一種1型鴨甲肝病毒vp0重組蛋白及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體設及一種1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白及其 制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 鴨肝炎又名鴨病毒性肝炎值uckviralhepatitis,DVH)，是由鴨肝炎病毒值uck hepatitisvirus,DHV)引起的一種高度接觸性和致死性的鴨病毒性傳染病，其特征為發(fā) 病急、傳播快、病程短、病死率高，病鴨剖檢可見肝腫大、表面呈樹枝狀充血或出血性斑點， 該病最早于1945年發(fā)現(xiàn)于美國。DHV最初分S個血清型值HV-1、DHV-2和DHV-3)，后來 DHV-2和DHV-3被劃歸星狀病毒科，S個血清型之間無抗原相關性。現(xiàn)在DHV-1已被命名 為鴨甲型肝炎病毒值uckh巧atitisAvirus,DHAV)，歸為小RNA病毒科的禽肝炎病毒屬 (Avihepatovirus)，包含S個基因型值HAV-U2和3)，其中1型鴨甲肝病毒值HAV-1)是分 布最廣、危害最大的鴨甲型肝炎病毒。
[0003] DHAV-1屬于小RNA病毒科禽肝病毒屬，病毒粒子呈球形或類球形，直徑20~ 40nm。該類病毒衣殼呈二十面體對稱，包含32個殼粒，沒有囊膜和突起，增殖速度快，繁殖 能力強，復制一代約化。DHAV-1是單鏈RNA病毒，基因組RNA長度7化~8化，分子量為 8. 6Xl〇6Da，其具有較強的感染性。DHAV-1生存能力極強，它能夠抵御外界環(huán)境的影響。在 不同的條件下，該病毒的生存能力不同。如自然環(huán)境下，DHAV-1能夠長時間的存活并且繁 殖，陰涼環(huán)境如濕糞中可W生存37dW上，0~4°C下可存活2年W上，而-20°C下可存活長 達9年。DHAV-1能夠耐受強酸，對氯仿、甲醇、乙酸等有機溶劑均不敏感，并且對常見的消毒 劑如甲醒、福爾馬林等也有明顯的抵抗力，對熱也有一定的耐受作用。DHAV-1不凝集任何動 物的紅細胞，也不吸附任何紅細胞。由于DHAV-1的研究開始較晚，而小RNA病毒科的病毒 成員具有相似的基因復制、功能機制，所W，了解其他小RNA病毒的結構、基因功能等分子 生物學特性，可為DHAV-1分子結構和生物學方面的研究提供更好的思路和創(chuàng)新。
[0004] 小RNA病毒是RNA病毒中最小的一類，分布極為廣泛，可歸為腸道病毒屬 (enterovirus)、口瘡病毒屬（Aphthovirus)、屯、病毒屬（Cardiovirus)、嗜肝病毒屬 化epatovirus)、副腸孤病毒屬（Parechovirus)、馬鼻病毒屬巧rbovirus)、崎病毒屬 化obuvirus)、捷申病毒屬（Teschovirus)、禽肝炎病毒屬（Avihepatovirus)等。小RNA病 毒呈圓形，病毒粒子直徑為20~40nm，無囊膜，病毒的結構蛋白（衣殼蛋白）一般包括VP1、 VP2、VP3和VP4。其中VP1、VP2、VP3暴露在病毒表面，組成一個亞單位。VP2蛋白位于衣 殼表面，含有抗原表位并且有些抗原表位可誘導機體產生中和抗體，衣殼蛋白VP2和促調 亡蛋白/調亡前體蛋白Siva間存在相互作用，柯薩基病毒B3的VP2蛋白可能特異地結合 到調亡前體蛋白Siva上，從而影響細胞調亡的誘導、病毒的擴散W及病毒導致的病理學進 程；VP4埋在病毒粒子內部，處于蛋白外殼的內部與基因組RNA相連接，VP4蛋白在生理溫 度下的向外暴露與病毒顆粒吸附細胞膜時發(fā)生的構象改變有直接的聯(lián)系，在病毒毒粒吸附 細胞膜之后可能參與了病毒進入細胞過程有關的相關事件。小RNA病毒的蛋白外殼具有很 強的自身動態(tài)變化，而不是像晶體結構圖所反映的那樣處于一個靜止狀態(tài)?？贵w與病毒結 構構象關系的研究對理想疫苗的設計及更好地預防小RNA病毒的傳播具有重要意義。但對 DHAV衣殼蛋白的研究相對很少。生物信息學分析和推測表明，DHAV-1的衣殼蛋白可能為 VPUVP3和VPO,而不是像多數(shù)小RNA病毒那樣為VP1、VP2、VP3和VP4,因此DHAV-1到底是 VPO還是VP2和VP4,他們是否位于或暴露在病毒表面目前未見報道，其抗原性的研究報道 較少。
[0005] 因此針對DHAV-1VP0基因進行原核表達，并對原核表達的VP0蛋白在檢測及免 疫保護中的作用進行研究，成為本領域技術人員研究的熱點，現(xiàn)有技術中存在針對DHAV-1 VP0基因進行原核表達得到VP0蛋白的技術，但該VP0蛋白仍存在難于表達和純化、蛋白活 性低，檢測鴨病毒性肝炎抗體精度不高，檢測效率低的缺點，由此可見，將DHAV-1VP0基因 的原核表達方法做進一步改進，使得到的VP0重組蛋白表達量大、純化容易、蛋白活性好， 具有在檢測鴨病毒性肝炎抗體中精度高的優(yōu)點，找到鴨病毒性肝炎的檢測和防治的有效途 徑，成為本領域人員亟待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一是克服現(xiàn)有技術中的問題，提供一種VP0重組蛋白及其制備方 法和用途。
[0007] 為解決上述技術問題，采用的技術方案包括：
[0008] -種1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白，其氨基酸序列如沈QIDNO: 1所示，其DNA序 列如沈QIDNO:2所示。
[0009] 一種上述1型鴨甲肝病毒VPO重組蛋白的制備方法，包括如下步驟：
[0010] 步驟一 ：1型鴨甲肝病毒VP0全基因的克?。悍治龃_定1型鴨甲肝病毒VP0全基因 及酶切位點，根據Genbank登錄號為JQ316452. 1的DHAV-1X株全基因序列，設計擴增1型 鴨甲肝病毒VP0基因DNA片段的特異性引物，同時在引物的5'端添加上BamHI和化0I 兩個酶切位點，提取1型鴨甲肝病毒的RNA，利用特異性引物進行RT-PCR擴增，得到1型鴨 甲肝病毒VP0全基因的目的片段；
[0011] 步驟二：構建重組表達載體祀T-32a(+)/VP0 :將1型鴨甲肝病毒VP0全基因的 目的片段進行T克隆得到PMD18-T/VP0,分別培養(yǎng)含重組質粒PMD18-T/VP0和表達質粒 祀T-32a(+)的菌株，提取質粒，并用BamHI和化0I對其進行雙酶切，分析、回收、純化 后，將得到帶有粘性末端的1型鴨甲肝病毒VP0全基因的目的片段與雙酶切處理過表達質 粒祀T-32a(+)進行連接，將連接產物進行轉化和鑒定；
[0012] 步驟S:制備1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白：將重組表達載體祀T-32a(+)/VP0轉 化到Ecoli.化21表達宿主菌中，篩選，將篩選后的含重組表達載體祀T-32a(+)/VP0的菌株 經培養(yǎng)誘導表達，將表達產物經鑒定、純化后，得到1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白。
[0013] 進一步的，所述特異性引物為：
[0014] 上游引物P1 :5 'GGATCCGAAATGGATACTCTTACCAAAAAT3，，
[0015]下游引物P2 :5'CTCGAGTCCCTGATTGTCAAATGGTC3，。
[0016] 進一步的，所述步驟二中1型鴨甲肝病毒VP0全基因的目的片段進行T克隆的方 法為：將所述步驟一獲得的1型鴨甲肝病毒VP0全基因的目的片段進行純化回收，純化產物 末端加A,與PMD18-T載體連接得到連接產物，將所述連接產物轉化至感受態(tài)細胞，菌液PCR篩選陽性克隆，將得到的PMD18-T/VP0進行酶切鑒定。
[0017] 進一步的，所述步驟二中的連接反應體系為，帶有粘性末端的1型鴨甲肝病毒VP0 全基因的目的片段5.5yl，表達載體祀T-32a(+)2yl，2XT4DNALigaseMix7.5yl。瞬 離，混勻，16 °C連接過夜。
[0018] 進一步的，所述1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白的誘導表達條件為：將重組表達載體 pET-32a(+)/VP0 轉化到宿主菌化21 中，0. 4mmol/LIPTG、37°C誘導化；
[0019] 進一步的，所述步驟S中純化方法為Ni2+-NTA親和層析純化。
[0020] 1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白用于作為檢測1型鴨病毒性肝炎抗體的檢測試劑。
[0021] 一種用于檢測1型鴨病毒性肝炎抗體的化ISA試劑盒，包括化ISA板、PBST緩沖 液、封閉液、酶標二抗、顯色液W及終止液，所述化ISA試劑盒還包括權利要求1所述的1型 鴨甲肝病毒VP0重組蛋白，所述化ISA的反應條件為1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白作為抗 原的包被濃度為1.67iig/ml，最佳包被條件為37°C比轉4°C過夜，血清稀釋度為1 :160， HRP標記的羊抗鴨IgG的釋度為1 :400,封閉液為5%的明膠，封閉時間為0.化，顯色時間為 10min〇
[0022] 1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白用于作為1型鴨病毒性肝炎的基因工程亞單位疫苗。
[0023] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0024] 1.成功構建了重組表達載體祀T-32a(+)/VP0并能在大腸桿菌中表達1型鴨甲肝 病毒VP0重組蛋白；容易獲得滿足應用要求的重組蛋白，用Ni2+-NTA親和層析純化的方法獲 得純度較高、活性較好的重組蛋白；制備的1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白可用于鴨病毒性肝 炎的檢測和防治；
[002引 2.重組蛋白能與兔抗DHAV-1血清反應，具有良好的反應原性，可用于1型鴨甲肝 病毒抗體的檢測；成功建立了基于VP0重組蛋白的間接化ISA方法，該方法具有重復性好和 特異性強的特點；其中針對鴨病毒性肝炎抗體檢測精度高，W1. 67yg/ml的重組蛋白作包 被抗原可檢測21Z稀釋的待檢血清；
[0026] 3.對VP0重組蛋白進行免疫原性分析，結果表明，重組蛋白能夠刺激機體產生抗 體并引起細胞因子含量的變化，可用于1型鴨病毒性肝炎的防治。
【附圖說明】
[0027] 圖1所示為本發(fā)明VP0全基因的RT-PCR產物鑒定圖。
[0028] 圖2所示為本發(fā)明PMD18-T/VP0質粒的PCR鑒定圖。
[0029] 圖3所示為本發(fā)明PMD18-T/VP0質粒的酶切鑒定圖。
[0030] 圖4所示為本發(fā)明祀T-32a(+)/VP0質粒的PCR鑒定圖。
[0031] 圖5所示為本發(fā)明祀T-32a(+)/VP0質粒的酶切鑒定圖。
[0032] 圖6所示為本發(fā)明1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白免疫印跡圖。
[0033] 圖7所示為本發(fā)明1型鴨甲肝病毒VP0重組蛋白純化前后的電泳圖。
[0034] 圖8所示為本發(fā)明IPTG濃度的優(yōu)化圖。
[0035] 圖9所示為本發(fā)明誘導表達時間的優(yōu)化圖。
[0036] 圖10所示為本發(fā)明誘導表達溫度的優(yōu)化圖。
[0037] 圖11所示為本發(fā)明VPO重組蛋白可溶性分析圖。
[0038] 圖12所示為本發(fā)明VP0重組蛋白ELISA檢測免疫維鴨的抗體水平圖。
[0039] 圖13所示為本發(fā)明VP0重組蛋白免疫維鴨細胞因子的ELISA檢測結果：圖13A: VP0重組蛋白免疫維鴨CD4T淋己細胞亞群的含量化ISA檢測結果圖；圖13B:VP0重組蛋白 免疫維鴨CD8T淋己細胞亞群的含量化ISA檢測結果圖；圖13C:VP0重組蛋白免疫維鴨IL-4 的含量化ISA檢測結果圖；圖13D:VP0重組