能的內(nèi)生細(xì)菌。
【背景技術(shù)】
[0002]早在100多年前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在健康植物組織的內(nèi)部也有微生物存在，但由于它們生活在沒有外在感染癥狀的健康植物組織內(nèi)部，其存在和作用長(zhǎng)期以來(lái)一直為人們所忽視。自20世紀(jì)30年代發(fā)現(xiàn)造成畜牧業(yè)重大損失的牲畜中毒是由于食用感染內(nèi)生菌的牧草后，內(nèi)生菌的研究才得以廣泛地開展起來(lái)。內(nèi)生菌(Endophyte) —詞由De Bary于1866年首先提出，直到1992年Klo印per第一次提出了植物內(nèi)生細(xì)菌的概念。相對(duì)其它學(xué)科來(lái)說(shuō)，植物內(nèi)生細(xì)菌的研究尚缺乏一定的系統(tǒng)性，但近年來(lái)，隨著研究領(lǐng)域的不斷拓寬和研究方法的不斷深入，植物內(nèi)生細(xì)菌所發(fā)揮的重要的生態(tài)和生理作用及其作為潛在生防資源和外源基因載體，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大應(yīng)用潛力，已逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。自1898年Vogl從黑麥草種子內(nèi)分離出第一株內(nèi)生細(xì)菌以來(lái)，植物內(nèi)生菌作為一種新的微生物資源受到了廣泛的關(guān)注，從內(nèi)生菌中尋找和發(fā)現(xiàn)新的活性化合物已成為國(guó)內(nèi)外研究的又一熱點(diǎn)。有研究表明，內(nèi)生細(xì)菌存在于所有植物種類當(dāng)中，藥用植物內(nèi)生細(xì)菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的藥用活性成分，特別是還發(fā)現(xiàn)許多新的活性成分，這些活性成分被證明具有明顯的抗癌、抗菌、抗氧化等活性。隨著對(duì)藥用植物資源研究的不斷深入，一些寄生于藥用植物體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)不但對(duì)宿主次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生具有明顯的促進(jìn)作用，而且自身也會(huì)代謝產(chǎn)生相同或類似的植物源藥用物質(zhì)。從藥用植物內(nèi)部篩選與開發(fā)具有藥用價(jià)值的內(nèi)生菌資源，尋找新的抗菌活性物質(zhì)，進(jìn)而為植物源藥物的生產(chǎn)開辟新途徑已成為該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)與熱點(diǎn)。藥用植物內(nèi)生細(xì)菌有望部分代替藥用植物作用，從而解決藥用植物資源短缺的問(wèn)題。因此，利用藥用植物內(nèi)生細(xì)菌開發(fā)新藥源具有極大的可能性。同時(shí)，內(nèi)生細(xì)菌易于發(fā)酵培養(yǎng)，便于組織工業(yè)化生產(chǎn)，利用內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵實(shí)現(xiàn)生物活性物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)，可以提高產(chǎn)量、降低產(chǎn)品成本，滿足市場(chǎng)的需求；另外，從內(nèi)生細(xì)菌中提取單體代替以前的從植物中提取單體，還可解決許多植物因作為藥用資源而被大量采伐引起的資源和生態(tài)危機(jī)，有利于珍稀瀕危藥用植物資源的保護(hù)。
[0003]雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，是我國(guó)重要的傳統(tǒng)藥用植物。然而，雷公藤藥用成分含量極低，加之野生資源蘊(yùn)藏量少，人工栽培又存在生長(zhǎng)緩慢，收獲期長(zhǎng)的問(wèn)題，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，已成為我國(guó)珍貴緊缺中藥材。所以對(duì)雷公藤內(nèi)生細(xì)菌的提取具有非常重要的意義，但是此方面的研究卻未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一株能產(chǎn)生雷公藤甲素的內(nèi)生細(xì)菌，可作為工業(yè)發(fā)酵用菌株，生產(chǎn)雷公藤甲素，其產(chǎn)量高，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
[0005]一株產(chǎn)雷公藤甲素的內(nèi)生細(xì)菌，其特征在于:該菌株為菠蘿泛菌a/7a/?aii5.),菌株號(hào)為L(zhǎng)Y_3,已于2013年3月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，其微生物保藏號(hào)是CGMCC N0.7371，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0006]形態(tài)鑒定:本發(fā)明的內(nèi)生細(xì)菌從雷公藤組織上分離、純化獲得，其在平面培養(yǎng)基上，正面黃色，背面黃褐色，單個(gè)圓形；周生鞭毛；菌落常表現(xiàn)為圓形、濕潤(rùn)、光滑、質(zhì)地均勻，如圖1所示。
[0007]序列測(cè)定:LY-3菌株由寶生物工程(大連)有限公司16s rDNA擴(kuò)增及序列測(cè)定，并通過(guò)在NCBI中比對(duì),鑒定為菠蘿泛菌ananatis、。
[0008]產(chǎn)物分析:LY-3菌株發(fā)酵產(chǎn)物中含有雷公藤甲素，生長(zhǎng)48h后，其產(chǎn)生的雷公藤甲素濃度為0.0821g/L。 [0009]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)或有益效果:本發(fā)明中的雷公藤內(nèi)生細(xì)菌LY-3具有合成雷公藤甲素的能力，且生長(zhǎng)迅速，生產(chǎn)成本低，易于工業(yè)擴(kuò)大化生產(chǎn)，同時(shí)可以保護(hù)野生植物資源，是生產(chǎn)雷公藤甲素的一種新方法。
[0010]
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1是LY-3菌株在平面培養(yǎng)基上的形態(tài) 圖2是LY-3菌株的雷公藤甲素生成情況
圖 3 是 LY-3 菌株 16 S rDNA 擴(kuò)增結(jié)果，圖中 M:DL 2000 DNA Marker, 1:LY_3 菌株 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，+:正對(duì)照，-:負(fù)對(duì)照。
[0012]
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下為本發(fā)明的具體實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不僅限于此。
[0014]實(shí)施例1:雷公藤菌株的分離純化
(I)雷公藤植物組織的準(zhǔn)備:該菌株主要從野外雷公藤植株的不同組織器官獲取，將植物分根、莖、葉進(jìn)行采集。
[0015](2)植物材料的表面消毒:葉片消毒采用70%酒精浸泡40s、0.1%升汞浸泡90s，莖消毒采用70%酒精浸泡30s、0.1 %升汞浸泡60s，根部消毒采用70%酒精浸泡50s、0.1%升萊浸泡120s ；
(3)雷公藤組織的表面無(wú)菌檢測(cè):將所采集的雷公藤組織經(jīng)表面消毒后，直接種植于固體培養(yǎng)基上，置恒溫箱培養(yǎng)，從中選出表面無(wú)任何菌種生長(zhǎng)的組織體。該過(guò)程使用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，配方為牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15-20g，無(wú)菌水1000ml，pH
7.0-7.2，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為36h ；
(4)采用組織塊法分離內(nèi)生細(xì)菌:將采集到的雷公藤組織(根、莖、葉)樣品分別用自來(lái)水沖洗晾干后，各稱取3g，70%酒精表面清洗后，再用0.1%升汞表面消毒1.5~
3.0min,無(wú)菌水沖洗3-4次后晾干。每樣品加IOml無(wú)菌水碾碎靜止15min后，各取50ul涂平板，每處理重復(fù)3次，27°C黑暗培養(yǎng)48~72h，計(jì)算菌落數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，按常規(guī)方法純化后保存，供測(cè)試鑒定。為了抑制放線菌生長(zhǎng)，在配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基時(shí)于滅菌前每升培養(yǎng)基中加入2ml氯霉素。待組織塊周圍長(zhǎng)出單菌落后，挑取形態(tài)不同的菌落移至新的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中進(jìn)行點(diǎn)純化。
[0016](5)點(diǎn)純化方法:將分離繁殖出的不同種類的內(nèi)生細(xì)菌接入平板培養(yǎng)基進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)2-3次點(diǎn)接純化、轉(zhuǎn)接后得到單一菌種菌株；采用的點(diǎn)接種純化技術(shù)將消毒后的接種環(huán)輕微點(diǎn)擊菌體表面，然后將其點(diǎn)擊接種面，該方法較傳統(tǒng)的點(diǎn)植培養(yǎng)法更易控制接種量，從而提高對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的接種效率與檢出率。
[0017](6)結(jié)果:從雷公藤植物組織器官中共分離得到雷公藤菌株40余株，經(jīng)菌落鑒定確定分屬于23個(gè)不同形態(tài)型的菌株(表1)。從表1可以看出，從雷公藤中分離得到的23株內(nèi)生細(xì)菌中，由根分離出6株，占總菌數(shù)的26.09% ;其次是由莖分離出的菌株為13株，占總菌數(shù)的56.52% ;由葉分離出4株，占總菌數(shù)的17.39%。
【權(quán)利要求】
1.一株產(chǎn)雷公藤甲素的內(nèi)生細(xì)菌，其特征在于:該菌株為菠蘿泛菌a/7a/?aii5.),菌株號(hào)為L(zhǎng)Y-3,已于2013年3月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，其微生物保藏號(hào)是CGMCC N0.7371?！?br> 【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103589660SQ201310477185
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】封磊, 李國(guó)慶, 洪偉, 吳承禎, 宋萍, 許進(jìn)嬌 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)