專利名稱：甲肝病毒中國株和減毒株的培育及互補(bǔ)脫氧核糖核酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲型肝炎病毒(HAV)，特別是HAV中國流行株Gkm及其減毒株的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，以及減毒株的培育方法、過程和條件。
背景技術(shù)：
甲型肝炎是世界性傳染病，它是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的全世界約40億人受到威脅。在中國，35歲以上的成年人中，甲肝受染率達(dá)90％，常引起季節(jié)性流行。由于該病的高發(fā)病率及較長的病程，給人民健康及經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來嚴(yán)重影響。根據(jù)我國現(xiàn)實(shí)情況，控制甲肝流行的有效和根本措施在于發(fā)展疫苗，而疫苗的關(guān)鍵是良好的減毒株。
美國MERCK公司Provost等人于1986年曾報(bào)告獲得HAV F’減毒株，美國NIH的Purcell等人也于1987年報(bào)告獲得甲肝病毒HM175/7MK-5減毒株，并搞清了其cDNA全序列，但人試結(jié)果證明，免疫效果很差，故至今未有進(jìn)一步擴(kuò)大人試的工作。
浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院經(jīng)過多年努力，成功地研制出甲肝病毒減毒活疫苗株(H2)，并經(jīng)大量人群接種證明可有效預(yù)防甲肝的傳染，為控制該病流行提供最有效的措施。但至今尚未有該毒株的原株病毒及相關(guān)毒株的序列報(bào)道。本發(fā)明將填補(bǔ)這一空白，搞清HAV中國株及其減毒株和疫苗株的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，從而進(jìn)一步了解毒株的遺傳特性和遺傳穩(wěn)定性，闡明HAV減毒的分子機(jī)理，并為研制快速生長、高滴度、高抗原性的新型甲肝疫苗創(chuàng)造條件，為基因工程多肽疫苗的研制提供科學(xué)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述本發(fā)明涉及分離的和基本純化的人甲型肝炎病毒中國株Gkm的制劑、Gkm基因組RNA的制劑及Gkm的cDNA。
本發(fā)明還涉及人甲型肝炎病毒中國株Gkm的cDNA核苷酸序列及其變異體。
本發(fā)明還涉及分離的和基本純化的人甲型肝炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)株H2K5的制劑、H2K5基因組RNA的制劑及H2K5的cDNA。
本發(fā)明還涉及人甲型肝炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)株H2K5的cDNA核苷酸序列及其變異體，特別是HAV基因組5’非編碼區(qū)(NCR)、2A區(qū)和2C區(qū)的cDNA序列。
本發(fā)明還涉及分離的和基本純化的人甲型肝炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)株H2K20的制劑、H2K20基因組RNA的制劑及H2K20的cDNA。
本發(fā)明還涉及人甲型肝炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)株H2K20的cDNA核苷酸序列及其變異體。
本發(fā)明還涉及分離的和基本純化的人甲型肝炎病毒減毒株H2K25的制劑、H2K25基因組RNA的制劑及H2K25的cDNA。
本發(fā)明還涉及人甲型肝炎病毒減毒株H2K25的cDNA核苷酸序列及其變異體，特別是HAV基因組5’非編碼區(qū)(NCR)、2A區(qū)和2C區(qū)的cDNA序列。
本發(fā)明還涉及分離的和基本純化的人甲型肝炎病毒減毒株H2M20K5的制劑、H2M20K5基因組RNA的制劑及H2M20K5的cDNA。
本發(fā)明還涉及人甲型肝炎病毒減毒株H2M20K5的cDNA核苷酸序列及其變異體，特別是HAV基因組5’非編碼區(qū)(NCR)、2A區(qū)和2C區(qū)的cDNA序列。
本發(fā)明還涉及基于上述所有cDNA序列，設(shè)計(jì)引物而選擇性擴(kuò)增甲型肝炎基因片段，從而在甲型肝炎病毒的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)、毒性檢測(cè)和細(xì)胞適應(yīng)性檢測(cè)及生物樣品檢測(cè)中應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及基于上述所有cDNA序列，應(yīng)用基因工程技術(shù)制造的任何甲肝病毒減毒株。
本發(fā)明還涉及基于上述所有cDNA序列，應(yīng)用基因工程技術(shù)制造的任何甲肝病毒多肽疫苗。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及分離的和基本純化的人甲型肝炎病毒(HAV)中國流行株Gkm。該病毒株是直接從杭州近郊的甲型肝炎病人糞便中分離的，并經(jīng)F113和PEG沉淀及差速離心和超速離心純化的毒株。
本發(fā)明還涉及人HAV Gkm株的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，它能夠指導(dǎo)產(chǎn)生HAV蛋白質(zhì)或與HAV蛋白質(zhì)基本同源的蛋白質(zhì)。該核酸序列被稱為Gkm，它作為Gkm NO.1示于下面AAGTCCATGG TGAGGGGACT TGATACCTCA CCGCCGTTTG CCTAGGCTAT 90AGGCTAAATT TCCCTTTCCC TGTCCTTCCC CTATTTCCTT TTGTTTTGTT 140TGTAAATATT AATTCCTACA GGTTCAGGGT TCTTTAATCT GTTTCTCTAT 190AAGAACACTC AATTTTCACG CTTTCTGTCT TCTTTCTTCC AGGGCTCTCC 240CCTTGCCCTA GGCTCTGGCC GTTGCGCCCG GCGGGGTCAA CTCCATGAGT 290AGCATGGAGC TGTAGGAGTC TAAATTGGGG ACGCAGATGT TTGGGACGTC 340ACCTTGCAGT GTTAACTTGG CTCTCATGAA CCTCTTTGAT CTTCCACAAG 390GGGTATTCTA CGGGTGAAAC CTCTTAGGCT AATACTTCTA TGAAGAGATG 440CCTTGGATAG GGTAACAGCG GCGGATATTG GTGAGTTGTT AAGACAAAAA 490CCATTCAACG CCGGAGGACT GGCTCTCATC CAGTGGATGC ATTGAGTGAA 540TTGATTGTCA GGGCTGTCTC TAGGTTTAAT CTCAGACCTC TCTGTGCTTA 590GGGCAAACAC TATTTGGCCT TAAATGGGAT CCTGTGAGAG GGGGTCCCTC 640CATTGACAGC TGGACTGTTC TTTGGGGCCT TATGTGGTGA TTGCCTCTGA 690GGTACTCAGG GGCATTTAGG TTTTTCCTCA TTCTTAAACA ATAATGAATA 740TGTCCAAACA AGGAATTTTC CAGACTGTTG GGAGTCGCCT TGACCACATC 790CTGTCTCTGG CAGATATTGA GGAAGAACAA ATGATTCAGT CCGTTGATAG 840GACTGCAGTG ACTGGTGCTT CTTATTTGAC TTCTGTTGAC CAATCTTCAG 890TTCACACTGC TGAAGTTGGC TCACATCAAA TTGAACCTTT GAAAACCTCT 940GTTGATAAAC CTGGTTCTAA GAAGACTCAG GGGGAGAAGT TTTTCCTGAT 990TCATTCTGCT GATTGGCTCA CTACACATGC TCTTTTTCAT GAAGTTGCAA 1040AGTTGGATGT GGTGAAATTA CTGTATAATG AGCAGTTTGC TGTCCAAGGT 1090TTGTTGAGAT ACCATACACA TGCAAGATTT GGCATTGAGA TTCAAGTTCA 1140GATAAACCCC ACACCCTTTC AGCAAGGGGG ACTAATTTGT GCCATGGTTC 1190CTGGTGACCA AAGTTATGGT TCGATAGCAT CCTTGACTGT TTATCCCCAT 1240GGTCTGTTAA ATTGTAACAT CAACAATGTA GTTAGAATAA AGGTTCCATT 1290TATTTATACT AGAGGTGCTT ACCATTTTAA AGATCCACAA TACCCAGTTT 1340GGGAATTGAC AATCAGAGTT TGGTCAGAGT TGAATATTGG AACAGGAACT 1390TCAGCTTACA CTTCACTTAA TGTTTTAGCT AGGTTTACAG ATTTGGAGTT 1440GCATGGATTA ACTCCTCTTT CTACACAAAT GATGAGAAAT GAATTTAGAG 1490TTAGTACTAC TGAAAATGTT GTGAATTTGT CAAATTATGA AGATGCAAGG 1540GCAAAAATGT CTTTTGCTTT GGATCAGGAA GATTGGAAGT CTGATCCCTC 1590TCAAGGTGGT GGAATTAAGG TCACTCATTTT TACTACTTGG ACATCCATTC 1640CAACCTTAGC TGCACAGTTT CCATTTAATG CTTCAGACTC GGTTGGACAA 1690CAAATTAAAG TTATTCCAGT CGACCCATAT TTTTTCCAGA TGACAAATAC 1740TAATCCTGAT CAAAAATGTA TAACTGCCCT GGCTTCTATT TGTCAAATGT 1790TTTGCTTTTG GAGGGGAGAT CTTGTTTTTG ATTTTCAAGG TTTTCCCACC 1840AAATATCATT CAGGTAGATT ATTGTTTTGT TTTGTTCCTG GCAATGAGTT 1890AATAGATGTT TCTGGAATTA CATTGAAGCA AGCAACTACT GCTCCTTGTG 1940CAGTAATGGA CATTACAGGA GTGCAATCAA CCTTGAGATT TCGTGTTCCT 1990TGGATTTCTG ATACACCCAA TCGAGTAAAT AGGTACACGA AGTCAGCACA 2040TCAAAAAGGT GAGTACACTG CCATTGGGAA GCTTATTGTG TATTGTTATA 2090ATAGACTGAC TTCTCCTTCA AATGTTGCTT CTCATGTTAG AGTTAATGTT 2140TATCTTTCAG CAATTAATTT GGAATGTTTT GCTCCTCTTT ATCATGCTAT 2190GGATGTTACT ACACAGGTTG GAGATGATTC AGGAGGTTTT TCAACAACAG 2240TTTCTACAGA GCAGAATGTT CCTGATCCCC AAGTTGGCAT AACAACCATG 2290AGGGACCTAA AAGGGAAAGC CAATAGGGGA AAGATGGATG TTTCAGGCGT 2340GCAAGCACCT GTGGGAGCTA TTACAACAAT TGAGGATCCA GTTTTAGCAA 2390AGAAAGTGCC TGAGACATTT CCTGAATTGA AGCCTGGAGA GTCCAGACAT 2440ACATCAGATC ATATGTCTAT TTATAAGTTC ATGGGAAGGT CTCATTTCTT 2490GTGTACTTTT ACCTTCAATT CAAATAATAA AGAGTACACA TTTCCTATAA 2540CCTTGTCTTC AACCTCTAAT CCTCCTCATG GTTTGCCATC AACACTGAGG 2590TGGTTTTTCA ACTTGTTTCA GTTGTATAGA GGGCCTTTAG ATCTGACAAT 2640TATTATTACA GGAGCAACTG ATGTAGATGG CATGGCCTGG TTCACTCCAG 2690TAGGTCTTGC CGTTGATACT CCTCGGGTAG AGAAGGAGTC AGCTTTCTCT 2740ATTGACTACA AAACTGCCCT TGGAGCTGTT AGGTTTAATA CAAGAAGAAC 2790AGGGAACATT CAGATTAGAT TGCCATGGTA TTCTTATTTG TATCCTGTGT 2840CTGGAGCACT GGATGGTTTG GGAGATAAGA CAGATTCTAC ATTTGGATTG 2890GTTTCTATTC AGATTGCAAA TTACAATCAT TCTGATGAAT ATTTGTCCTT 2940TAGTTGTTAT TTGTCTGTCA CAGAGCAATC AGAGTTCTAT TTTCCTAGAG 2990CTCCATTAAA TTCAAATGCT ATGTTGTCCA CTGAGTCCAT GATGAGTAGA 3040ATTGCAGCTG GAGACTTGGA GTCATCGGTG GATGATCCTA GATCAGAGGA 3090GGACAGAAGA TTTGAGAGTC ATATAGAATG TAGGAAACCA TACAAGGAAT 3140TGAGATTGGA GGTTGGCAAA CAAAGACTCA AATATGCTCA GGAAGAGTTG 3190TCAAATGAAG TGCTTCCACC TCCTTGGGAG ATGAAGGGAC TATTTTCACA 3240AGCTAAGATT TCTCTTTTTT ATACTGAGGA GCATGAAATA ATGAAATTTT 3290CTTGGAGAGG AGTGACTGCT GATACTAGGG CTTTGAGAAG ATTTGGATTC 3340TCTATGGCTG CTGGAAGAAG TGTGTGGACT CTTGAGATGG ATGCTGGAGT 3390TCTTACTGGA AGATTGATCA GATTGAATGA TGAGAAATGG ACAGAAATGA 3440AGGATGATAA AATTGTCTCA TTAATCGAAA AGTTCACAAG CAATAAATAC 3490TGGTCTAAAG TGAGTTTTCC ACATGGAATG TTGGATCTTG AAGAAATTGC 3540TGCTAACTCT ACAGATTTTC CAAATATGTC TGAGACAGAT TTGTGTTTCC 3590TGTTGCATTG GCTAAATCCA AAGAAAATTA ATTTAGCAGA TAGAATGCTT 3640GGATTGTCTG GGGTTCAGGA AATTAAAGAC CAAGGTGTTG GATTGATAGC 3690AGAGTGCAGA ACTTTCTTAG ATTCTATTGC TGGAACTCTA AAATCTATGA 3740TGTTTGGATT TCATCATTCT GTGACTGTTG AAATTATAAA CACTGTACTT 3790TCTTTTGTTA AGAGTGGAAT CCTGCTTTAT GTTATACAAC AATTGAATCA 3840AGATGAGCAC TCTCACATAA TTGGTTTGTT GAGAGTTATG AATTATGCAG 3890ATATTGGCTG CTCAGTTATT TCATGTGGCA AAGTTTTTTC TAAAATGTTA 3940GAAACAGTTT TTAATTGGCA GATGGATTCC AGAATGATGG AGCTGAGAAC 3990TCAGAGCTTT TCCAATTGGT TAAGAGATAT TTGTTCAGGA ATTACTATTT 4040TTAAAAGTTT TAAGGATGCC ATATATTGGC TATATACAAA ATTGAAGGAT 4090TTTTATGAAG TAAACTATGG CAAGAAGAAG GATATTCTTA ATATTCTTAA 4140GGCCAACCAA CAAAAAATAG AAAAAGCCAT TGAAGAAGCA GACCAATTTT 4190GCATTTTGCA ATTCCAAGAT GTAGAGAAAT TTGATCAGTA TCAGAAAGGG 4240GTTGATTTAA TACAAAAGCT GAGAACTGTC CAATCAATGG CTCAAGTTGA 4290CCCTAACCTT GGGGTTCATT TGTCACCTCT CAGAGATTGC ATAGCCAGAG 4340TCCATCAAAA GCTCAAGAAT CTTGGATCTA TAAATCAGGC CATGGTGACA 4390AGATGTGAGC CAGTTGTTTG CTATTTATAT GGCAAAAGAG GGGGAGGGAA 4440AAGTTTGACT TCAATTGCAT TGGCAACCAA AATCTGTAAA CACTATGGTG 4490TTGAACCGGA GAAAAATATT TACACTAAAC CTGTGGCCTC AGATTATTGG 4540GATGGTTACA GTGGACAATT GGTTTGCATT ATTGATGATA TTGGCCAAAA 4590CACAACAGAT GAAGATTGGT CAGATTTTTG TCAATTAGTG TCAGGATGCC 4640CAATGAGATT GAATATGGCT TCTCTTGAGG AGAAGGGCAG ACATTTTTCC 4690TCTCCTTTTA TAATAGCAAC TTCAAACTGG TCAAATCCAA GTCCAAAAAC 4740AGTTTATGTT AAGGAAGCAA TTGATCGTAG GCTTCATTTT AAGGTTGAAG 4790TTAAACCTGC TTCATTTTTT AAAAATCCTC ACAATGATAT GTTGAATGTT 4840AATTTGGCTA AAACAAATGA TGCAATTAAG GACATGTCTT GTGTTGATTT 4890AATAATGGAT GGACATAATA TTTCATTGAT GGATTTACTT AGTTCCTTAG 4940TGATGACAGT TGAAATTAGG AAACAAAATA TGAGTGAATT CATGGAGTTG 4990TGGTCTCAGG GAATTTCAGA TGATGACAAT GATAGTGCAG TAGCTGAGTT 5040TTTCCGGTCT TTTCCATCTG GAGAACCATC AAATTCCAAA TTATCTAGTT 5090TTTTCCAATC TGTTACTAAT CACAAGTGGG TTGCTGTGGG AGCTGCAGTT 5140GGCATTCTTG GAGTGCTTGT GGGAGGATGG TTCGTGTATA AGCATTTCTC 5190CCGCAAAGAG GAAGAACCAA TTCCAGCTGA AGGGGTTTAC CATGGCGTGA 5240CTAAGCCTAA ACAAGTGATT AAATTGGATG CAGATCCAGT GGAGTCTCAG 5290TCAACTTTGG AAATAGCTGG ATTAGTTAGG AAAAATTTGG TCCAGTTTGG 5340AGTTGGGGAG AAAAATGGAT GTGTGAGATG GGTCATGAAT GCCTTAGGAG 5390TGAAGGATGA TTGGCTGTTA GTACCTTCTC ATGCTTATAA ATTTGAAAAG 5440GATTATGAAA TGATGGAGTT TTATTTCAAT AGAGGTGGAA CTTACTATCC 5490AATTTCAGCA GGCAATGTTG TTATTCAATC CTTAGATGTG GGGTTTCAAG 5540ATGTTGTTCT AATGAAAGTT CCTACAATTC CCAAGTTTAG AGATATTACT 5590CAACATTTTA TCAAGAAAGG AGATGTGCCT AGAGCTTTGA ATCGCTTGGC 5640AACATTAGTG ACAACTGTTA ATGGAACCCC TATGTTAATT TCTGAGGGAC 5690CATTAAAGAT GGAGGAAAAA GCCACTTATG TTCATAAGAA GAATGATGGT 5740ACTACAGTTG ATTTGACTGT TGATCAGGCA TGGAGAGGAA AAGGTGAAGG 5790CCTTCCTGGA ATGTGTGGTG GGGCCCTGGT GTCATCAAAT CAGTCTATAC 5840AAAATGCAAT TTTGGGTATT CATGTTGCTG GAGGAAATTC AATTCTTGTG 5890GCAAAGTTGG TTACTCAAGA GATGTTTCAA AACATTGATA AGAAAATTGA 5940AAGTCAGAGA ATAATGAAAG TGGAATTTAC TCAGTGTTCA ATGAATGTAG 5990TCTCCAAAAC GATTTTTAGA AAGAGTCCCA TTCATCACCA CATTGATAAA 6040ACCATGATTA ATTTTCCTGC AGTTATGCCT TTTTCTAAAG CTGAAGTTGA 6090TCCAATGGCT GTGATGTTAT CCAAATATTC ATTACCTATT GTGGAAGAAC 6140CAGAGGATTA CAAAGAGGCT TCAATTTTTT ATCAAAACAA AATAGTAGGC 6190AAGACTCAGT TAGTTGATGA CTTTCTAGAT CTTGATATGG CCATTACAGG 6240GGCTCCAGGC ATTGATGCTA TCAATATGGA TTCATCTCCT GGGTTTCCTT 6290ATGTTCAAGA AAAATTGACC AAAAGAGATT TAATTTGGTT GGATGAAAAT 6340GGTTTGTTGC TAGGAGTTCA TCCAAGATTG GCTCAGAGAA TTTTATTTAA 6390TACTGTCATG ATGGAAAATT GTTCTGACCT AGATGTTGTT TTTACAACTT 6440GTCCAAAAGA TGAATTGAGA CCATTAGAGA AAGTTTTGGA ATCAAAAACA 6490AGAGCAATTG ATGCTTGGCC TTTGGATTAT ACAATTCTAT GTCGAATGTA 6540TTGGGGTCCA GCTATTAGTT ATTTTCATTT GAATCCAGGG TTTCACACAG 6590GTGTTGCTAT TGGCATAGAT CCTGATAGAC AATGGGATGA ATTATTTAAA 6640ACAATGATAA GATTTGGAGA TGTTGGTCTT GATTTAGATT TTTCTGCCTT 6690TGATGCTAGT CTTAGTCCAT TTATGATTAG AGAAGCAGGT AGAATTATGA 6740GTGAATTATC TGGAACTCCA TCTCATTTTG GAACAGCTCT TATCAATACT 6790ATCATTTATT CTAAACATTT GTTGTACAAT TGTTGTTATC ATGTCTGTGG 6840TTCAATGCCT TCTGGGTCTC CTTGTACAGC TTTGTTGAAT TCAATTATCA 6890ACAATATCAA TTTGTATTAT GTATTTTCTA AAATATTTGG AAAGTCTCCA 6940GTTTTCTTTT GTCAAGCTCT GAGGATCCTT TGTTATGGAG ATGATGTTTT 6990GATAGTATTT TCCAGAGATG TTCAAATTGA CAATCTTGAT TTGATTGGAC 7040AGAAAATTGT GGATGAGTTC AAAAAACTTG GCATGACAGC TACCTCAGCT 7090GACAAAAATG TGCCTCAACT GAAGCCAATT TCAGAATTGA CTTTTCTCAA 7140AAGATCCTTT AATTTGGTGG AGGATAGAAT TAGACCTGCA ATTTCAGAGA 7190AGACGATTTG GTCTTTGATA GCTTGGCAGA GATGCAACGC TGAGTTTGAG 7240CAGAATTTAG AAAATGCTCA GTGGTTTGCT TTTATGCATG GCTATGAGTT 7290TTATCAGAAA TTTTATTATT TTGTTCAGTC CTATTTGGAG AAAGAGATGA 7340TAGAATATAG GCTTAAATCT TATGATTGGT GGAGAATGAG ATTTTATGAC 7390CAGTGTTTCA TTTGTGACCT TTCATGATTT GTTTAAACAA ATTTTCTTAA 7440AATTTCTGAG GTTTGTTTAT TTCTTTTATC AGTAAATAAA 7480本發(fā)明涉及經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的人HAV H2K5株。該病毒株是HAV Gkm株在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17中，經(jīng)35℃培育5代后獲得的病毒株。
本發(fā)明還涉及HAV H2K5的cDNA序列，特別是HAV基因組5’非編碼區(qū)(NCR)、2A區(qū)和2C區(qū)的cDNA序列。該組核苷酸序列分別作為SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO3示于下面。SEQ NO.1(HAV H2K5 5’NCR區(qū)，101bp-200bp)5’TTCCCTTTCC CCTTCCCCTT CCTTGTTTTG ATTGTAAATATAAATTCCTG CAGGTTCAGG GTTCTT GAA TTGGCATTAAATTTGTTTCT CTATAAGAAC 3’SEQ NO.2(HAV H2K5 2A區(qū)，3011bp-3110bp)5’TATGTTATCC ACTGAATCAA TGATGAGCAG AATTGCGGCTGGAGACTTGG AGTCATCAGT GGATGATCCT AGATCAGAGGAGGATAAAAG ATTTGAGAGT 3’SEQ NO.3(HAV H2K5 2C區(qū)，3986bp-4085bp)5’CACAGAGTTT TTCCAACTGG TTAAGAGATA TCTGTTCAGGGATCACTATT TTTAAAAACT TCAAGGATGC AATTTATTGGCTCTATACAA AATTGAAGGA 3’本發(fā)明涉及經(jīng)低溫細(xì)胞培養(yǎng)的人HAV H2K20株。該病毒株是HAV Gkm株在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17中，經(jīng)35℃培育15代，32℃培育5代后獲得的病毒株。
本發(fā)明還涉及HAV H2K20涉及cDNA序列，它能夠指導(dǎo)產(chǎn)生HAV蛋白質(zhì)或與HAV蛋白質(zhì)基本同源的蛋白質(zhì)。該核酸序列被稱為H2K20，它作為H2K20NO.1示于下面TTCAAGAGGG GTCTCCGGGA ATTTCCGGAG TCCCTCTTGG AAGTCCATGG 130TGAGGGGACT TGATACCTCA CCGCCGTTTG GTTCTTTAAA TTGGCATTGA 180ATTTGTTTCT CTATAAGAAC ACTCATTTTC ACGCTTTCTG TCTTCTTTCT 230TCCAGGGCTC TCCCCTTGCC CTAGGCTCTG GCCGTTGCGC CCGGCGGGGT 280CAACTCCATG ATTAGCATGG AGCTGTAGGA GTCTAAATTG GGGACACAGA 330TGTTTGGAAC GTCACCTTGC AGTGTTAACT TGGCTTTCAT GAATCTCTTT 380GATCTTCCAC AAGAGGTAGG CTACGGGTGA AACCTCTTAG GCTAATACTT 430CTATGAAGAG ATGCTTTGGA TAGGGTAACA GCGGCGGATA TTGGTGAGTT 480GTTAAGACAA AAACCATTCA ACGCCGGAGG ACTGACTCTC ATCCAGTGGA 530TGCATTGAGT GGATTGACTG TCAGGGCTGT CTCTAGGCTT AATTCCAGAC 580CTCTCTGTGC TTAGGGCAAA CATCATTTGG CCTTAAAAGG GGTTCTGTGA 630GAGGGGATCC CTCCATTAAC AGCTGGACTG TTCTTTGGGG CCTTATGTGG 680TGTTTGCCGC TGAGGTACTC AGGGGCATTT AGGTTTTTCC TCATTCTCAA 730ATAATAATGA ATATGTCTAG ACAGGGTATT TTTCAGACTG TTGGGAGTGG 780TCTTGACCAC ATCCTGTCTC TGGCAGATAT TGAGGAAGAG CAAATGATTC 830AGTCAGTTGA TAGGACTGCA GTGACTGGAG CTTCTTATTT TACTTCTGTG 880GATCAATCTT CAGTTCATAC TGCTGAGGTT GGATCACATC AGGTTGAACC 930TTTGAGAACC TCTGTTGATA AACCTGGATC AAAGAAGACT CAAGGAGAGA 980AATTTTTTCT GATTCATTCT GCAGATTGGC TTACTACACA TGCTCTTTTC 1030CATGAAGTTG CAAAATTGGA TGTGGTGAAA TTATTGTATA ATGAACAGTT 1080TGCTGTTCAA GGTTTGTTGA GATATCATAC ATATGCAAGA TTTGGCATTG 1130AAATTCAAGT TCAGATAAAC CCTACGCCTT TTCAACAAGG GGGATTGATC 1180TGTGCTATGG TTCCTGGTGA TCAGAGCTAT GGTTCTATAG CATCATTGAC 1230TGTTTATCCT CATGGTTTGC TGAATTGCAA TATCAACAAT GTGGTGAGAA 1280TAAAGGTTCC ATTTATTTAC ACAAGGGGTG CTTACCATTT TAAAGATCCC 1330CAATACCCAG TCTGGGGATT GACAATTAGA GTTTGGTCAG AATTAAATAT 1380TGGACCAGGA ACTTCAGCTT ATACTTCACT CAATGTTTTA GCTAGATTTT 1430CAGTTTTGGA GTTGCATGGA TTAACTCCTC TTTCCACACA AATGATGAGG 1480AATGAATTTA GGGTCAGTAC CTCTGAAAAT GTGGTGAATT TGTCAAATTA 1530TGAAGATGCA AGAGCAAAGA TGTCTTTTGC TTTAGATCAG GAAGATTGGA 1580AATCTGATCC ATCCCAAGGT GGCGGAATTA AAATTACTCA TTTCACTACT 1630TGGACATCTA TCCCAACTTT GGCTGCTCAG TTTCCATTTA ATGCTTCAGA 1680TTCAGTTGGT CAGCAAATTA AAGTTATTCC AGTTGATCCA TATTTTTTCC 1730AAATGACAAA CACAAACCCT GACCAAAAAT GTATAACTGC TTTGGCTTCT 1780ATTTGTCAGA TGTTTTGTTT TTGGAGAGGA GATCTTGTCT TTGATTTTCA 1830GGTTTTCCCG ACCAAATATC ATTCAGGTAG ATTACTATTT TGTTTTGTTC 1880CTGGTAATGA GCTAATAGAT GTTTCTGGAA TCACATTAAA ACAGGCAACT 1930ACTGCTCCTT GTGCAGTGAT GGACATTACA GGAGTGCAGT CAACTTTGAG 1980ATTTCGTGTT CCCTGGATTT CTGATACACC CTATCGGGTA AACAGATATA 2030CAAAGTCAGC ACATCAGAAA GGTGAGTACA CTGCCATTGG GAAGCTTATT 2080GTGTACTGTT ATAACAGATT GACTTCTCCT TCTAACGTTG CTTCCCATGT 2130TAGAGTGAAT GTTTATCTTT CAGCAATTAA TTTGGAATGC TTTGCTCCTC 2180TTTATCATGC CATGGATGTT ACCACACAGG TTGGAGATGA TTCTGGGGGT 2230TTTTCAACAA CAGTTTCTAC AGAGCAGAAT GTTCCAGATC CCCAAGTTGG 2280TATAACAACC ATGAAGGATT TAAAAGGTAA AGCTAATAAG GGAAAAATGG 2330ATGTTTCAGG AGTGCAAGCA CCTGTGGGAG CTATTACAAC AATTGAGGAT 2380CCTGTTTTAG CAAAGAAAGT ACCTGAGACA TTCCCTGAAT TGAAACCTGG 2430AGAGTCTAGG CATACATCAG ATCATATGTC TATTTACAAG TTTATGGGAA 2480GGTCTCATTT TTTGTGCACT TTTACTTTTA ATTCAAACAA TAAAGAGTAC 2530ACATTTCCTA TAACCTTGTC TTCAACCTCC AATCCTCCTC ATGGTTTACC 2580ATCAACATTG AGGTGGTTTT TCAATTTGTT TCAATTGTAT AGAGGACCTT 2630TAGATCTGAC AATTATCATC ACTGGAGCAA CTGATGTAGA TGGCATGGCT 2680TGGTTTACAC CAGTAGGTCT TGCCGTTGAT ACTCCCTGGG TAGAAAAGGA 2730GTCAGCCCTG TCTATTGACT ACAAAACTGC TCTTGGAGCT GTCAGATTCA 2780ATACAAGGAG AACAGGGAAC ATTCAGATTA GGTTACCATG GTATTCTTAT 2830TTATATGCTG TGTCTGGAGC ACTGGATGGT TTGGGAGATA AGACAGATTC 2880TACATTCGGA TTGGTTTCTA TTCAGATTGC AAATTATAAT CATTCTGATG 2930AATATTTGTC TTTTAGTTGC TATTTGTCTG TCACAGAACA ATCAGAATTT 2980TATTTTCCCA GAGCTCCATT GAATTCATAT GCTATGTTAT CCACTGAATC 3030AATGATGAGC AGAATTGCGG CTGGAGACTT GGAGTCATCA GTGGATGATC 3080CTAGATCAGA GGAGGACAAA AGATTTGAGA GTCATATAGA ATGCAGGAAA 3130CCCTATAAAG AATTGAGATT GGAAGTTGGG AAACAAAGAC TCAAGTATGC 3180TCAGGAAGAA TTGTCAAATG AAGTGCTCCC ACCCGCTAGG AAAATGAAGG 3230GGTTGTTTTC ACAAGCTAAA ATTTCTCTTT TTTACACTGA GGAGCATGAA 3280ATAATGAAAT TTTCTTGGAG AGGAGTGACT GCAGATACTA GAGCTTTAAG 3330GAGGTTTGGA TTTTCTTTGG CTGCTGGCAG AAGTGTGTGG ACTCTTGAAA 3380TGGATGCTGG GGTTCTAACT GGGAGATTGA TTAGACTGAA TGATGAAAAA 3430TGGACAGAAA TGAAGGATGA CAAAATTGTT TCATTGATTG AAAAGTTTAC 3480AAGCAACAAA TATTGGTCCA AAGTGAATTT CCCACATGGG ATGTTGGATC 3530TTGAAGAAAT TGCTGCCAAT TCCAAAGATT TTCCTAACAT GTCTGAGACT 3580GATCTGTGTT TCTTGCTGCA TTGGTTAAAT CCAAAGAAAA TAAATTTAGC 3630AGATAGAATG CTTGGATTGT CTGGAGTTCA GGAAATTAAA GAACAAGGTG 3680TTGGATTAAT AGCAGAATGT AGAACTTTCT TAGATTCTAT TACTGGAGCT 3730TTAAAATCTA TGATGTTTGG ATTTCATCAA TCTGTGACTG TTGAAATTAT 3780AAATACTGTG CTTTGTTTTG TTAAGAGTGG AATTTTGCTT TATGTTATAC 3830AACAATTGAA TCAGGATGAA CACTCTCACA TAATTGGTTT GTTGAGAGTT 3880ATGAATTATG TAGATATTGG TTGTTCAGTT ATTTCATGTG GCAAAGTTTT 3930CTCCAAAATG CTGGAAACAG TCTTTAATTG GCAGATGGAC TCTAGAATGA 3980TGGAGTTGAG AACACAGAGT TTTTCCAACT GGTTAAGAGA TATCTGTTCA 4030GGGATCACTA TTTTTAAAAA CTTCAAGGAT GCAATTTATT GGTTCTATAC 4080AAAATTGAAG GATTTTTATG AAGTGAATTA TGGTAAGAAG AGGGATATTT 4130TAAATATCCT TAAAGACAAC CAACAAAAAA TAGAGAAAGC CATTGAGGAA 4180GCAGATAAAT TTTGCATTTT GCAAATCCAA GATGTGGAAA AATCTGAACA 4230GTATCAGAAA GGGGTTGACT TGATACAAAA ATTGAGGACT GTTCATTCAA 4280TGGCTCAGGT TGATCCTAAT CTGATGGTTC ATTTGTCACC TTTGAGAGAC 4330TGCATAGCAA GAGTTCATCA GAAGCTCAAA AACCTTGGAT CTATAAATCA 4380GGCAATGGTA ACAAGATGTG AGCCAGTTGT TTGCTATTTG TATGGCAAAA 4430GAGGAGGAGG AAAGAGTTTG ACGTCAATTG CATTGGCAAC TAAAATTTGT 4480AAACATTATG GTGTTGTACC TGAGAAGAAC ATCTATACTA AACCTGTGGC 4530TTCAGATTAT TGGGATGGGT ATAGTGGACA GTTAGTTTGC ATCATTGATG 4580ATATCGGTCA AAATACAACA GATGAGGATT GGTCAGACTT TTGTCAGTTG 4630GTGTCAGGAT GCCCAATGAG ATTAAATATG GCCTCTCTTG AAGAGAAGGG 4680TAGGCATTTT TCTTCTCCTT CATAATAGC AACTTCAAAT TGGTCAAATC 4730CAAGTCCAAA AACAGTTTAT GTTAAGGAAG CCATTGATCG TAGACTCCAT 4780TTTAAGGTTG AAGTTGAACC TGCTTCATTT TTTAAAAATC CTCACAATGA 4830TACGTTGAAT GTCAATTTAG CTAAAACAGG TGATGCAATC AAGGATATGT 4880CTTGTGTTGA TCTGATAATG GATGGACATA ATGTTTCATT GATGGACTTG 4930CTCAGTTCCC TAGTTATGAC AGTAGAAATC AGGAAACAAA ACATGACTGA 4980ATTTATGGAG TTGTGGTCTC AGCGAATTTC AGATGATGAT AGTGCAGTGG 5030CAGAGTTTTT CCAGTCTTTT CCATCTGGTG AACCATCGAA TTCCAAATTA 5080TCTGGCTTTT TCCAATCTGT TAGTAATCAC AAGTGGGTTG CTGTGGGAGC 5130TGCAGTTGGT ATTCTTGGAG TGCTCGTTGG GGGATGGTTT GTGTATAAGC 5180ATTTCACCCG AAAGGAGGAA GAGCCAATTC CAACTGAAGG GGTATATCAT 5230GGTGTAACTA AGCCTAAGCA AGTGATTAAA TTAGATGCAG ATCCAGCAGA 5280ATCTCAGTCA ACTTTGGAAA TAGCAGGACT GGTTAGGAAG AATTTGGTTC 5330AGTTTGGAGT TGGAGAGAAG AATGGATGTG TGAGATGGGT TACGAATGCC 5380TTAGGGGTGA AAGATGATTG GTTGCTTGTA CCTTCTCATG CTTACAAATT 5430TGAGAAAGGT TATGAAATGA TGGAGTTTTA TTTTAATAGA GGTGGAACTT 5480ACTACTCAAT TTCAGCTGGT AATGTTGTCA TTCAATCTTT GGATGTGGGA 5530TTTCAGGATG TTGTTCTGAT GAAGGTTCCT ACAATTCCTA AGTTTAGAGA 5580TATTACCCAA CATTTTGTTA AGAAGGGAGA TGTGCCTAGA GCTTTGAATC 5630GTCTGGCAAC ATTAGTGACA ACTGTGAATG GAACTCCTAT GTTAATTTCT 5680GAGGGCCCAT TAAAGATGGA AGAGAAAGCT TCTTATGTTC ATAAGAAAAA 5730TGATGGTACA ACAGTTGATT TAATTGTGGA CCAGGCATGG AGAGGAAAAG 5780GCGAGGGTCT CCTGGAATG TGTGGTGGGG CCTTGGTTTC ATCAAATCAG 5830TCTATACAGA ATGCAATTTT GGGTATTCAT GTTGCTGGAG GAAATTCAAT 5880TCTTGTTGCA AAATTGGTTA CTCAAGAAAT GTTCCAAAAT ATTGATAAGA 5930AAATTGAAAG TCAGAGAATC ATGAAAGTGG ATTTTACTCA GTGTTCAATG 5980AATGTAGTCT CCAAAACGCT TTTTAGAAAG AGTCCCATTC ATCATCACAT 6030TGATAAAACC ATGATTAATT TTCCTGCAGC TATGCCTTTT TCTAAAGCCG 6080AAATTGATCC AATGGCTATG ATGTTATCCA AGTATTCATT ACCCATTGTA 6130GAAGAGCCAG AAGATTATAA AGAAGCTTCA ATTTTTTATC AAAATAAAAT 6180AGTAGGCAAG ACTCAGCTAG CTGATGATTT TCTAGATCTT GATATGGCCA 6230TTACAGGGGC CCCAGGAATT GATGCTATTA ATATGGATTC ATCTCCTGGA 6280TTTCCTTATG TTCAAGAGAG GCTGACCAAA AGAGATTTAA TTTGGTTAGA 6330TGAGAATGGT TTATTGCTGG GAATTCATCC AAGATTGGCT CAGAGAATTT 6380TGTTCAATAC TGTCATGATG GAAAATTGTT CTGATTTGGA TGTTGTTTTT 6430ACTACTTGCC CAAAAGATGA ATTGAGACCA TTGGAGAAGG TGTTGGAATC 6480AAAAACAAGA GCTATTGATG CTTGTCCTCT GGATTACACA ATTTTGTGTC 6530GAATGTACTG GGGTCCAGCT ATTAGTTATT TTCATTTGAA TCCAGGGTTC 6580CATACAGGTG TTGCTATTGG CGTAGATCCT GACAAACAGT GGGATGAATT 6630ATTTAAAACA ATGATAAGAT TTGGAGATGT CGGTCTTGAT TTGGATTTTT 6680CTGCTTTTGA TGCTAGTCTT AGTCCATTTA TGATTAGGGA AGCAGGTAGT 6730ATTATGAGTG AATTATCTGG AACTCCATCC GATTTTGGAA CAGCTCTTAT 6780CAATACTATC ATTTATTCTA AGCATCTGCT GTACAACTGT TGTTATCATG 6830TTTATGGTTC AATGCCTTCT GGGTCTCCTT GCACAGCTTT GCTGAATTCA 6880ATTACCAATA ATGTCAATTT GTATTATGTG TTTTCCAAGA TATTTGGAAA 6930GTCTCCAGTT TTCTTTTGTC AGGCTTTGAA GATTCTCTGT TATGGAGATG 6980ATGTTCTTAT AGTTTTTTCC CGAGATGTTC AGATTGATAA TCTTGATTTG 7030ATTGGACAAA AAATTGTAGA TGAGTTTAAG AAACTTGGCA TGACAGCTAC 7080TTCTGCTGAC AAAAATGTAC CTCAGCTGAA GCCAGTTTCA GAATTGACTT 7130TTCTCAAGAG ATCTTTCAAT TTGGTAGAAG ATAGGATCAG ACCTGCAATT 7180TCGGAAAAAA CCATTTGGTC TTTGATAGCA TGGCAGAGAA GTAACGCTGA 7230GTTCGAGCAG AATTTGGAAA ATGCTCAGTG GTTTGCTTTT ATGCATGGTT 7280ATGGGTTTTA TCAGAAATTC TATTATTTTG TTCAGTCCTG TTTGGAGAAA 7330GAGATGATAG AATACAGACT TAAATCTTAT GATTGGTGGA GAATGAGATT 7380TTATGACCAG TGTTTCATTT GTGACCTTTC ATGATTTGTT TAAACGAATT 7430TTCTTAAAAT TTCTGAGGTT TGTTTATTTC TTTTTATCAG TAAATAAAAA 7480本發(fā)明涉及經(jīng)低溫細(xì)胞培養(yǎng)減毒的人HAV H2K25株。該減毒株是HAV Gkm株在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17中，經(jīng)35℃培育15代，32℃培育5代，35℃培育5代后獲得的病毒株。
本發(fā)明還涉及HAV H2K25的cDNA序列，特別是HAV基因組5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)的cDNA序列。該組核苷酸序列分別作為SEQ NO.7、SEQ NO.8和SEQNO.9示于下面。sEQ NO.7(HAV H2K25 5’NCR區(qū)，101bp-200bp)5’TTCCCTTTCC CCTTCCCCTT CCTTGTTTTG ATTGTAAATATAAATTCCTG CAGGTTCAGG GTTCTTTAAA TTGGCATTGAATTTGTTTCT CTATAAGAAC 3’SEQ NO.8(HAV H2K25 2A區(qū)，3011bp-3110bp)5’TATGTTATCC ACTGAATCAA TGATGAGCAG AATTGCGGCTGGAGACTTGG AGTCATCAGT GGATGATCCT AGATCAGAGGAGGATAAAAG ATTTGAGAGT 3’SEQ NO.9(HAV H2K25 2C區(qū)，3986bp-4085bp)5’CACAGAGTTT TTCCAACTGG TTAAGAGATA TCTGTTCAGGGATCACTATT TTTAAAAACT TCAAGGATGC AATTTATTGGCTCTATACAA AATTGAAGGA本發(fā)明涉及經(jīng)低溫細(xì)胞培養(yǎng)減毒的人HAV H2M20K5株。該減毒株是HAVGkm株在原代猴腎細(xì)胞中，經(jīng)35℃培育15代，32℃培育5代，再在KMB17細(xì)胞于32℃培育5代后獲得的病毒株。
本發(fā)明還涉及HAV H2M20K5的cDNA序列，特別是HAV基因組5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)的cDNA序列。該組核苷酸序列分別作為SEQ NO.10、SEONO.11和SEQ NO.12示于下面。sEQ NO.10(HAV H2M20K5 5’NCR區(qū)，101bp-200bp)5’TTCCCTTTCC CCTTCCCCTT CCTTGTTTTG ATTGTAAATATAAATTCCTG CAGGTTCAGG GTTCTTTAAA TTGGCATTGAATTTGTTTCT CTATAAGAAC3’SEQ NO.11(HAV H2M20K5 2A區(qū)，3011bp-3110bp)5’TATGTTATCC ACTGAATCAA TGATGAGCAG AATTGCGGCTGGAGACTTGG AGTCATCAGT GGATGATCCT AGATCAGAGGAGGATAAAAG ATTTGAGAGT 3’SEQ NO.12(HAV H2M20K5 2C區(qū)，3986bp-4085bp)5’CTCAGAGTTT TTCCAACTGG TTAAGAGATA TCTGTTCAGGGATCACTATT TTTAAAAACT TCAAGGATGC AATTTATTGGCTCTATACAA AATTGAAGGA3’本發(fā)明還涉及上述所有cDNA核苷酸序列的變異體，因?yàn)橐陨辖o出的DNA序列僅代表了本發(fā)明的優(yōu)選例子。由于遺傳密碼的簡并性，所以可以制備許多核苷酸，它們都是能夠指導(dǎo)合成該病毒蛋白質(zhì)或其類似物的DNA序列。因此，功能上與上述序列等價(jià)的DNA序列都被包括在本發(fā)明之內(nèi)。
本發(fā)明還涉及基于上述所有cDNA序列，設(shè)計(jì)引物而選擇性擴(kuò)增甲型肝炎基因片段，從而在甲型肝炎病毒的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)、毒性檢測(cè)和細(xì)胞適應(yīng)性檢測(cè)及生物樣品檢測(cè)中應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及基于上述所有cDNA序列，應(yīng)用基因工程技術(shù)制造的任何甲肝病毒減毒株。
本發(fā)明還涉及基于上述所有cDNA序列，應(yīng)用基因工程技術(shù)制造的任何甲肝病毒多肽疫苗。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1甲型肝炎病毒Gkm株的分離及其cDNA序列采集杭州近郊甲肝急性期病人糞便標(biāo)本，用PBS(pH7.0)制成20％(V/V)懸浮液，以F113～PEG沉淀及差速離心進(jìn)行抽提，抽提物經(jīng)超速離心沉淀，以免疫電鏡檢測(cè)觀察到含27nm大小的甲肝病毒顆粒，此即為初步純化的HAVGkm株。
HAV Gkm株病毒經(jīng)胍鹽/熱酚法提取病毒核糖核酸(RNA)，用cDNA合成藥盒配合高保真多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，以及分子克隆技術(shù)，獲得HAV Gkm株的cDNA基因文庫，最后用DNA序列分析藥盒，用雙脫氧末端終止法對(duì)已有的cDNA克隆進(jìn)行序列分析，再通過拼接，從而獲得HAV Gkm株的cDNA序列。該序列以GkmNO.1示于文中。
實(shí)施例2甲型肝炎病毒H2K5株的分離及其部分cDNA序列HAV Gkm株毒種接種人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17單層細(xì)胞，35℃吸附2小時(shí)，用新生牛血清的Eagles及乳蛋白維持液，置35℃培養(yǎng)，每周換維持液一次，至第6周，去原維持液，用胰蛋白-EDTA液消化，收集細(xì)胞，用凍融、超聲處理抽提HAV，再以該HAV為毒種進(jìn)行下一輪傳代。以上述方法在KMB17細(xì)胞中連續(xù)傳5代，每代用直接免疫熒光或ELISA監(jiān)視病毒的增殖，從而獲得HAVH2K5株。
參考HAV Gkm株cDNA序列，合成位于HAV5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)的3對(duì)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)引物，引物的序列如下，從SEQ PrimetNO.1一直到SEQ Primet NO.6。1.SEQ Primer NO.1(HAV5’NCR forward)5’GGACTTGATACCTCACCG 3’2.SEQ Primer NO.2(HAV5’NCR reverse)5’CTAATCATGGAGTTGACC 3’3.SEQ Primer NO.3(HAV 2A forward)5’GTCACAGAGCAATCAGAGT 3’4.SEQ Primer NO.4(HAV 2A reverse)5’AGCTTGTGAAAATAGTCC 3’5.SEQ Primer NO.5(HAV 2C forward)5’CCAGAATGATGGAGCTG 3’6.SEQ Primer NO.6(HAV 2C reverse)5’GGGTCAACTTGAGCCATT 3’HAV H2K5株病毒經(jīng)胍鹽/熱酚法提取病毒RNA，利用上述3對(duì)引物，用cDNA合成藥盒配合高保真PCR技術(shù)，獲得HAV H2K5株5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)基因片段，用DNA序列分析試劑盒對(duì)純化的PCR片段進(jìn)行直接測(cè)序，獲得HAV H2K5株5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)的部分cDNA序列，序列分別示于文中，為SEQNO.1、SEQNO.2和SEQNO.3。
實(shí)施例3甲型肝炎病毒H2K20株的分離及其部分cDNA序列HAV Gkm株毒種接種人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17單層細(xì)胞，35℃吸附2小時(shí)，用新生牛血清的Eagles及乳蛋白維持液，置35℃培養(yǎng)，每周換維持液一次，至第6周，去原維持液，用胰蛋白-EDTA液消化，收集細(xì)胞，用凍融、超聲處理抽提HAV，再以該HAV為毒種進(jìn)行下一輪傳代。以上述方法在KMB17細(xì)胞中連續(xù)傳代，其中35℃?zhèn)?5代，32℃?zhèn)?代，每代用直接免疫熒光或ELISA監(jiān)視病毒的增殖，從而獲得HAV H2K20株。
參考HAV Gkm株cDNA序列，合成位于HAV5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)的3對(duì)RT-PCR引物，引物的序列見附錄，從SEQ Primer NO.1一直到SEQPrimer NO.6。HAV H2K5株病毒經(jīng)胍鹽/熱酚法提取病毒RNA，利用上述3對(duì)引物，用cDNA合成藥盒配合高保真PCR技術(shù)，獲得HAV H2K20株5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)基因片段，用DNA序列分析試劑盒對(duì)純化的PCR片段進(jìn)行直接測(cè)序，獲得HAV H2K20株5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)的部分cDNA序列，序列分別示于文中，為SEQ NO.4、SEQ NO.5和SEQ NO.6。
實(shí)施例4甲型肝炎病毒H2K25減毒株的分離及其部分cDNA序列HAV Gkm株毒種接種人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17單層細(xì)胞，35℃吸附2小時(shí)，用新生牛血清的Eagles及乳蛋白維持液，置35℃培養(yǎng)，每周換維持液一次，至第6周，去原維持液，用胰蛋白-EDTA液消化，收集細(xì)胞，用凍融、超聲處理抽提HAV，再以該HAV為毒種進(jìn)行下一輪傳代。以上述方法在KMB17細(xì)胞中連續(xù)傳代，其中35℃?zhèn)?5代，32℃?zhèn)?代，35℃再傳5代。每代用直接免疫熒光或ELISA監(jiān)視病毒的增殖，從而獲得HAV H2K25減毒株。
參考HAV Gkm株cDNA序列，合成位于HAV5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)的3對(duì)RT-PCR引物，引物的序列見附錄，從SEQ Primer NO.1一直到SEQPrimer NO.6。HAV H2K5株病毒經(jīng)胍鹽/熱酚法提取病毒RNA，利用上述3對(duì)引物，用cDNA合成藥盒配合高保真PCR技術(shù)，獲得HAV H2K25株5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)基因片段，用DNA序列分析試劑盒對(duì)純化的PCR片段進(jìn)行直接測(cè)序，獲得HAV H2K25株5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)的部分cDNA序列，序列分別示于文中，為SEQ NO.4、SEQ NO.5和SEQ NO.6。
實(shí)施例5甲型肝炎病毒H2M20K5減毒株的分離及其部分cDNA序列HAV Gkm株毒種接種單層細(xì)胞，35℃吸附2小時(shí)，用新生牛血清的Eagles及乳蛋白維持液，置35℃培養(yǎng)，每周換維持液一次，至第6周，去原維持液，用胰蛋白-EDTA液消化，收集細(xì)胞，用凍融、超聲處理抽提HAV，再以該HAV為毒種進(jìn)行下一輪傳代。以上述方法在原代猴腎細(xì)胞中連續(xù)傳20代，其中35℃?zhèn)?5代，32℃?zhèn)?代，然后在KMB17細(xì)胞中，32℃再傳5代。每代用直接免疫熒光或ELISA監(jiān)視病毒的增殖，從而獲得HAV H2M20K5減毒株。
參考HAV Gkm株cDNA序列，合成位于HAV5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)的3對(duì)RT-PCR引物，引物的序列見附錄，從SEQ Primer NO.1一直到SEQPrimer NO.6。HAV H2M20K5株病毒經(jīng)胍鹽/熱酚法提取病毒RNA，利用上述3對(duì)引物，用cDNA合成藥盒配合高保真PCR技術(shù)，獲得HAV H2K25株5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)基因片段，用DNA序列分析試劑盒對(duì)純化的PCR片段進(jìn)行直接測(cè)序，獲得HAV H2K25株5’NCR區(qū)、2A區(qū)和2C區(qū)的部分cDNA序列，序列分別示于文中，為SEQ NO.4、SEQ NO.5和SEQ NO.6。
與原來的強(qiáng)毒株Gkm株相比，H2M20K5減毒株對(duì)人和猴科動(dòng)物呈弱毒株反應(yīng)，是甲型肝炎減毒活疫苗(H2)的毒種。
權(quán)利要求
1.一種分離的和純化的病毒，其特征在于，它是甲型肝炎病毒(HAV)中國流行株Gkm。
2.一種HAV Gkm株的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)序列，其特征在于，該cDNA具有如HAV GkmNO.1的cDNA序列。
3.一種經(jīng)細(xì)胞傳代的HAV病毒株H2K5，其特征在于，它是HAV Gkm株經(jīng)人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17低溫傳代五次后獲得的病毒株。
4.一種HAV H2K5株的cDNA序列，其特征在于，該cDNA具有如SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3的三段cDNA序列。
5.一種經(jīng)細(xì)胞傳代的HAV病毒株H2K20，其特征在于，它是HAV Gkm株經(jīng)人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17低溫傳代20次后獲得的病毒株。
6.一種HAV H2K20株的cDNA序列，其特征在于，該cDNA具有如HAV H2K20NO.1的cDNA序列。
7.一種經(jīng)細(xì)胞傳代的HAV病毒株H2K25，其特征在于，它是HAV Gkm株經(jīng)人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17低溫傳代25次后獲得的減毒病毒株。
8.一種HAV H2K25株的cDNA序列，其特征在于，該cDNA具有如SEQ NO.7、SEQ NO.8和SEQ NO.9的三段cDNA序列。
9.一種經(jīng)細(xì)胞傳代的HAV病毒株H2M20K5，其特征在于，它是HAV Gkm株在原代猴腎細(xì)胞中低溫傳代20次，人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17低溫傳代5次后獲得的減毒病毒株，是HAV減毒活疫苗(H2)的種子毒株。
10.一種HAV H2M20K5株的cDNA序列，其特征在于，該cDNA具有如SEQNO.10、SEQ NO.11和SEQ NO.12的三段cDNA序列。
11.如權(quán)利要求8和10所示的cDNA序列，其特征在于，該序列為HAV減毒株所必須的序列。
12.如權(quán)利要求2、4、6、8、10所示的cDNA序列，其特征在于，該系列核苷酸序列可用于HAV減毒株的培育和制備。
13.一種鑒別甲肝病毒減毒株的方法，其特征在于，減毒株經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)后，可獲得如權(quán)利要求8和10所示的cDNA序列或其變異體。
14.一種檢測(cè)甲肝病毒減毒株遺傳穩(wěn)定性的方法，其特征在于，減毒株經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)后，可獲得如權(quán)利要求8和10所示的cDNA序列或其變異體。
15.一種培育甲肝病毒減毒株的方法，其特征在于，HAV經(jīng)特定細(xì)胞，特定溫度下，連續(xù)傳代20-25代，從而獲得減毒株。
全文摘要
本發(fā)明涉及甲型肝炎病毒中國株和減毒株的分離培育及其互補(bǔ)脫氧核糖核酸序列,特別是甲型肝炎病毒中國流行株Gkm的分離純化,系列減毒株的培育,及其獨(dú)特的cDNA序列。該系列cDNA序列可為進(jìn)一步了解甲肝病毒毒株的遺傳特性和遺傳穩(wěn)定性,闡明HAV減毒的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)資料,為研制快速生長、高滴度、高抗原性的新型甲肝疫苗創(chuàng)造條件,為基因工程多肽疫苗的研制提供科學(xué)依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1337463SQ01140508
公開日2002年2月27日 申請(qǐng)日期2001年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月13日
發(fā)明者毛江森, 陳勇, 柴少愛, 唐彩華, 莊昉成, 陳念良, 黃海鷹, 錢汶, 洪艷, 忻亞娟, 毛子安, 謝汝瑛 申請(qǐng)人:浙江普康生物技術(shù)股份有限公司