桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及桿狀病毒HearNPV?LEF-9蛋白抗體的制備。通過設計引物克隆lef-9基因；原核表達構建重組質粒pET-28a-lef-9；將構建的重組質粒pET-28a-lef-9轉化大腸桿菌BL21，構建表達LEF-9蛋白的重組菌株；對LEF-9蛋白進行誘導表達及純化。通過本發(fā)明的方法，實現(xiàn)了原核表達桿狀病毒HearNPV?LEF-9蛋白，可以用于后期制備其多克隆抗體，為進一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基礎。為人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解，為進一步利用其構建高效的體外轉錄系統(tǒng)奠定了基礎。
【專利說明】桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白的制備
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白的制備方法，特別涉及桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白的制備方法。
【背景技術】
[0002]桿狀病毒是昆蟲的特異性病原體，是已知昆蟲病毒中最大的類群，也是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多且具有非常重要實用價值的昆蟲病毒，桿狀病毒作為高效的真核基因表達載體系統(tǒng)、有效的病毒殺蟲劑和潛在的基因治療載體系統(tǒng)受到學術界的廣泛關注。
[0003]桿狀病毒基因組編碼多種基因，根據(jù)基因表達的時序性，桿狀病毒的基因分為早期基因和晚期基因兩大類。因為目前大多數(shù)證據(jù)表明，病毒基因的時序表達是通過時序之前的一組病毒基因的表達產(chǎn)物，直接或間接地反式激活其時序之后的一組病毒基因的轉錄，因而調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉錄水平上。因此作為轉錄病毒晚期基因的病毒RNA聚合酶就成為調(diào)節(jié)病毒早晚期基因轉錄表達的關鍵因素。
[0004]桿狀病毒RNA聚合酶由病毒誘導及編碼，當病毒基因組開始復制后，早期基因停止轉錄，病毒RNA聚合酶特異性識別含有保守序列TAAG的晚期基因啟動子并開始晚期基因的轉錄。研究表明病毒RNA聚合酶僅由病毒編碼的4個保守基因lef-4、lef_8、lef-9和P47組成，這四種蛋白構成的復合體可以在體外轉錄病毒晚期基因。雖然早在上世紀80年代科學家便發(fā)現(xiàn)了該酶的存在，但迄今為止我們對它的了解還非常有限?，F(xiàn)已知在其四個基本組成成分中P47定位在細胞核內(nèi)，是晚期基因轉錄的必需基因，LEF-4起mRNA加帽及錨定啟動子的作用，LEF-8與聚合酶特異性識別晚期啟動子有關，且推測與LEF-9共同構成了 RNA聚合酶的催化位點。
[0005]LEF-9是病毒RNA聚合酶中第二大蛋白，如果能夠解析HearNPV LEF-9亞基在病毒RNA聚合酶中的功能，將使人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解，為進一步利用其構建聞效的真核基因表達載體系統(tǒng)、制備有效的病毒殺蟲劑和開發(fā)基因治療載體系統(tǒng)奠定基礎。為了研究該蛋白，制備其多克隆抗體是一個必須的前期基礎，而制備多克隆抗體的前提是要大量獲得該蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是原核表達桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白，用于后期制備其多克隆抗體，以便對LEF-9蛋白的功能特性進行研究，使人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解。
[0007]本發(fā)明采用的技術方案是:桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白的制備，步驟如下:
I)lef-9 基因的克隆:設計引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3，和 28a55R:5，-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3>,以 HearNPV 基因組 DNA 為模版擴增lef-9完整閱讀框，PCR反應條件為:94°C預變性5min ；94°C 30s, 59°C 30s, 68°C30s為一個循環(huán)，進行30個循環(huán)；最后68°C延伸7min，得到lef-9基因PCR產(chǎn)物；2)原核表達載體的構建:用凝膠回收試劑盒回收基因PCR產(chǎn)物，用"i/7dIII和Bamm雙酶切，同時用相同兩酶雙酶切原核表達載體pET-28a，將酶切片段和載體通過T4DNA連接酶連接，構建重組質粒pET-28a-lef-9 ；
3)重組表達菌株的構建:將構建的重組質粒pET-28a-lef-9轉化大腸桿菌BL21，構建表達LEF-9蛋白的重組菌株；
4)LEF-9蛋白的誘導表達及純化:將pET-28a-lef-9陽性單菌落接種于5mLKana抗性LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)物按1%體積接種于2管250mL新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)3h至OD6tltlnm為0.6后，加IPTG至終濃度為0.4mmol/L,培養(yǎng)5h，離心收集菌體；
5)LEF-9蛋白的純化:將步驟4中收集的菌體重懸于5ml裂解緩沖液中，_70°C反復凍融3次，超聲波破碎，條件為功率200-300 W，超聲3s停5s，總計20min，至菌懸液變澄清后12000 r/min離心15 min，重復3次，去除不溶性細胞碎片，獲得含有LEF-9蛋白的上清液，將該上清液通過Ni2+親和柱，再用5倍柱體積的250 mM咪唑濃度洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫下來的蛋白并測A280，當有蛋白峰時開始收集樣品，直至A280又恢復至基準線。收集的蛋白通過SDS-PAGE進行檢測。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:通過本發(fā)明的方法，實現(xiàn)了原核表達桿狀病毒HearNPVLEF-9蛋白，可以用于后期制備其多克隆抗體，為進一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基礎。為人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解，為進一步利用其構建高效的體外轉錄系統(tǒng)奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是重組質粒pET-28a-lef-9的構建圖。
[0010]圖2A是lef-9基因擴增結果的SDS-PAGE電泳圖。
[0011]其中，M:分子標準；1 'lef-9基因擴增片段。
[0012]圖2B 是 pET-28a-lef_9 鑒定的 SDS-PAGE 電泳圖。
[0013]其中，M:分子標準；1:pET-28a-lef-9酶切結果。
[0014]圖3是純化LEF-9蛋白檢測圖。圖中，M:分子標準；I:純化的LEF-9蛋白?！揪唧w實施方式】
[0015]實施例1 桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白的制備 具體操作方法如下:
1.lef-9基因的克隆
設計引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3，(下劃線表示位點)和 28a55R: 5，-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3，(下劃線表不/ZifldIII 位點)，以HearNPV基因組DNA為模版擴增lef-9完整閱讀框，PCR反應條件為:94°C預變性5min ；94°C 30s, 59°C 30s, 68°C 30s為一個循環(huán)，進行30個循環(huán)；最后68°C延伸7min，得lef-9基因PCR產(chǎn)物。反應產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示獲得1578bp片段(圖2A)。
[0016]2.原核表達表達載體的構建用凝膠回收試劑盒回收純化lef-9基因PCR產(chǎn)物，用#i/7dIII和雙酶切，同時用相同兩酶雙酶切原核表達載體pET-28a，將酶切片段和載體通過T4 DNA連接酶連接構建重組質粒pET-28a-lef_9 (圖1 )，轉化大腸桿菌DH5 α，卡那霉素抗性篩選陽性菌株，提取質粒，酶切鑒定陽性克隆子(圖2Β)，經(jīng)上海生工測序，基因序列結果為序列表SEQ ID N0.1所示，測序鑒定克隆子無突變。
[0017]3.重組表達菌株的構建
將構建成功的重組質粒pET-28a-lef-9轉化大腸桿菌BL21，構建表達LEF-9蛋白的重組菌株。
[0018]4.LEF-9蛋白的誘導表達
將pET-28a-lef-9陽性單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基(Kana 50ug/mL)中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)物按1%體積接種于2管250mL新鮮LB培養(yǎng)基(Kana 50ug/mL)中，37°C振蕩培養(yǎng)3h至OD6tltlnm為0.6后，加IPTG至終濃度為0.4mmol/L,培養(yǎng)5h，離心收集菌體。
[0019]5.LEF-9蛋白的純化
將步驟4中收集的菌體重懸于5ml裂解緩沖液中，_70°C反復凍融3次，超聲波破碎，條件為功率200-300 W，超聲3s停5s，總計20min，至菌懸液變澄清后12000 r/min離心15min,重復3次，去除不溶性細 胞碎片，獲得含有LEF-9蛋白的上清液，將該上清液通過Ni2+親和柱，再用5倍柱體積的250 mM咪唑濃度洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫下來的蛋白并測A280,當有蛋白峰時開始收集樣品，直至A280又恢復至基準線。收集的蛋白通過SDS-PAGE進行檢測。結果如圖3所示，圖中顯示獲得的桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白的分子量為63kDa，結果顯示回收蛋白大小符合預測大小。該回收蛋白即為LEF-9蛋白。
[0020]制備的LEF-9蛋白可以用于后期制備其多克隆抗體，為進一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基礎。
【權利要求】
1.桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白的制備，其特征在于步驟如下:
1)lef-9 基因的克隆:設計引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3，和 28a55R:5，-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3>,以 HearNPV 基因組 DNA 為模版擴增lef-9完整閱讀框，PCR反應條件為:94°C預變性5min ；94°C 30s, 59°C 30s, 68°C30s為一個循環(huán)，進行30個循環(huán)；最后68°C延伸7min，得到lef-9基因PCR產(chǎn)物； 2)原核表達載體的構建:用凝膠回收試劑盒回收基因PCR產(chǎn)物，用"i/7dIII和Bamm雙酶切，同時用相同兩酶雙酶切原核表達載體pET-28a，將酶切片段和載體通過T4DNA連接酶連接，構建重組質粒pET-28a-lef-9 ； 3)重組表達菌株的構建:將構建的重組質粒pET-28a-lef-9轉化大腸桿菌BL21，構建表達LEF-9蛋白的重組菌株； 4)LEF-9蛋白的誘導表達:將pET-28a-lef-9陽性單菌落接種于5mL Kana抗性LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)物按1%體積接種于2管250mL新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)3h至OD6tltol為0.6后，加IPTG至終濃度為0.4mmol/L，培養(yǎng)5h，離心收集菌體； 5)LEF-9蛋白的純化:將步驟4中收集的菌體重懸于5ml裂解緩沖液中，_70°C反復凍融3次，超聲波破碎，條件為功率200-300 W，超聲3s停5s，總計20min，至菌懸液變澄清后，12000 r/min離心15 min，重復3次，去除不溶性細胞碎片，獲得含有LEF-9蛋白的上清液，將該上清液通過Ni2+親和柱，再用5倍柱體積的250 mM咪唑濃度洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫下來的蛋白并測A280， 當有蛋白峰時開始收集樣品，直至A280又恢復至基準線。
【文檔編號】C12N9/12GK103468657SQ201310401148
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權日:2013年9月5日
【發(fā)明者】鄭方亮, 朱春玉, 佘曉雙 申請人:遼寧大學