利用秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)木霉厚垣孢子的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及利用秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)木霉厚垣孢子的方法及應(yīng)用。本制劑（10%T11-W厚垣孢子顆粒劑）在施加有效孢子量為2×107時，防效達(dá)85.96%，高于10%T11-W分生孢子顆粒劑的防效（73.32%）。在施加有效孢子量為2×106時，本制劑的防效為68.96%，明顯高于T11-W分生孢子顆粒劑的47.15%，且兩者差異顯著。表明T11-W厚垣孢子顆粒劑對根結(jié)線蟲的防治效果明顯優(yōu)于其分生孢子顆粒劑。
【專利說明】利用秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)木霉厚垣孢子的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及利用秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)木霉厚垣孢子的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]木霉(Trichoderma spp)菌,廣泛存在于土壤、植物殘體、植物根圍、植物葉片及種子、球莖表面及動物糞便上。該類真菌因能產(chǎn)生拮抗物質(zhì)和寄生有害植物病原菌，而被人們廣泛應(yīng)用。(楊春平，張晉康，等。綠色木霉L24菌株分生孢子可濕性粉劑的研制[J]。西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，19(9):43-47)。目前生產(chǎn)上常用的木霉菌劑多為它的分生抱子制劑，如美國的ToPshield(哈茨木霉T-22)、以色列Trichodex (哈茨木霉T39)及中國的根友(哈茨木霉LTR-2)等。
[0003]木霉Tll-W是從黃瓜根結(jié)線蟲卵上分離所得，菌種保藏號CGMCC N0.7938，經(jīng)鑒定是哈茨木霉。該菌是一種具有應(yīng)用潛力的線蟲生防真菌，不但能夠寄生根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)卵和雌成蟲，還能寄生秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)成蟲，并能在其蟲體上產(chǎn)生大量厚垣孢子。厚垣孢子是木霉抵抗逆境條件而產(chǎn)生的，人工發(fā)酵培養(yǎng)要求條件苛刻且產(chǎn)孢量低，因而國內(nèi)外對其研究應(yīng)用少。但厚垣抱子具有耐干燥、耐低溫、對土壤抑菌作用不敏感等特點，因此，研究利用秀麗隱桿線蟲生產(chǎn)木霉厚垣孢子方法，對研制以木霉厚垣孢子為主體的生防制劑具有重要意義。
[0004]秀麗隱桿線蟲，是一種模式線蟲。它生活在世界各地的泥土中，以細(xì)菌為食，容易人工養(yǎng)殖，生長周期短，從卵到成蟲只需三天半(劉恩岐，倉林讓。模型動物一秀麗隱桿線蟲研究進(jìn)展[J].動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)，2003，20 (10):23 — 25)，故能迅速大量繁殖，供Tll-W
作培養(yǎng)基生產(chǎn)厚垣孢子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]1.利用秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)Tll-W厚垣孢子
[0006]本發(fā)明提供一種對根結(jié)線蟲卵和秀麗隱桿線蟲成蟲有高效寄生率的菌株T11-W，分類命名為哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Tll-ff,已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏，其保藏號為CGMCC N0.7938，保藏時間為2013年7月19日，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
[0007]本發(fā)明并提供一種利用秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)木霉Tll-W厚垣孢子的方法。將秀麗隱桿線蟲成蟲和木霉菌Tl1-W分生孢子共同加到0.8%瓊脂培養(yǎng)基上，于20~25°C的環(huán)境，黑暗靜止培養(yǎng)8~10天，即可收集厚垣孢子。
[0008]2.Tll-W厚垣孢子制劑研究與應(yīng)用
[0009]本發(fā)明生產(chǎn)的Tll-W厚垣孢子在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用是防治土傳的線蟲病害，這決定了該菌劑的施藥方式為澆施、撒施或穴施。綜合考慮多方面因素選擇以Tll-W厚垣孢子粉為有效成分配制一種顆粒劑，組分如下:[0010]
厚垣孢子10重量份
娃藻土70重量份
4，47_二羥基二苯甲酮8重量份
糊精10重量份
[0011]將上述組分置適宜的容器內(nèi)混合均勻，加入適量蒸餾水，并用醋酸和/氨水調(diào)節(jié)PH為6，制成“手捏成團(tuán)，壓之即散”的軟材，再以擠壓方式通過14~22目篩網(wǎng)(板)，制成均勻的顆粒。
[0012]上述組分中硅藻土為吸附劑，4，4' -二羥基二苯甲酮為穩(wěn)定劑，糊精為粘合劑，醋酸和氨水為PH調(diào)節(jié)劑，蒸餾水為潤濕劑。
[0013]上述顆粒劑的應(yīng)用效果如下:
[0014]對番茄根結(jié)線蟲的防治(溫室盆栽)
[0015]表1本制劑對番茄根結(jié)線蟲的防治效果
[0016]
【權(quán)利要求】
1.利用秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)木霉厚垣孢子的方法，其特征在于將秀麗隱桿線蟲成蟲和木霉菌Tll-W分生孢子共同加到0.8%瓊脂培養(yǎng)基上，于20~25°C的環(huán)境，黑暗靜止培養(yǎng)8~.10天，即可收集厚垣孢子。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)木霉厚垣孢子的方法，其特征在于秀麗隱桿線蟲成蟲和木霉菌Tll-W分生孢子的用量比例為線蟲800~1000條:分生孢子
lX106cfu。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)木霉厚垣孢子的方法，其特征在所述秀麗隱桿線蟲成蟲的培養(yǎng)方法包括懷卵成蟲的培養(yǎng)，其中包括E.coli 0P50的培養(yǎng)及菌體收集、線蟲的平板培養(yǎng)、線蟲的搖瓶大量培養(yǎng)；大量卵的制備；成蟲的培養(yǎng)及收集各步驟；其中: 所說的E.coli 0P50的培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為固體LB培養(yǎng)基和液體LB培養(yǎng)基； 所說的線蟲的平板培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為含有E.coli 0P50的改良NGM培養(yǎng)基，其配方為:氯化鈉3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，膽固醇0.005g，氯化鈣0.llg，七水硫酸鎂0.25g，磷酸氫二鉀0.76g，磷酸二氫鉀2.96g，瓊脂20g，水1000mL ； 添加色氨酸0.2g對秀麗隱桿線蟲的生長發(fā)育有促進(jìn)作用；
所說的線蟲的搖瓶大量培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為含有E.coli 0P50的改良液體NGM培養(yǎng)基，其配方為:氯化鈉3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，膽固醇0.005g，氯化鈣0.llg，七水硫酸鎂0.25g，磷酸氫二鉀0.76g，磷酸二氫鉀2.96g，水1000mL ；
所說的大量卵的制備過程中，采用新鮮的改良bleach溶液進(jìn)行反復(fù)洗滌； 改良Bleach溶液的配方為:6%NaC10 20 ml,NaOH lg，低溫蛋白酶0.2g，水定容至100ml ； 所說的成蟲的培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為含有E.coli 0P50的改良液體NGM I其配方為:氯化鈉3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，膽固醇0.005g，氯化鈣0.llg，七水硫酸鎂0.25g，磷酸氫二鉀 0.76g，磷酸二氫鉀 2.96g，水 1000mL。
4.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)木霉厚垣孢子的方法，其特征在于所說的木霉菌Tll-W分生孢子的培養(yǎng)方法為:將木霉菌株Tll-W接種于PDA培養(yǎng)基上，置于28°C下培養(yǎng)一周，將培養(yǎng)所的分生孢子用無菌水洗下，并過濾，并將其稀釋至目標(biāo)濃度IXlO6 cfu/mL。
5.如權(quán)利要求4所述的木霉菌Tll-W分生孢子的培養(yǎng)方法，其特征在于所說的木霉菌T11-W，分類命名為哈茨木霉，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏，其保藏號為CGMCC N0.7938，保藏時間為2013年7月19日，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
6.如權(quán)利要求1所述的木霉厚垣孢子的應(yīng)用，其特征在于用于防治土傳的線蟲病害。
7.如權(quán)利要求6所述的木霉厚垣孢子的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用木霉厚垣孢子為有效成分配制防治土傳的線蟲病害的顆粒劑，具體組成如下: 厚垣孢子10重量份 娃藻土70重量份 . 4，47—二羥基二苯甲酮8重量份 糊精10重量份。
【文檔編號】C12N3/00GK103555648SQ201310377872
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】王貽蓮, 亞平, 李紀(jì)順, 楊合同, 扈進(jìn)冬, 李紅梅, 郭凱, 陳穗云, 孫文向, 許銀連, 尹忠仁 申請人:云南省煙草公司臨滄市公司, 山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心, 昆明保騰生化技術(shù)有限公司