番茄環(huán)紋斑點病毒rt-lamp檢測方法、引物組及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測方法、引物組及其應(yīng)用，發(fā)明人采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)，并根據(jù)番茄環(huán)紋斑點病毒L片段的基因序列設(shè)計了相應(yīng)的RT-LAMP檢測引物組，包括外側(cè)引物對F3和B3、內(nèi)側(cè)引物對FIP和BIP，由此發(fā)明了用于檢測番茄環(huán)紋斑點病毒的RT-LAMP檢測方法及試劑盒。應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法及試劑盒，僅需通過對煙草、辣椒、番茄及雜草等疑似感染植株樣品進行總RNA提取并進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，即可快速檢測出是否感染番茄環(huán)紋斑點病毒，方便基層快速、準確、簡便地進行病害鑒定，進而采取適當?shù)姆乐未胧?，減少病害帶來的損失。
【專利說明】番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測方法、引物組及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于番茄環(huán)紋斑點病毒檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測方法、弓I物組及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]番爺環(huán)紋斑點病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)番爺斑萎病毒屬(Tospovirus)，是中國于2008年首次報道的Tospovirus的一個新種，該病毒可以通過汁液進行傳播，也可由煙薊馬和西花薊馬進行傳播。TZSV自然條件下可侵染番茄、辣椒、馬鈴薯和煙草等24種作物及雜草。TZSV在番茄、煙草的整個生長發(fā)育期均可侵染為害，苗齡愈小，環(huán)境溫度愈高，發(fā)病愈重。2009年在廣西靖西縣的調(diào)查顯示，TZSV發(fā)病率達10%以上的煙草面積約有2000畝，嚴重的地塊發(fā)病率達41%，許多煙苗病死，煙田呈現(xiàn)嚴重的缺苗現(xiàn)象；德保縣發(fā)病率達10%-30%以上的面積約1500畝，2010年病情依然較為嚴峻，病株率達10.17%。另據(jù)報道，該病害在云南昆明、玉溪、紅河等多地均有發(fā)生，給當?shù)氐姆选⒗苯芳盁熑~生產(chǎn)造成嚴重的損失。2011年，由番茄環(huán)紋斑點病毒TZSV引起的病害在滇南、滇中煙區(qū)廣泛發(fā)生，部分煙區(qū)大田發(fā)病率在3%?5%之間，重病田塊達到20%左右。2012年，云南紅河州瀘西縣由于TZSV侵染番茄造成5333.3hm2的番茄絕收，給當?shù)氐姆焉a(chǎn)造成了極大的損失。
[0003]目前針對番茄環(huán)紋斑點病毒的檢測主要有電鏡觀察法、分子生物學(xué)方法、血清學(xué)方法，它們都需要昂貴的儀器(PCR儀、電鏡等)，且較為費時。環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一種先進的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等溫條件(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)，通過突光染色的方法在數(shù)分鐘內(nèi)即可 觀察結(jié)果。該法不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。LAMP是一種嶄新的DNA擴增技術(shù)，具有簡便、快速、特異性強等特點，目前已廣泛應(yīng)用于人類或動植物的各種病毒、細菌等引起的疾病或病害的快速檢測和快速診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便、快速、特異性強的番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測方法、弓I物組及其應(yīng)用。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測弓I物組，包括外側(cè)弓I物對F3和B3、內(nèi)側(cè)弓丨物對FIP和BIP，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1 至 SEQ.1D.N0.4 的堿基序列。
[0006]番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測試劑盒，該試劑盒包括A試液，A試液為LAMP反應(yīng)體系，含有 RT-LAMP Mix (2X )、AMV-Bst 混合液、RNase-Free Water、RT-LAMP 檢測引物組。[0007]該試劑盒每劑A 試液含 RT-LAMP Mix (2X ) 12.5 μ 1、AMV-Bst 混合液 L 5 μ 1、RNase-Free Water2.8 μ 1、RT-LAMP 檢測引物組 6.2 μ 1，其中 FIP 和 BIP 引物各 2.5μ 1，終濃度均為I μ M ;F3和B3引物各0.6 μ 1，終濃度均為0.25 μ M ;引物F3、B3、FIP和BIP分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
[0008]該試劑盒還包括B試液和C試液；B試液含番茄環(huán)紋斑點病毒RNA，作為陽性對照；C試液為去離子水，作為陰性對照。
[0009]番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測方法，利用RT-LAMP檢測引物組，在60_63°C恒溫反應(yīng)條件下，進行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)30-120min，擴增完成后80°C再反應(yīng)lOmin，然后利用瓊脂糖凝膠電泳或熒光染色，鑒定植株樣品是否感染番茄環(huán)紋斑點病毒；RT-LAMP檢測弓I物組包括外側(cè)弓I物對F3和B3、內(nèi)側(cè)弓I物對FIP和BIP，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
[0010]夕卜側(cè)引物對與內(nèi)側(cè)引物對的濃度比例為1:4。
[0011]外側(cè)引物對與內(nèi)側(cè)引物對的濃度分別為0.25μΜ和ΙμΜ。
[0012]上述番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測方法在煙草、辣椒、番茄或雜草上的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)，并根據(jù)番茄環(huán)紋斑點病毒L片段的基因序列設(shè)計了相應(yīng)的RT-LAMP檢測引物組，包括外側(cè)弓I物對F3和B3、內(nèi)側(cè)弓I物對FIP和BIP，由此發(fā)明了用于檢測番茄環(huán)紋斑點病毒的RT-LAMP檢測方法及試劑盒。應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法及試劑盒，僅需通過對煙草、辣椒、番茄及雜草等疑似感染植株樣品進行RNA提取并進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，即可快速檢測出是否感染番茄環(huán)紋斑點病毒，方便基層快速、準確、簡便地進行病害診治，進而采取適當?shù)姆乐未胧瑴p少病害帶來的損失。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是不同反應(yīng)溫度條件下RT-LAMP擴增結(jié)果的電泳圖，圖中:M、DM2000標準分子量，1、健康煙草植株對照，2、601:，3、611:，4、621:，5、631:，6、641:，7、651:。
[0015]圖2是RT-LAMP靈敏性實驗電泳圖。
[0016]圖3是RT-PCR靈敏性實驗電泳圖。
[0017]圖4是綠如藍熒光染料檢測RT-LAMP擴增產(chǎn)物紫外燈下照射結(jié)果圖。
[0018]圖2至圖4中:M、DM2000標準分子量；1、健康煙草植株對照，2、1665ng/μ I，3U665X 10_1ng/y I, 4、1665 X 10_2ng/μ 1, 5、1665 X 10_3ng/μ 1, 6、1665 X 10_4ng/μ 1,7、1665Xl(T5ng/y 1，8、1665X l(T6ng/y 1，9、1665X l(T7ng/μ I。
[0019]圖5是不同反應(yīng)時間RT-LAMP擴增結(jié)果的電泳圖，圖中:M、DM2000標準分子量，1、健康煙草植株對照，2、30min, 3、40min, 4、60min, 5、80min, 6、IOOmin, 7、120min?！揪唧w實施方式】
[0020]實施例1番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP弓I物設(shè)計
[0021]根據(jù)NCBI上已報道的番茄環(huán)紋斑點病毒L片段的基因序列(EF552435，NC020026)，結(jié)合對番茄環(huán)紋斑點病毒的測序結(jié)果，利用VECTOR NTI alignX進行比對分析，選取基因序列保守區(qū)域5080-6000nt,利用在線引物設(shè)計軟件Primer Explorer V4設(shè)計引物，最后選取以下RT-LAMP檢測引物組:
[0022]外側(cè)引物對F3和B3，[0023]上游引物F3:CTCGGTTATTTTGTTAAACTCTTTG (見序列表 SEQ.1D.N0.1),
[0024]下游引物B3:TGAAATGGAGAATTTAGAAGTAGAC (見序列表 SEQ.1D.N0.2)。
[0025]內(nèi)側(cè)引物對FIP和BIP，
[0026]上游引物FIP:ACCTTCATGAAAATCAGGTATGGAA-TTCACTGACTTTCTTAGATTTAAGC (見序列表 SEQ.1D.N0.3),
[0027]下游引物BIP:CAACTGTTAAAGGGTGGCTGTTA-CTTGATGATGTCCGGAGAC (見序列表 SEQ.1D.N0.4)。
[0028]實施例2番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP反應(yīng)體系的建立
[0029]通過設(shè)置不同終濃度的外側(cè)(B3/F3)、內(nèi)側(cè)(BIP/FIP)引物配比，確定最優(yōu)組合為 0.25“]?:14]\1;溫度(601:、611:、621:、631:、641:、651:，結(jié)果見圖 1)，反應(yīng)時間(30min、40min、60min、80min、100min、120min,結(jié)果見圖5),優(yōu)化獲得最佳的反應(yīng)參數(shù),從而建立番茄環(huán)紋斑點病毒的檢測體系。優(yōu)化的反應(yīng)體系(25μ I)見表I。
[0030]表I優(yōu)化的番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP反應(yīng)體系
【權(quán)利要求】
1.番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測引物組，其特征在于包括外側(cè)引物對F3和B3、內(nèi)側(cè)引物對FIP和BIP,它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列。
2.一種番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括A試液，A試液為 LAMP 反應(yīng)體系，含有 RT-LAMP Mix( 2 X ),AMV-Bst 混合液、RNase-Free Water,RT-LAMP檢測引物組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒每劑 A 試液含 RT-LAMP Mix (2X ) 12.5 μ 1、AMV-Bst 混合液 1.5 μ 1、RNase-FreeWater2.8 μ 1、RT-LAMP檢測引物組6.2 μ I，其中FIP和BIP引物各2.5 μ I，終濃度均為I μ M ；F3和B3弓丨物各0.6 μ 1，終濃度均為0.25 μ M ;所述引物F3、Β3、FIP和BIP分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括B試液和C試液；Β試液含番茄環(huán)紋斑點病毒RNA，作為陽性對照；C試液為去離子水，作為陰性對照。
5.一種番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測方法，其特征在于:利用RT-LAMP檢測引物組，在60-63°C恒溫反應(yīng)條件下，進行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)30-120min，擴增完成后80°C再反應(yīng)lOmin，然后利用瓊脂糖凝膠電泳或熒光染色，鑒定植株樣品是否感染番茄環(huán)紋斑點病毒；所述RT-LAMP檢測引物組包括外側(cè)引物對F3和B3、內(nèi)側(cè)引物對FIP和BIP，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測方法，其特征在于:所述外側(cè)弓I物對與內(nèi)側(cè)引物對的濃度比例為1:4。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測方法，其特征在于:所述外側(cè)引物對與內(nèi)側(cè)引物對的濃度分別為0.25 μ M和I μ M。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述番茄環(huán)紋斑點病毒RT-LAMP檢測方法在煙草、辣椒、番茄或雜草上的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/70GK103436636SQ201310351007
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月13日
【發(fā)明者】李戰(zhàn)彪, 秦碧霞, 蔡健和, 徐鵬超, 韋學(xué)平, 周文亮, 林北森 申請人:廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所