雷帕霉素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種雷帕霉素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法，利用多種細(xì)胞因子聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑——雷帕霉素，將人外周血來源的單個(gè)核細(xì)胞通過體外誘導(dǎo)擴(kuò)增，培養(yǎng)出大量的調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞。本發(fā)明整個(gè)誘導(dǎo)、擴(kuò)增和富集過程簡單，可行性強(qiáng)；本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)周期短，成本低；誘導(dǎo)效率高，重復(fù)性好，可在調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞活力好，具有較強(qiáng)的免疫抑制功能，能保證以后的進(jìn)一步研究，具有很好的推廣價(jià)值。
【專利說明】雷帕霉素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性gamma ST細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)研究領(lǐng)域，涉及一種雷帕霉素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性gamma δ T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，是應(yīng)用多種細(xì)胞因子(TGF-β 1/IL-15/IL-2)聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制藥物——雷帕霉素協(xié)同誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性gamma ST細(xì)胞的生成和擴(kuò)增。
【背景技術(shù)】
[0002]gamma δ T細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中的一群特殊的細(xì)胞亞群，其有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。與一般的α β T細(xì)胞不同，gamma δ T細(xì)胞表面受體由gamma鏈和δ鏈兩種糖蛋白鏈組成，因此而命名；這群細(xì)胞識別抗原不需要經(jīng)細(xì)胞表面組織相容性抗原分子提呈，它可直接識別蛋白質(zhì)、肽類和非肽類抗原，即該過程為非HLA(人類白細(xì)胞抗原)限制性，是gamma δ T細(xì)胞的一個(gè)重要生物學(xué)特性。盡管gamma S T細(xì)胞在外周血和淋巴器官中比例非常小，但是其在人體特異性和非特異性免疫系統(tǒng)中均起著非常重要的作用，不但能夠防御病原體包括細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲的侵染，而且在腫瘤的免疫監(jiān)視、維持組織自身穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)和炎癥后期組織的修復(fù)上均發(fā)揮重要作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，gamma ST細(xì)胞在不同的微環(huán)境誘導(dǎo)下可分為不同的亞群，包括gamma δ Thl7、gamma δ Thl和調(diào)節(jié)性gamma δ T細(xì)胞(gamma δ Treg)等。
[0003]gamma δ Treg是gamma δ T細(xì)胞中的一群特殊的細(xì)胞亞群，它與一般的調(diào)節(jié)性α β T細(xì)胞一樣均表達(dá)Foxp3轉(zhuǎn)錄因子，其免疫表型以TCR gamma δ +Foxp3+雙陽性為特征(TCR指細(xì)胞表面受體)。已有的研究顯示該群細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫抑制功能，Xiaogammaan Li等人研究發(fā)現(xiàn)
gammaδ Treg在抑制和緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE中發(fā)揮很重要的調(diào)控作用；隨后Jian gammae等人的研究顯示乳腺腫瘤來源的gamma S Treg細(xì)胞可通過免疫衰老的機(jī)制發(fā)揮對機(jī)體特異和非特異性免疫的抑制作用；在我們之前的研究中，我們利用人源化N0D/SCID小鼠首次發(fā)現(xiàn)了
gammaδ Treg對異基因造血干細(xì)胞移植后的移植物抗宿主病(GVHD)所具有的免疫防護(hù)作用，即gamma STreg的共輸注可以一定程度上緩解GVHD的發(fā)生。gamma δ Treg細(xì)胞已表現(xiàn)出來的重要的免疫負(fù)調(diào)控作用提示其具有潛在的治療自身免疫性疾病、實(shí)體器官移植排斥反應(yīng)和異基因造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病的作用，并且gamma δ T細(xì)胞本身識別抗原的非HLA限制性特征，增加了這群細(xì)胞所具有的研究價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。然而目前對gamma STreg的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增方法偏少，因此找到一種新的gamma δ Treg體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，提高其體外誘導(dǎo)擴(kuò)增效率，對以后gamma S Treg的進(jìn)一步研究及其臨床應(yīng)用均具有很重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要目的是提供一種雷帕霉素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性gamma δΤ細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其主要步驟如下:
(1)人外周血單個(gè)核細(xì)胞制備:取外周血標(biāo)本，肝素抗凝，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離制備單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；
(2)調(diào)節(jié)性gammaδ T細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增:細(xì)胞接種當(dāng)日按第O天計(jì)算，第O天加入唑來膦酸激活gamma S T細(xì)胞，同時(shí)加入IL-2/IL-15/TGF-13 I和雷帕霉素培養(yǎng)誘導(dǎo)，在第3、6、9天分別進(jìn)行半量換液，每次換液時(shí)均加入新鮮IL-2/IL-15/TGF-13 I和雷帕霉素，濃度同前，于第15天檢測培養(yǎng)細(xì)胞中調(diào)節(jié)性Y δT細(xì)胞的含量；
(3)調(diào)節(jié)性-δ T細(xì)胞含量的檢測:采用流式細(xì)胞術(shù)，以Y STCR和Foxp3作為分子標(biāo)記，- δ TCR+為- ST細(xì)胞的表型特征，Y δ TCR+Foxp3+為調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的表型特征，檢測調(diào)節(jié)性Y ST細(xì)胞在培養(yǎng)細(xì)胞中所占的比例；
(4)調(diào)節(jié)性-δ T細(xì)胞的富集:采用免疫磁珠分選方法(MACS)分選- δ TCR+細(xì)胞群，內(nèi)包含調(diào)節(jié)性Y ST細(xì)胞；
(5)檢測富集的調(diào)節(jié)性Yδ T細(xì)胞的免疫抑制功能:采用流式細(xì)胞術(shù)，通過CFSE細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)檢測分析誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性Y ST細(xì)胞對新鮮外周血來源單個(gè)核細(xì)胞的增殖抑制作用。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述的培養(yǎng)方法在調(diào)節(jié)性Y δΤ細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用，所述培養(yǎng)通過雷帕霉素誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。
[0006]為進(jìn)一步深入研究調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的生物學(xué)特性及其以后的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)，本發(fā)明利用多種細(xì)胞因子(包括唑來膦酸、IL-2、IL-15和TGF-β I)聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑——雷帕霉素，將人外周血來源的單個(gè)核細(xì)胞通過體外誘導(dǎo)擴(kuò)增，培養(yǎng)出大量的調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞。本發(fā)明整個(gè)誘導(dǎo)、擴(kuò)增和富集過程簡單，可行性強(qiáng)；細(xì)胞培養(yǎng)周期短，成本低；誘導(dǎo)效率高，重復(fù)性好；誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞活力好，具有較強(qiáng)的免疫抑制功能，能保證以后的進(jìn)一步研究，具有很好的推廣價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1是流式細(xì)胞術(shù)檢測分析不同培養(yǎng)條件下調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的誘導(dǎo)情況；橫坐標(biāo)表示Y δ TCR表達(dá)強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表示Foxp3表達(dá)強(qiáng)度，Y δ TCR+Foxp3+細(xì)胞即表示誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性Y δΤ細(xì)胞汸圖為單用IL-2培養(yǎng)組細(xì)胞檢測結(jié)果，僅有少量雙陽性調(diào)節(jié)性Y δΤ細(xì)胞(占總細(xì)胞的2.13%)；Β圖為用TGF-β 1/IL-15/IL-2培養(yǎng)組細(xì)胞檢測結(jié)果，雙陽性細(xì)胞比例增加(占29.6%)；C圖為聯(lián)用雷帕霉素和TGF-β 1/IL-15/IL-2培養(yǎng)組檢測結(jié)果，雙陽性細(xì)胞群比例明顯上升(占55.8%)，高于單用TGF-β 1/IL-15/IL-2培養(yǎng)組。
[0008]圖2表示多次實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)組中調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的誘導(dǎo)率大小，即誘導(dǎo)后調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞在總Y δ T細(xì)胞中所占的比例；Α組表示單用IL-2培養(yǎng)(Y δ T組，即對照組)，B組表示單用TGF-β 1/IL-15/IL-2培養(yǎng)組，C組表示聯(lián)用雷帕霉素和TGF-β I/IL-15/IL-2培養(yǎng)組。結(jié)果表明，與Y δΤ組相比，用TGF-0 1/IL-15/IL-2培養(yǎng)后調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞的誘導(dǎo)率顯著增加，而聯(lián)用雷帕霉素后誘導(dǎo)率增加更明顯，顯著高于單用TGF-β 1/IL-15/IL-2 組(P < 0.05)。
[0009]圖3 表示聯(lián)用雷帕霉素誘導(dǎo)組細(xì)胞在經(jīng)免疫磁珠分選(MACS)前后的流式檢測結(jié)果；左圖表示分選前(Y S TCR+細(xì)胞占總細(xì)胞的93%)，右圖表示分選后(Y STCR+細(xì)胞占99%)，結(jié)果顯示分選后Y STCR+細(xì)胞比例明顯上升，說明Y STCR+細(xì)胞得到富集純化。
[0010]圖4表示新鮮分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞不分裂(左圖)和正常分裂(右圖)時(shí)流式檢測細(xì)胞CFSE熒光表達(dá)情況；分別作為陰性對照和陽性對照；不分裂條件下未分裂細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的98.2%，正常分裂條件下未分裂細(xì)胞數(shù)占15.6%。
[0011]圖5表示單用TGF-β 1/IL-2/IL-15組誘導(dǎo)生成的調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞與新鮮分離的單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)后，單個(gè)核細(xì)胞的增殖情況(細(xì)胞CFSE熒光表達(dá)情況)；其中單個(gè)核細(xì)胞與調(diào)節(jié)性Y ST細(xì)胞以不同比例混合(分別為8:1，4:1，2:1，1:1);由檢測結(jié)果可以看出，共培養(yǎng)后單個(gè)核細(xì)胞增殖代數(shù)明顯減少(與正常分裂時(shí)相比)，未分裂細(xì)胞占的比例分別為35.1% (8:1),44.2% (4:1),56.6% (2:1),62.5% (1:1);隨著調(diào)節(jié)性 Y δ T 細(xì)胞比例增加，這種增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。
[0012]圖6表示聯(lián)用雷帕霉素和TGF-β 1/IL-2/IL-15組誘導(dǎo)生成的調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞與新鮮分離的單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)后，流式檢測單個(gè)核細(xì)胞的增殖情況；單個(gè)核細(xì)胞與調(diào)節(jié)性Y '細(xì)胞以不同比例混合“氺七 ”由檢測結(jié)果可以看出’共培養(yǎng)后單個(gè)核細(xì)胞增殖代數(shù)明顯減少(與正常分裂組相比)，未分裂細(xì)胞占的比例分別為46.2% (8:1)，57.3% (4:1),69.4% (2:1),83.0% (1:1);隨著調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞比例的增加，這種增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)；與圖5相比較可以看出，在相同的比例下，單個(gè)核細(xì)胞與聯(lián)用雷帕霉素誘導(dǎo)生成的調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞共培養(yǎng)后，增殖抑制作用更明顯。
[0013]圖7表示計(jì)算不同共培養(yǎng)組中單個(gè)核細(xì)胞的增殖抑制率大小，反映增殖抑制情況;“TGF- β I”組指調(diào)節(jié)性Y ST細(xì)胞來源于單用TGF- β 1/IL-15/IL-2誘導(dǎo)，“Rapa+TGF-β I”組指調(diào)節(jié)性 δ T細(xì)胞來源于聯(lián)用雷帕霉素共誘導(dǎo)；共培養(yǎng)比例(單個(gè)核細(xì)胞:調(diào)節(jié)性Y δΤ細(xì)胞)分別為8:1，4:1, 2:1和1:1， δΤ組為對照組，主要為了排除非調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞對單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響；由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可得，在相同的共培養(yǎng)細(xì)胞比例下，聯(lián)用雷帕霉素誘導(dǎo)生成的調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞表現(xiàn)更明顯的免疫抑制功能(P <0.05)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞因子均購自PeproTech公司，流式細(xì)胞術(shù)檢測用單克隆突光抗體均購自eBioscience公司，唑來膦酸(商品名擇泰)為諾華制藥有限公司贈(zèng)送，雷帕霉素(商品名西羅莫司)購自Sigma`公司，Y δ T細(xì)胞MACS分選試劑盒購自德國美天旎生物技術(shù)公司，突光染料CFSE購自美國invitrogen生命技術(shù)公司。
[0015]實(shí)施例1人外周血來源單個(gè)核細(xì)胞制備
1、先將收集的肝素抗凝外周血(浙江省血液中心)與等量PBS(磷酸鹽緩沖液)進(jìn)行1:1稀釋；
2、取若干15ml離心管，各加入5ml的人淋巴細(xì)胞分離液，再將稀釋后的外周血沿管壁緩慢疊加到淋巴細(xì)胞分離液上，每個(gè)離心管中加入外周血10ml，即5ml淋巴細(xì)胞分離液+IOml稀釋后的外周血(1:2);水平離心，500gX20分鐘，室溫；
3、離心后見管內(nèi)分為三層，上層為血漿和PBS緩沖液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一層以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧狀狹窄帶，即為所需要的細(xì)胞帶；
4、將移液槍的槍頭插到云霧層中吸取單個(gè)核細(xì)胞，置入另一15ml離心管中，加入5倍以上體積的PBS緩沖液，混勻后離心，300gX6 min ;洗滌兩次；
5、末次離心后棄上清，加入含有10%胎牛血清和1%雙抗的完全RPMI1640培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2X106/ml ;接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)。
[0016]實(shí)施例2調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)
1.將培養(yǎng)的細(xì)胞分成三大組，包括單用IL-2培養(yǎng)組(Y δ T組)、用TGF-β 1/IL-2/IL-15誘導(dǎo)組(TGF-β I組)，以及聯(lián)用TGF-β 1/IL-2/IL-15和雷帕霉素誘導(dǎo)組(聯(lián)用雷帕霉素組);各細(xì)胞因子都在細(xì)胞培養(yǎng)第O天加入，其加入后終濃度見下表I所述；雷帕霉素也在細(xì)胞培養(yǎng)第O天加入。
[0017]
【權(quán)利要求】
1.一種雷帕霉素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)人外周血單個(gè)核細(xì)胞制備:取外周血標(biāo)本，肝素抗凝，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離制備單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞； (2)調(diào)節(jié)性Yδ T細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增:細(xì)胞接種當(dāng)日按第O天計(jì)算，第O天加入唑來膦酸激活Y S T細(xì)胞，同時(shí)加入IL-2/IL-15/TGF-13 I和雷帕霉素培養(yǎng)誘導(dǎo)，在第3、6、9天分別進(jìn)行半量換液，每次換液時(shí)均加入新鮮IL-2/IL-15/TGF-13 I和雷帕霉素，濃度同前，于第15天檢測培養(yǎng)細(xì)胞中調(diào)節(jié)性Y δT細(xì)胞的含量； (3)調(diào)節(jié)性Yδ T細(xì)胞含量的檢測:采用流式細(xì)胞術(shù)，以Y STCR和Foxp3作為分子標(biāo)記，Y δ TCR+為 ST細(xì)胞的表型特征，Y δ TCR+Foxp3+為調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的表型特征，檢測調(diào)節(jié)性Y ST細(xì)胞在培養(yǎng)細(xì)胞中所占的比例； (4)調(diào)節(jié)性Yδ T細(xì)胞的富集:采用免疫磁珠分選方法分選Y δ TCR+細(xì)胞群，內(nèi)包含調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞； (5)檢測富集的調(diào)節(jié)性Yδ T細(xì)胞的免疫抑制功能:采用流式細(xì)胞術(shù)，通過CFSE細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)檢測分析誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性Y ST細(xì)胞對新鮮外周血來源單個(gè)核細(xì)胞的增殖抑制作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雷帕霉素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性YS T細(xì)胞的培養(yǎng)方法在δΤ細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用，所述培養(yǎng)通過雷帕霉素誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。
【文檔編號】C12N5/0783GK103436493SQ201310384046
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月29日
【發(fā)明者】黃河, 顧嫣珺, 胡永仙 申請人:浙江大學(xué)