艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS、其編碼蛋白質(zhì)以及基因克隆方法
【專利摘要】艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS、其編碼蛋白質(zhì)以及基因克隆方法。本發(fā)明涉及一種艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1；一種艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2；同時(shí)本發(fā)明還涉及RT-PCR和RACE技術(shù)相結(jié)合來(lái)用于克隆艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS基因全長(zhǎng)的方法。艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS的大量表達(dá)，有助于提高艾納香的生物學(xué)產(chǎn)量，并同時(shí)提高植株有效成分內(nèi)根-貝殼杉烯類化合物的含量，從而同時(shí)提高艾納香的產(chǎn)量和品質(zhì)。
【專利說(shuō)明】艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS、其編碼蛋白質(zhì)以及基因克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因及其克隆方法，同時(shí)也涉及到基因編碼蛋白質(zhì)，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS、其編碼蛋白質(zhì)以及基因克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002]艾納香(Blumea balsamifera L.DC.)為菊科艾納香屬多年生木質(zhì)草本植物,主要分布于我國(guó)海南、貴州、廣西、廣東、云南、臺(tái)灣等省。以其全草或地上部分入藥，具有鎮(zhèn)痛、發(fā)汗、祛風(fēng)除濕、去痰止咳、通經(jīng)止血等功效，在黎族、苗族、壯族等少數(shù)民族地區(qū)有著悠久的用藥歷史，是一種重要的民間藥物。同時(shí)艾納香也是獲取天然冰片(艾片)的重要植物來(lái)源之一。并且，在精制艾片過(guò)程中所產(chǎn)生的艾油具有擴(kuò)張血管、降低血壓、抑制交感神經(jīng)的作用，因而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。另外，艾油因其獨(dú)特的芳香氣味，還被廣泛應(yīng)用于香料以及化妝品行業(yè)。雖然以艾納香為原材料的產(chǎn)品眾多，然而關(guān)于其化學(xué)成分的研究較少。
[0003]對(duì)于艾納香而言，其化學(xué)成分比較復(fù)雜，但具有藥理作用的主要集中在黃酮類和揮發(fā)油成分上。鄧芹英等(1996)，曹家慶等(2008)，陳銘等(2009)分別對(duì)艾納香中黃酮類成分進(jìn)行了分析，主要含有艾納香素、木犀草素、槲皮素、兒茶素以及阿亞黃素等。關(guān)于艾納香揮發(fā)油成分的研究:周欣等(2001)、馬芝玉等(2009)采用GC/MS方法檢測(cè)到艾納香中揮發(fā)油成分主要為:L_龍腦、樟腦、β -石竹烯、芳樟醇、大葉香烯D、香木蘭烯、順-α-沒(méi)藥烯、β_蓽澄茄油烯、Y-依蘭油烯、ent-貝殼杉烯等萜類化合物。除此之外，艾納香中還含有多其他種化合物，如小麥黃素、芹菜素、原兒茶酸(甲酯)、咖啡酸(甲酯)、香草酸等化合物。其中，ent-貝殼杉烯類二萜化合物具有廣泛的生理活性，主要表現(xiàn)為抗腫瘤活性。由于ent-貝殼杉烯類化合物主`要來(lái)自于天然產(chǎn)物，化合物供應(yīng)量非常有限。
[0004]內(nèi)根-貝殼杉烯合酶(KS)是貝殼杉烯類化合物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，也是合成赤霉素等信號(hào)分子的關(guān)鍵酶，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。目前在研究植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗性中涉及較多研究，而從植物次生代謝及產(chǎn)物藥理藥效活性方面研究較少。KS過(guò)去被稱為內(nèi)根-貝殼杉烯合酶B，位于前質(zhì)體，具有引導(dǎo)序列，與古巴焦磷酸合酶(Copalyl pyrophosphate synthase, CPS)共同催化物牛兒基物牛兒基焦磷酸(GGPP)形成內(nèi)根-貝殼杉烯(ent-kaureneXKS最早是從南瓜未成熟的種子中得到的，其突變嚴(yán)重影響植株的發(fā)育。擬南芥中的GA2蛋白編碼KS基因，在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，ga2矮化突變體是由KS基因的功能缺失造成的，對(duì)突變體ga2-l的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其cDNA中單堿基發(fā)生突變導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)，從而使得KS基因失活。目前，KS基因在擬南芥、蓖麻、甜葉菊、梨、蘋(píng)果等植物上成功克隆，但目前還沒(méi)有關(guān)于艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶(KS)基因的相關(guān)報(bào)道。因此，對(duì)艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因的克隆以及對(duì)他們的生物學(xué)功能研究，將有助于明確艾納香中二萜類次生代謝的分子機(jī)理，為調(diào)控其艾納香中有效成分等奠定基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種首次從艾納香種獲得的內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶編碼的氨基酸序列及編碼蛋白質(zhì)性質(zhì)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。
[0007]同時(shí)，本發(fā)明還提供該艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因的克隆方法。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供:
[0009]本發(fā)明所提供的艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因,從艾納香(Blumea balsamiferaDC)中克隆，命名為Bb-KS基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
[0010]上述艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因編碼的蛋白質(zhì)，命名為Bb-KS蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2。
[0011]一種艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS的克隆方法，包括如下步驟:
[0012](I)選用艾納香葉片作為試驗(yàn)材料，采用TRNzol法提取總RNA ；
[0013](2)米用 TaKaRa 公司生產(chǎn)的 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;
[0014](3)根據(jù)NCBI上其他植物KS基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)兼并引物PFl =TGGTCR(A\G)TTTGATCR(A\G)TATK(T\G)CAATC和
`[0015]PRl:TC K(T\G)CC ff(A\T)CCA CM(C\A)R(A\G)TTGAT GCAT GT ；
[0016](4) PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-T easy Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，篩選的陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證后測(cè)序，獲得Bb-KS基因片段；
[0017](5)根據(jù)上述片段設(shè)計(jì)3’和5’末端快速擴(kuò)增(RACE)引物；Bb_KS基因5’ RACE引物:GCAGCCAATGGATCTGATGATAC ;Bb_KS 基因 3’ RACE 引物:CGCAGCAACA GCAGCTGCTCTT ；
[0018](6)采用SMART? RACE Kit提供的反轉(zhuǎn)錄引物合成RACE第一鏈cDNA ；
[0019](7) 5，_&3，-RACE PCR 反應(yīng)體系:TaKaRa Ex Taq(5U/μ 1)0.4 μ I, IOx Ex TaqBuffer(Mg2+plus)5 μ I, dNTP Mixture (各 2.5mmol/L)4 μ I, 3，-RACE-Ready cDNAlμ 1，GSP (10 μ mol/L) I μ 1，UPM(IOx) 5 μ 1，ddH20 補(bǔ)充至 50 μ I ；
[0020](8) PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)、回收、亞克隆和測(cè)序，獲得Bb-KS基因3’和5’末端序列，并進(jìn)行拼接；
[0021](9)根據(jù)上述拼接序列，于Bb-KS基因開(kāi)放閱讀框(ORF)兩端設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增引物:
[0022]Bb-KS5 ’端引物:CTCTGGTCATTTCTGAGCCAAGT
[0023]Bb-KS3 ’端引物:TTACCTTGTAATACATTAAAAAAT
[0024](IO)Bb-KS基因全長(zhǎng)序列的克隆，其反應(yīng)體系為:PCR反應(yīng)總體積為50μ 1，1.5mmol/L MgCl2,4 種 dNTP 各 200ymol/L，引物各 150ng，1.5U Taq plus DNApolymerase (高保真)，IOOng cDNA。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
[0026]本發(fā)明涉及一種艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS與編碼的蛋白質(zhì)及其克隆方法。本發(fā)明采用RT-PCR與RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)艾納香種Bb-KS基因進(jìn)行了研究，首次從艾納香葉片中克隆得到Bb-KS基因全長(zhǎng)序列，并對(duì)其所編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究艾納香Bb-KS基因的表達(dá)、調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，為Bb-KS基因參與植物的赤霉素調(diào)控途徑及艾納香揮發(fā)油組成及調(diào)控機(jī)制研究提供參考，同時(shí)也為菊科植物Bb-KS基因功能和進(jìn)化研究提供了新的背景資料。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下通過(guò)【具體實(shí)施方式】的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0028]實(shí)施例1
[0029]本發(fā)明所提供的艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因,從艾納香(Blumea balsamiferaDC)中克隆，命名為Bb-KS基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
[0030]上述艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因編碼的蛋白質(zhì)，命名為Bb-KS蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2。
[0031]上述艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS的克隆方及引物組，包括如下步驟:
[0032]步驟1:選用艾納香(Blumea balsamifera DC)葉片作為試驗(yàn)材料,采用TRNzol法提取總RNA ；
[0033]步驟2:米用 TaKaRa公司生產(chǎn)的 PrimeScriptTMlst Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;
[0034]步驟3:根據(jù)NCBI上其他植物KS基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)兼并引物PFl
【權(quán)利要求】
1.一種從艾納香種獲得的內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
2.一種由權(quán)利要求1所述艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.—種權(quán)利要求1所述艾納香內(nèi)根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS的克隆方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)選用艾納香葉片作為試驗(yàn)材料，采用TRNzol法提取總RNA； (2)米用TaKaRa 公司生產(chǎn)的 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA; (3)根據(jù)NCBI上其他植物KS基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)兼并引物
PFl =TGGTCR(A\G)TTTGATCR(A\G)TATK(T\G)CAATC 和
PRl:TC K (T\G) CC ff(A\T) CCA CM (C\A) R (A\G) TTGAT GCAT GT; (4)PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-Teasy Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，篩選的陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證后測(cè)序，獲得Bb-KS基因片段； (5)根據(jù)上述片段設(shè)計(jì)3，和5，末端快速擴(kuò)增(RACE)引物；Bb-KS基因5，RACE引物:GCAGCCAATGGATCTGATGATAC ;Bb-KS 基因 3’ RACE 引物:CGCAGCAACA GCAGCTGCTCTT ； (6)采用SMART?RACE K`it提供的反轉(zhuǎn)錄引物合成RACE第一鏈cDNA ； (7)5，_&3，-RACE PCR 反應(yīng)體系:TaKaRa Ex Taq(5U/μ 1)0.4 μ I, IOx Ex TaqBuffer(Mg2+plus)5 μ I, dNTP Mixture (各 2.5mmol/L)4 μ I,3，-RACE-Ready cDNAlμ I,GSP(10ymol/L)ly 1，UPM(IOx) 5 μ 1，ddH20 補(bǔ)充至 50 μ I ； (8)PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)、回收、亞克隆和測(cè)序，獲得Bb-KS基因3’和5’末端序列，并進(jìn)行拼接； (9)根據(jù)上述拼接序列，于Bb-KS基因開(kāi)放閱讀框(ORF)兩端設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增引物: Bb-KS5’ 端引物:CTCTGGTCATTTCTGAGCCAAGT Bb-KS3’ 端引物:TTACCTTGTAATACATTAAAAAAT (10)Bb-KS基因全長(zhǎng)序列的克隆，其反應(yīng)體系為:PCR反應(yīng)總體積為50μ 1，1.5mmol/LMgCl2,4 種 dNTP 各 200 μ mol/L,引物各 150ng, 1.5U Taq plus DNA polymerase (高保真)，IOOng cDNA。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103525848SQ201310456535
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】官玲亮, 龐玉新, 胡雄飛, 吳麗芬, 于福來(lái), 張影波, 王丹, 韋睿斌, 陳振夏 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所, 龐玉新