一種制備固定化頭孢菌素c?；傅姆椒?br> 【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備固定化頭孢菌素C?；傅姆椒?，包括：以戊二醛作為交聯(lián)劑將頭孢菌素C酰化酶固定在氨基載體上,然后用含氨基的大分子進行后修飾。本發(fā)明的方法能夠獲得具有較高穩(wěn)定性的固定化頭孢菌素C?；?。本發(fā)明提供的制備方法簡單，工藝穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低。
【專利說明】一種制備固定化頭孢菌素C?；傅姆椒?br> 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及制備固定化頭孢菌素C?；傅姆椒ā?br> 【背景技術(shù)】
[0002]頭孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)?；甘且徊矫阜ㄉa(chǎn)7_氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA)的一種酰化酶,可以直接催化底物頭孢菌素C,脫去D- α -氨基己二酸側(cè)鏈，一步生產(chǎn)7-ACA。與傳統(tǒng)的兩步酶法相比，一步酶法操作更簡單、方便，成本低，日益受到重視。固定化酶技術(shù)是產(chǎn)生于20世紀(jì)六十年代，目前已廣泛應(yīng)用于生物催化領(lǐng)域的工業(yè)生產(chǎn)中。與游離酶相比，固定化酶具有穩(wěn)定性高、回收方便、易于控制、可重復(fù)使用、成本低廉等優(yōu)點，在兩步酶法生產(chǎn)7-ACA的生產(chǎn)中的酶制劑采用的即是固定化酶技術(shù)。
[0003]近年來，隨著酶固定化技術(shù)的發(fā)展，人們越來越多地利用共價法固定化酶來生產(chǎn)各種β內(nèi)酰胺類抗生素。在兩步法生產(chǎn)7-ACA的工藝中即廣泛采用了共價結(jié)合法固定化酶(Roberto Fernandez-Lafuente, et al.Journal of MolecularCatalysis B:Enzymatic, 1999，7:173 - 179;FernandoLopez-Gallegojet al.Journal ofBiotechnology, 2004, 111:219 - 227)。在固定化酶的工業(yè)應(yīng)用中，為了降低固定化酶的使用成本，一般要求固定化酶具有較好的活性和穩(wěn)定性，可以重復(fù)、多批次的使用。因此，在一步酶法生產(chǎn)7-ACA技術(shù)的開發(fā)中，通過酶分子的基因工程改造、新型固定化酶載體的制備、固定化工藝的改進等，制備得到酶活高、穩(wěn)定性好的固定化CPC酰化酶是至關(guān)重要的。在酶的固定化工藝中，如果在基本不影響固定化酶活性的前提下進一步提高固定化酶的催化穩(wěn)定性，將更有利于固定化酶用于7-ACA的工業(yè)生產(chǎn)。
[0004]戊二醛作為交聯(lián)劑用于酶固定化是已知的，其能通過單點或多點固定化來提高酶的穩(wěn)定性。可以將富含氨基的載體用戊二醛活化之后再進行酶固定化，也可以首先將酶與氨基載體進行離子吸附，之后加入戊二醛。在使用戊二醛進行酶固定化之后，可以使用小分子化合物例如小分子胺、氨基酸、巰基乙醇等對固定的酶進行后修飾，所述后修飾主要是為了封閉未反應(yīng)完的活性基團例如醛基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在對固定CPC酰化酶的研究過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用含氨基的大分子對戊二醛固定化的CPC酰化酶進行后修飾，獲得的固定化CPC酰化酶的熱穩(wěn)定性和耐酸性比不進行后修飾或使用小分子化合物進行后修飾顯著增加。對于熱穩(wěn)定性和耐酸性增加的機理還不是很清楚，但是，推測含氨基的大分子可以在載體和/或酶分子上未反應(yīng)的活性基團(例如醛基)之間“架橋”，并且由于含氨基的大分子自身的柔性，可以填充酶分子、載體和戊二醛之間存在的間隙，從而對酶分子形成一定的“捆綁”作用，因此增加酶分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
[0006]在本發(fā)明 的一個方面，提供了制備固定化CPC?；傅姆椒?，包括:采用戊二醛交聯(lián)劑使頭孢菌素C?；腹潭ㄔ诎被d體上，然后用含氨基的大分子進行后修飾。[0007]所述氨基載體先用戊二醛活化處理，再進行頭孢菌素C?；傅墓潭ɑ?。或者，頭孢菌素C?；赶任焦潭ㄔ诎被d體上，再用戊二醛交聯(lián)。
[0008]上述后修飾按如下進行:將戊二醛固定的CPC酰化酶與含氨基的大分子在緩沖液特別是磷酸鈉緩沖液中混合，調(diào)節(jié)PH值為7.0-9.0,室溫攪拌2_40h。
[0009]任選地，對后修飾之后的固定化CPC酰化酶進行洗滌和干燥。
[0010]所述含氨基的大分子選自聚乙烯亞胺(PEI)、殼聚糖、羧甲基殼聚糖、聚賴氨酸等。
[0011]在所述后修飾過程中，使用濃度為0.l-10g/100ml，例如2.5g/100ml的含氨基的大分子在緩沖液中的溶液。
[0012]所述pH值可以是在7.5-8.5范圍，例如pH為8.0。
[0013]攪拌進行的時間可以是例如3-30小時、5-30小時、10-28小時、15-25小時、20-24小時；還可以是例如24小時。
[0014]攪拌轉(zhuǎn)速可以是50-300rpm，例如100_200rpm。
[0015]本發(fā)明還提供了由本發(fā)明的方法得到的固定化頭孢菌素C酰化酶。
[0016]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0017](I)制備的固定化CPC?；篙^沒有進行后修飾方式得到的CPC酰化酶熱穩(wěn)定性和耐酸性增強。
[0018](2)所用的試劑都是常見的試劑，用量較小，成本低，無污染；
.[0019](3)工藝簡單，操作方便，操作穩(wěn)定性好，非常適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0020]以下將更詳細地描述本發(fā)明。
[0021]作為本發(fā)明的方法中使用的CPC?；福淇梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得。舉例來說，所述CPC?；缚梢酝ㄟ^微生物例如重組大腸桿菌培養(yǎng)獲得；例如，由重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-CPCacy經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)，超聲波細胞破碎，離心，制備而得(ZhuXff, et al., WorldjournalofMicrobiologyandBiotechnology, 2011, 27(4):823_829)。
[0022]作為本發(fā)明的方法中使用的載體，為酶固定化工藝中常用的富含氨基的載體，也稱為氨基載體，例如LX-1000HA，得自西安藍曉科技有限公司。
[0023]作為在本發(fā)明的方法中使用的緩沖體系可以為磷酸鈉緩沖液、硼酸緩沖液、碳酸納緩沖液等。
[0024]作為在本發(fā)明中使用的所述含氨基的大分子，可以使用任意的含有氨基的大分子，只要該大分子可以溶于酶固定化過程中使用的緩沖液，其實例包括聚乙烯亞胺(PEI)、殼聚糖、羧甲基殼聚糖、聚賴氨酸等。
[0025]以下通過實施例對添加含氨基的大分子進行CPC?；腹潭ɑ钢苽涞姆椒ㄟM行詳細的闡述。
[0026]實施例中的分析方法:
[0027]( I)游離CPC?；傅拿富顪y定:
[0028]CPC?；富盍Φ亩x:在370C、pH8.5、底物濃度一定的條件下，每分鐘催化CPC生成I μ mol7-ACA所需的酶量為I個活力單位。
[0029]I)用0.lmol/L、pH8.5的磷酸鈉緩沖液分別配制20mg/mL的CPC溶液和3mg/mL的7-ACA溶液，并用lmol/L的NaOH溶液調(diào)其pH至8.5。
[0030]2)分別取0、1、2、4、8、12、16、2(1740六溶液加入到離心管中，再用0.lmol/L、pH8.5的磷酸鈉緩沖液逐一補足到20 μ L。
[0031]3)分別向各管中加入20 μ L CPC溶液(37°C預(yù)熱3min)并混勻，37°C靜置5min后加入200 μ L終止液(50mmol/L的NaOH溶液與20%的冰醋酸溶液按1:2的體積比混合而成)，并震蕩充分混勻。
[0032]4)將上述混合液12000rpm離3min，然后各取200 μ L上清液到新的離心管中，再加入40 μ L顯色劑(對二甲氨基苯甲醛的甲醇溶液(0.5%,w/v))并混勻，室溫靜置IOmin后，各取200 μ L，以O(shè)為空白對照，分別測定其它幾個樣品在415nm處的吸光度值(采用上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的722S型可見光分光光度計進行測定)。
[0033]5)以7-ACA濃度為橫坐標(biāo)，OD415為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0034]6)取20 μ L CPC?；溉芤杭尤氲诫x心管中(37°C預(yù)熱lmin)，再加入20 μ L CPC溶液(37°C預(yù)熱3min)，37°C反應(yīng)5min后加入200 μ L終止液，混勻。
[0035]7)將上述混合液12000rpm離心3min后取200yL上清液到離心管中，再加入40 μ L顯色劑并混勻，室溫靜置IOmin后，取200 μ L測定其在415nm處的吸光度值。
[0036]8)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算7-ACA濃度，最終計算出CPC?；傅幕钚浴?br> [0037](2)固定化CPC?；傅拿富顪y定:
[0038]固定化CPC酰化酶的酶活測定法方和游離酶的類似。
[0039]I)稱取一定質(zhì)量的固定化酶于37°C預(yù)熱3min。
[0040]2)加入37°C預(yù)熱的0.lmol/L、pH8.5的磷酸鈉緩沖液分別配制20mg/mL的CPC溶液 4mL。
[0041]3) 37°C、160rpm 反應(yīng) 5min。
[0042]4)取20 μ L上清液進行適當(dāng)稀釋，加入200 μ L終止液，混勻。
[0043]5)將上述混合液12000rpm離心3min后取200yL上清液到離心管中，再加入40 μ L顯色劑并混勻，室溫靜置IOmin后，取200 μ L測定其在415nm處的吸光度值(采用上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的722S型可見光分光光度計進行測定)。
[0044]6)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算7-ACA濃度，最終計算出固定化CPC酰化酶的活性。
[0045](3)固定化酶的熱穩(wěn)定性確定
[0046]在本發(fā)明中，固定化酶的熱穩(wěn)定性考察是在0.1M的pH8.0的磷酸鈉溶液中，于50°C水浴中進行熱處理Ih后的殘余酶活比。殘余酶活比=固定化酶熱處理后酶活/固定化酶原始酶活。
[0047](4)固定化酶耐酸性測定
[0048]將固定化酶置于醋酸緩沖液(20mM，pH5.5)中，25度下溫育不同的時間，定時從其中取樣測剩余酶活。在本發(fā)明中，固定化酶的半衰期是指在此條件下固定化酶的活性降為初始酶活一半所需的時間。
[0049]實施例1:氨基載體用戊二醛活化后與CPC?；腹潭?，再用PEI1800進行后修飾
[0050](I)Ig氨基載體LX-1000HA加入0.1M、pH8.0的磷酸鈉緩沖液4mL，攪拌15分鐘后，測PH值，維持pH7.8-8.2，I小時后過濾抽干。將處理好的Ig載體加入已配制好的2%的戊二醛磷酸鈉緩沖液(PH8.0)中，25°C下攪拌I小時，過濾，用去離子水洗滌載體至水清，抽干，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0051](2)有30U游離酶酶活的IOmL0.1M磷酸鈉緩沖液(ρΗ8.0)，取步驟(I)活化的載體Ig加入到該體系中，25°C下低速攪拌20h。將上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌，抽干回收。
[0052](3)在IOmL磷酸鈉緩沖液中(0.1M、pH值8.0)分別加入0,0.25gPEI1800 (分子量為1800的PEI)，搖勻待PEI1800完全溶解，取步驟(2)的固定化酶Ig加入到該體系中，將固定體系終PH值調(diào)為8.0，25°C下低速攪拌24h。將上述固定后得到的固定化酶用大量
0.1Μ、ρΗ值8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌，抽干回收。
[0053]將處理后的固定化酶進行酶活測定，加入0,2.5%PEI1800制備的固定化CPC?；该富罘謩e為25、23U/g。將加入0、2.5%PEI1800制備的固定化酶對其50°C熱處理Ih后，測得其殘余酶活比例分別為25.1%和34.9%。
[0054]實施例2:氨基載體用戊二醛活化后與CPC?；腹潭?，再用PEI20000進行后修飾
[0055]( I)同實施例1，首先將載體進行活化。
[0056](2)同實例1，將得到載體與游離酶進行共價結(jié)合。
[0057](3)在IOmL磷酸鈉緩沖液中(0.1Μ、ρΗ值8.0)分別加入0,0.25gPEI20000 (分子量為20000的PEI)，搖勻待PEI20000完全溶解，取步驟(2)的固定化酶Ig加入到該體系中，將固定體系終PH值調(diào)為8.0，25°C下低速攪拌24h。將上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌，抽干回收。
[0058]將處理后的固定 化酶進行酶活測定，加入0、2.5%PEI20000制備的固定化CPC?；该富罘謩e為25、23U/g。將加入0、2.5%PEI20000制備的固定化酶按照實例I對其50°C熱處理Ih后，測得其殘余酶活比例分別為25.1%和38.9%。
[0059]實施例3:氨基載體用戊二醛活化后與CPC酰化酶固定，再用羧甲基殼聚糖進行后修飾
[0060]( I)同實施例1，首先將載體進行活化。
[0061](2)同實例1，將得到載體與游離酶進行共價結(jié)合
[0062](3)在IOmL磷酸鈉緩沖液中(0.1M、pH值8.0)分別加入0、0.25g羧甲基殼聚糖，搖勻待羧甲基殼聚糖完全溶解，取步驟(2)的固定化酶Ig加入到該體系中，將固定體系終pH值調(diào)為8.0，25°C下低速攪拌24h。將上述固定后得到的固定化酶用大量0.1Μ、ρΗ值8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌，抽干回收
[0063]將處理后的固定化酶進行酶活測定，加入0,2.5%羧甲基殼聚糖制備的固定化CPC酰化酶酶活分別為25、24U/g。將加入0、2.5%羧甲基殼聚糖制備的固定化酶按照實例I對其50°C熱處理Ih后，測得其殘余酶活比例分別為25.1%和37.6%。
[0064]對比例1:氨基載體用戊二醛活化后與CPC酰化酶固定，再用己二胺進行后修飾
[0065](I)同實施例1，首先將載體進行活化。
[0066](2)同實例1，將得到載體與游離酶進行共價結(jié)合
[0067](3)在IOmL磷酸鈉緩沖液中(0.1Μ、ρΗ值8.0)分別加入0、2.32g己二胺(分子量為116.2)，搖勻待己二胺完全溶解，取步驟(2)的固定化酶Ig加入到該體系中，將固定體系終pH值調(diào)為8.0，25°C下低速攪拌24h。將上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌，抽干回收
[0068]將處理后的固定化酶進行酶活測定，加入0、2M己二胺制備的固定化CPC?；该富罘謩e為25、23U/g。將加入0、2M己二胺制備的固定化酶按照實例I對其50°C熱處理Ih后，測得其殘余酶活比例分別為25.1%和25.3%。而在實施例1、2、3中，用含氨基的大分子(PEI，殼聚糖，羧甲基殼聚糖)采用相同方法處理固定化酶，其酶活穩(wěn)定性要明顯高的多。
[0069]實施例4 =CPC?；肝皆诎被d體上，用戊二醛交聯(lián)后再用PEI1800進行后修飾
[0070](I)Ig氨基載體加入0.1Μ、ρΗ8.0的磷酸鈉緩沖液4mL，攪拌15分鐘后，測pH值，維持pH7.8-8.2，I小時后過濾抽干。將處理好的Ig載體加入到有30U游離酶酶活的IOml0.1M磷酸鈉緩沖液(PH8.0)中25°C下低速攪拌20h。將上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌，抽干回收。
[0071](2)將步驟(I)得到固定化酶Ig加入已配制好的0.5%的戊二醛磷酸鈉緩沖液(PH8.0)中，25°C下攪拌I小時，過濾，用去離子水洗滌載體至水清，抽干，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0072](3)在IOmL磷酸鈉緩沖液中(0.1M、pH值8.0)分別加入O、0.25gPEI1800,搖勻待PEI1800完全溶解，取步驟(2 )的固定化酶Ig加入到該體系中，將固定體系終pH值調(diào)為8.0，25°C下低速攪拌24h。
[0073](4)同實例1，將得到的固定化酶進行洗滌處理。
[0074]將處理后的固定化酶進行酶活測定，加入0,2.5%PEI1800制備的固定化CPC?；该富罘謩e為18、14U/g。將加入0、2.5%PEI1800制備的固定化酶按照實例I對其50°C熱處理后，測得其殘余酶活比 例分別為48.1%和65.4%。
[0075]實施例5 =CPC酰化酶固定在氨基載體上，用戊二醛交聯(lián)后再用羧甲基殼聚糖進行后修飾
[0076](I)同實例4，將載體洗滌后與酶吸附。
[0077](2)同實施例4，步驟(I)得到固定化酶用戊二醛交聯(lián)。
[0078](3)在IOmL磷酸鈉緩沖液中(0.1M、pH值8.0)分別加入0、0.25g羧甲基殼聚糖，搖勻待羧甲基殼聚糖完全溶解，取步驟(2)的固定化酶Ig加入到該體系中，將固定體系終pH值調(diào)為8.0，25°C下低速攪拌24h。
[0079](4)同實例1，將得到的固定化酶進行洗滌處理。
[0080]將處理后的固定化酶進行酶活測定，加入0,2.5%羧甲基殼聚糖制備的固定化CPC?；该富罘謩e為18、18U/g。將加入0、2.5%羧甲基殼聚糖制備的固定化酶按照實例I對其50°C熱處理后，測得其殘余酶活比例分別為48.1%和67.6%。
[0081]實施例6:CPC?；肝焦潭ㄔ诎被d體上，用戊二醛交聯(lián)后再用PEI20000進行后修飾
[0082](I)同實例4，將載體洗滌后與酶吸附
[0083](2)同實施例4，步驟(I)得到固定化酶用戊二醛交聯(lián)。
[0084](3)在IOmL磷酸鈉緩沖液中(0.1M、pH值8.0)分別加入0、0.25gPEI20000，搖勻待PEI20000完全溶解，取步驟(2)的固定化酶Ig加入到該體系中，將固定體系終pH值調(diào)為8.0，25 °C下低速攪拌24h。
[0085](4)同實例1，將得到的固定化酶進行洗滌處理。[0086]將處理后的固定化酶進行酶活測定，加入0、2.5%PEI20000制備的固定化CPC?；该富罘謩e為18、14U/g。將加入0、2.5%PEI20000制備的固定化酶按照實例I對其50°C熱處理后，測得其殘余酶活比例分別為48.1%和77.8%。將將加入0、2.5%PEI20000制備的固定化酶放到pH5.5(25°C )下放置，測得其半衰期分別為1.3h, 2.3h。
[0087]實施例7:CPC?；肝焦潭ㄔ诎被d體上，用戊二醛交聯(lián)后再用殼聚糖2000進行后修飾
[0088](I)同實例4，將載體洗滌后與酶吸附
[0089](2)同實施例4，步驟(I)得到固定化酶用戊二醛交聯(lián)。
[0090](3)在IOmL磷酸鈉緩沖液中(0.1Μ、ρΗ值8.0)分別加入0、0.25g殼聚糖2000，搖勻待殼聚糖2000 (分子量為2000的殼聚糖)完全溶解，取步驟(2)的固定化酶Ig加入到該體系中，將固定體系終PH值調(diào)為8.0，25°C下低速攪拌24h。
[0091](4)同實例1，將得到的固定化酶進行洗滌處理。
[0092]將處理后的固定化酶進行酶活測定，加入0,2.5%殼聚糖2000制備的固定化CPC?；该富罘謩e為18、15U/g。將加入0、2.5%殼寡糖2000制備的固定化酶按照實例I對其50°C熱處理后，測得其殘余酶活比例分別為48.1%和77.0%。將加入0、2.5%殼寡糖2000制備的固定化酶按照實例6對其進行pH5.5放置后，半衰期分別為1.3h, 2.lh。
[0093]對比例2:CPC?；肝焦潭ㄔ诎被d體上，用戊二醛交聯(lián)后再用乙二胺進行后修飾
[0094]( I)同實例4，將載體洗滌后與酶吸附
[0095](2)同實施例4，步驟(I)得到固定化酶用戊二醛交聯(lián)。
[0096](3)在IOmL磷酸鈉緩沖液中(0.1Μ、ρΗ值8.0)分別加入O、1.2g乙二胺(分子量為60.1)，搖勻乙二胺完全溶解，取步驟(2)的固定化酶Ig加入到該體系中，將固定體系終pH值調(diào)為8.0，25°C下低速攪拌24h。
[0097](4)同實例1，將得到的固定化酶進行洗滌處理。
[0098]將處理后的固定化酶進行酶活測定，加入0、2M乙二胺制備的固定化CPC?；该富罘謩e為18、13U/g。將加入0、2M乙二胺制備的固定化酶按照實例I對其50°C熱處理后，測得其殘余酶活比例分別為48.1%和51.3%。而在實施例4、5、6、7中，用含氨基的大分子(PEI，殼聚糖，羧甲基殼聚糖)采用相同方法處理固定化酶，其酶活穩(wěn)定性要明顯高的多。
[0099]最后所應(yīng)說明的是:以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解:依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換；而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種制備固定化頭孢菌素C?；傅姆椒?，包括:采用戊二醛交聯(lián)劑使頭孢菌素C?；腹潭ㄔ诎被d體上，然后用含氨基的大分子進行后修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:氨基載體先用戊二醛活化處理，再進行頭孢菌素C酰化酶的固定化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:頭孢菌素C?；赶任焦潭ㄔ诎被d體上，再用戊二醛交聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于:所述含氨基的大分子選自聚乙烯亞胺、殼聚糖、羧甲基殼聚糖和聚賴氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:在所述后修飾過程中，使用濃度為0.lg/100ml-10g/100ml，例如2.5g/100ml的含氨基的大分子在緩沖液中的溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于:所述方法中使用磷酸鈉緩沖液、硼酸緩沖液或碳酸鈉緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于:所述后修飾按如下進行:將戊二醛固定的CPC?；概c含氨基的大分子在緩沖液，特別是磷酸鈉緩沖液，中混合，調(diào)節(jié)pH值為7.0-9.0,室溫攪拌2-40小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述攪拌進行3-30小時、5-30小時、10-28小時、15-25小時、20-24小時；例如24小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于:攪拌轉(zhuǎn)速是50-300rpm，例如100-200rpmo
10.由權(quán)利要求1-9任一項所述的方法得到的固定化頭孢菌素C?；?。
【文檔編號】C12N11/08GK103436517SQ201310401009
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】羅暉, 何華, 常雁紅, 魏艷梅, 于慧敏, 沈忠耀 申請人:北京科技大學(xué)