一種鴨甲肝病毒通用的lamp檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)，根據(jù)鴨甲肝病毒3D基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物（如SEQ?NO.1-4），建立鴨甲肝病毒的檢測試劑盒，包含以下成分：TRIZol；反應(yīng)液；SYBR?Green?Ⅰ；陽性對(duì)照；DEPC處理水。本發(fā)明試劑盒具有操作簡便、檢測快速、敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)儀器的要求低，非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室，甚至現(xiàn)場進(jìn)行快速診斷。
【專利說明】—種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒，專用于鴨甲肝病毒的診斷，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)引起的鴨病毒性肝炎是影響我國養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。該病毒主要感染3周齡內(nèi)的雛鴨，感染率高、發(fā)病快、死亡率高，若不及時(shí)治療，死亡率可達(dá)50%以上。該病波及面廣、發(fā)病率高、危害嚴(yán)重，每年都會(huì)給我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。鴨甲肝病毒分為A、B、C三個(gè)基因型，它們之間無抗原交叉性，目前在我國流行的主要是A型和C型。
[0003]對(duì)于鴨甲肝病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷，可以采取傳統(tǒng)的血清中和實(shí)驗(yàn)，但該方法存在耗時(shí)長、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)。也可以采取快速、靈敏、特異的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如RT-PCR、熒光定量PCR等，但這些方法需要PCR儀或者熒光定量PCR儀、電泳系統(tǒng)等較為復(fù)雜的儀器設(shè)備，大多數(shù)小型或個(gè)體的養(yǎng)殖場，缺乏此類硬件條件，使得這些方法的推廣與應(yīng)用受到限制。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是一種新的體外擴(kuò)增特異性基因的分子生物學(xué)方法。該方法只需要簡單的水浴鍋，在30-90min內(nèi)即可擴(kuò)增大量的目的基因，而且可以不需要核酸電泳的方法來判斷結(jié)果，僅通過在紫外線下肉眼觀察就能判斷結(jié)果。LAMP檢測技術(shù)具有操作簡便、檢測快速、高效實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室，甚至現(xiàn)場進(jìn)行快速診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是利用L AMP技術(shù)建立一種鑒別鴨甲肝病毒通用的檢測試劑盒，該試劑盒具有快速、準(zhǔn)確、敏感性高、特異性好、成本低等特點(diǎn)，完全能夠滿足基層現(xiàn)場快速檢測鴨甲肝病毒感染的需要。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒，其特征是，包括以下組分(50次量):
[0007]I)TRIZol:50ml ；
[0008]2)反應(yīng)液:2000 μ L，包括 IOXBst buffer250 μ L、dNTP(10mmol/L) 100 μ L、MgCl2(25mmol/L)300y L, betaine (5mol/L) 200 μ L、外引物 DHV-F3、DHV-B3 (10 μ mol/L)各50μ L、內(nèi)引物 DHV-FIP、DHV-BIP (40 μ mol/L)各 100 μ L、RNA 酶抑制劑(40U/μ L) 100 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶 AMV (5U/ μ L) 100 μ L、Bst DNA 聚合酶(8U/ μ L) 100 μ L、DEPC 處理水 550 μ L ；
[0009]3) SYBR Green I:100μ L ；
[0010]4)陽性對(duì)照:重組質(zhì)粒T-DH250 μ L，濃度為0.1ng/ μ L ；
[0011]5) DEPC 處理水:1ml。
[0012]上述試劑除SYBR Green I購自Invitrogen公司外，其余均購自大連寶生物(TAKARA)公司。[0013]所述檢測引物DHV-F3、DHV-B3、DHV-FIP, DHV-BIP 依次為:
[0014]DHV-F3:5’-ATCTGGYTGTGCTGTTGGRAT-3’ (SEQ N0.1)
[0015]DHV-B3:5’-CATARCAYTGRTTGATGTCATAKCC-3’ (SEQ N0.2)
[0016]DHV-FIP:5’-ACTCARAGABCCATCRAAWCCAGTTTTGAGTGGGAYAATYTGTTRGC-3’ (SEQN0.3)
[0017]DHV-BIP: 5' -CHCAYTATGTAACTGATGAGATHTGGTTTTACAGTRGTRCAKGGDGAT CCTGA-3’(SEQ N0.4)
[0018](R = A^G；Y = C^T；H = A, T^C ；D=G, A或T;W = A或T;B = G，T 或C;K =G或T)[0019]所述重組質(zhì)粒T-DH的詳細(xì)制備方法:
[0020]按照TRIZol試劑說明提取A型鴨甲肝病毒RNA，利用引物DHV-F3/DHV-B3進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增目的條帶，反應(yīng)條件如下:
[0021]RT 反應(yīng)體系(20μ L):10mmol/L dNTPl.0 μ L、5 X RT 緩沖液 4.0 μ L、20pmol/μ L 的引物 DHV-B31.0 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制劑 0.5 μ L、RNA 模板 I μ L、DEPC 水 11.5 μ L ;置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，5U/ μ L反轉(zhuǎn)錄酶AMVl μ L于70°C 5min后加入；反應(yīng)程序:70°C 5min，42°C 30min,95°C 2min。
[0022]PCR 反應(yīng)體系(50μ L):ddH2039y L、20pmol/y L 的引物 DHV-F31.0 μ L、10XPCR緩沖液4.5 μ L、5U/ μ L Taq DNA聚合酶0.5 μ L、RT產(chǎn)物5.0 μ L ;置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序:95°C 2min預(yù)變性；94°C變性15sec、60°C退火15sec、72°C延伸20sec，共30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 5min。
[0023]回收目的條帶，與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，PCR鑒定陽性后送上海博尚生物工程有限公司測序。序列正確的質(zhì)粒標(biāo)記為T-DH作為鴨甲肝病毒的陽性對(duì)照。
[0024]所述檢測試劑盒的操作步驟:
[0025]1)RNA提取:取200 μ L待檢鴨病料勻漿液，加入Iml TRIZol，充分震蕩，靜置IOmin后加入200 μ L氯仿,充分混勻,靜置5min后，12000rpm離心IOmin,取上清加入等體積的異丙醇，充分混勻后，放_(tái)20°C靜置Ih以上。然后12000rpm離心15min，棄掉上清，加入75%酒精500 μ L，12000rpm離心5min，棄掉上清，RNA沉淀干燥后加入10 μ L DEPC處理水，備用；
[0026]2) LAMP反應(yīng):取20 μ L反應(yīng)液，加入5 μ L待檢RNA，混勻后按下面的程序進(jìn)行反應(yīng):6(TC 90min,85°C 2min ；
[0027]3)陽性對(duì)照:取20 μ L反應(yīng)液，加入5μ L陽性對(duì)照物，混勻后按下面的程序進(jìn)行反應(yīng):60°C 90min，85°C 2min ；
[0028]4)結(jié)果判斷:可采取兩種方法判斷結(jié)果。
[0029]一是電泳觀察:取5 μ L PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察，若出現(xiàn)階梯狀條帶，可判斷為鴨甲肝病毒陽性；若未出現(xiàn)，則可判斷為鴨甲肝病毒陰性。
[0030]二是肉眼觀察:反應(yīng)結(jié)束后，取I μ L SYBR Green I加入產(chǎn)物中，混勻后在紫外線下觀察結(jié)果。若有白色熒光，可判斷為鴨甲肝病毒陽性；若無，則可判斷為鴨甲肝病毒陰性。
[0031]本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn):
[0032]1.本發(fā)明建立的LAMP檢測方法對(duì)鴨甲肝病毒RNA的最低檢出量為0.lpg，敏感性比RT-PCR方法提高10倍；
[0033]2.本發(fā)明建立的LAMP檢測技術(shù)具有操作簡便、檢測快速、高效實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)儀器的要求低，非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室，甚至現(xiàn)場進(jìn)行快速診斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是檢測試劑盒的特異性檢測結(jié)果。
[0035]圖1-1為電泳結(jié)果；圖1-2為SYBR Green I染色結(jié)果。其中M為DNA MarkerDL2000 ；1-7所對(duì)應(yīng)的病毒分別為A型鴨甲肝病毒、B型鴨甲肝病毒、C型鴨甲肝病毒、新型鴨呼腸孤病毒、番鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒。
[0036]圖2是A型鴨肝炎病毒敏感性檢測結(jié)果。
[0037]圖2-1為電泳結(jié)果'2-2為SYBR Green I染色結(jié)果；圖2-3為RT-PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果。其中M為DNA Marker DL2000 ;1_6所對(duì)應(yīng)的病毒RNA的含量分別為100pg、10pg、lpg、0.lpg、0.01pg、0.0Olpgo
[0038]圖3是B型鴨肝炎病毒敏感性檢測結(jié)果。
[0039]圖3-1為電泳結(jié)果；3_2為SYBR Green I染色結(jié)果；圖3-3為RT-PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果。其中M為DNA Marker DL2000 ;1_6所對(duì)應(yīng)的病毒RNA的含量分別為100pg、10pg、lpg、0.lpg、0.01pg、0.0Olpgo
[0040]圖4是C型鴨肝炎病毒敏感性檢測結(jié)果。
[0041]圖4-1為電泳結(jié)果；4-2為SYBR Green I染色結(jié)果；圖4-3為RT-PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果。其中M為DNA Marker DL2000 ;1_6所對(duì)應(yīng)的病毒RNA的含量分別為100pg、10pg、lpg、0.lpg、0.01pg、0.0Olpgo
【具體實(shí)施方式】
[0042]1.檢測引物的設(shè)計(jì)
[0043]根據(jù)Genbank中已登錄DHAV的3D基因利用Primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，用于鴨甲肝病毒的LAMP檢測，序列見表1。
[0044]表1LAMP檢測引物
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒，其特征是，它包括下述引物:
正向外引物 DHV-F3:5’ -ATCTGGYTGTGCTGTTGGRAT-3’ ；
反向外引物 DHV-B3:5’ -CATARCAYTGRTTGATGTCATAKCC-3’ ； 正向內(nèi)引物 DHV-FIP:5’-ACTCARAGABCCATCRAAWCCAGTTTTGAGTGGGAYAATYTGTTRGC-3’ ； 反向內(nèi)引物 DHV-BIP:5' -CHCAYTATGTAACTGATGAGATHTGGTTTTACAGTRGT RCAKGGDGATCCTGA-3，； 其中 R = A或 G;Y = C或 T;H = A，T或C ；D=G, A或 T;W = A或 T;B = G，T 或C;K =G或T。
2.如權(quán)利要求1所述的一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，按50次量計(jì)包括以下組分:
1)TRIZol:50ml ； 2)反應(yīng)液:2000μ L，包括 IOXBst buffer250 μ LU0mmol/L 的 dNTPlOO μ L、25mmol/L的 MgC12300 μ L、5mol/L 的 betaine200 μ LUOy mol/L 的外引物 DHV-F3、DHV_B3 各 50 μ L、40 μ mol/L 的內(nèi)引物 DHV-FIP,DHV-BIP 各 100 μ L、40U/ μ L 的 RNA 酶抑制劑 100 μ L、5U/ μ L的反轉(zhuǎn)錄酶AMV100 μ L、8U/ μ L的Bst DNA聚合酶100 μ L、DEPC處理水550 μ L ; 3)陽性對(duì)照:重組質(zhì)粒T-DH250μ L，濃度為0.1ng/ μ L ； 4)DEPC 處理水:1ml。`
3.如權(quán)利要求2所述的一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，它還包括 SYBR Green I 為 100 μ L。
4.如權(quán)利要求2或3所述的一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒T-DH的詳細(xì)制備方法為:提取A型鴨甲肝病毒RNA，利用外引物DHV-F3/DHV-B3進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增目的條帶，反應(yīng)條件如下: RT 反應(yīng)體系:10mmol/L dNTPL O μ L、5 X RT 緩沖液 4.0 μ L、20pmol/μ L 的引物DHV-B31.0 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制劑 0.5 μ L、RNA 模板 I μ L、DEPC 水 11.5 μ L ;置于 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，5U/μ L反轉(zhuǎn)錄酶AMVlyL于70°C 5min后加入；反應(yīng)程序:70°C 5min，42°C 30min,95°C 2min ； PCR 反應(yīng)體系:ddH2039y L、20pmol/y L 的引物 DHV-F31.0 μ LU0XPCR 緩沖液4.5 μ L、5U/ μ L Taq DNA聚合酶0.5 μ L、RT產(chǎn)物5.0 μ L ;置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序:95°C 2min預(yù)變性；94°C變性15sec、60°C退火15sec、72°C延伸20sec，共30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 5min。 回收目的條帶，與載體PMD18-T連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，PCR鑒定陽性后進(jìn)行測序，序列正確的質(zhì)粒標(biāo)記為T-DH作為鴨甲肝病毒的陽性對(duì)照。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103509879SQ201310456762
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】于可響, 黃兵, 李玉峰, 馬秀麗, 史玉穎, 姜亦飛, 林樹乾, 宋敏訓(xùn), 李峰 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所