亞麻脂肪酸脫氫酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種能夠在哺乳動物中表達的亞麻脂肪酸脫氫酶基因(FAD3)及其應(yīng)用，所述基因包含SEQ?ID?NO.1的核苷酸序列或者與其互補的核苷酸序列。本發(fā)明的亞麻脂肪酸脫氫酶基因序列能促進細胞內(nèi)n-6脂肪酸向n-3脂肪酸的轉(zhuǎn)化。
【專利說明】亞麻脂肪酸脫氫酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】中的基因工程技術(shù)，具體涉及一種亞麻脂肪酸脫氫酶基因密碼子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酸(fatty acid)是指一端含有一個羧基的長的脂肪族碳氫鏈，多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids:PUFAs)含有超過一個(C = C),碳骨架大于18個碳原子的脂肪酸，是組成人體必需的物質(zhì)，對人體健康非常重要。根據(jù)雙鍵的位置不同，將多不飽和脂肪酸分為:《 -6PUFAs和《 -3PUFAs。? -6PUFAs包括、-亞麻酸(Y -LA)、花生四烯酸(AA)、亞油酸(18: 2n-6)等?！禵3PUFAs包括a -亞麻酸(a -LA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等?！禵3去飽和酶基因能夠把(0-6PUAFS轉(zhuǎn)化為《_3PUAFs，對生物體脂肪酸代謝起到關(guān)鍵作用，包括fatl、FAD3、FAD7、FAD8等，雙鍵引入的位置在第15-16個碳原子之間，又可將此類酶稱為A 15去飽和酶。由于植物中?-3PUFAs含量異常的高，說明《_3脂肪酸去飽和酶在植物中的活性相當(dāng)高；而哺乳動物體內(nèi)缺乏《_3脂肪酸去飽和酶，自身不能催化合成《_3PUFAs，所以將植物的《-3脂肪酸去飽和酶基因轉(zhuǎn)到哺乳動物中，也許可以得到活性更高的《_3脂肪酸去飽和酶，更加有效的將《-6PUFAs轉(zhuǎn)化為《-3PUFAs。將《_3脂肪酸去飽和酶基因轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞中，亞油酸(18: 2n-6)轉(zhuǎn)化為亞麻酸(18: 3n-3)，豐富的亞麻酸(18: 3n_3)可以在哺乳動物自身的去飽和、鏈延長酶的作用下合成EPA(20: 5n-3)和DHA(22: 6n_3);進而提高o -3PUFAs的整體水平。
[0003]2009 年，日本 Kazuhiro Saeki 研究小組克隆了紅亞麻(scarlet flax)的 FAD3B基因，通過人源化改造的FAD3B基因轉(zhuǎn)染牛肌肉衛(wèi)星細胞后進行成脂誘導(dǎo)；發(fā)現(xiàn)hFAD3轉(zhuǎn)基因脂肪細胞系中亞麻酸(18: 3n-3)(增幅0.3% )、DPA(22: 5n_3)(增幅1.5% )與DHA(22: 6n-3)(增幅2.1%)的水平明顯增加，亞油酸(18: 2n_6)水平顯著下降3%，)-6與《-3PUFAs比值由2.6最低降至1.57 ;并且由對照組細胞與轉(zhuǎn)基因細胞克隆形成的胚胎無形態(tài)學(xué)上的差異，并且克隆的囊胚率相同。
[0004]以上研究說明，植物源性的去飽和酶基因在動物體內(nèi)是可以發(fā)揮去飽和酶活性改變脂肪酸的組成，而且沒有表現(xiàn)出影響機體正常生理功能的征兆。然而，植物源性的基因通常難以在哺乳動物中表達并發(fā)揮作用，因此如何對基因序列進行優(yōu)化，使得其能夠在哺乳動物中發(fā)揮作用是本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問題，在進行密碼子優(yōu)化過程中面臨諸多挑戰(zhàn):首先是如何獲得能夠表達的基因序列，其次，考慮外源基因mRNA的穩(wěn)定性和mRNA 二級結(jié)構(gòu)對翻譯效率的影響，優(yōu)化的同時一定要避免阻礙表達的特殊的mRNA的二級結(jié)構(gòu)的形成。上述挑戰(zhàn)阻礙了對基因序列的優(yōu)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種能夠在哺乳動物中表達的亞麻脂肪酸脫氫酶基因，所述基因包含SEQ ID N0.1的核苷酸序列或者與其互補的核苷酸序列。
[0006]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，所述的亞麻脂肪酸脫氫酶基因還包括酶切位點，所述的酶切位點位于sEQ ID N0.1的核苷酸序列或者與其互補的核苷酸序列的兩，優(yōu)選的，所述的酶切位點分別是ECORl和BamHl。
[0007]在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及含有上述亞麻脂肪酸脫氫酶基因的表達載體。
[0008]在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及上述載體在制備轉(zhuǎn)基因哺乳動物或轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞中的應(yīng)用。
[0009]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的載體用于哺乳動物或哺乳動物細胞中降低w-6與《-3的比值。
【具體實施方式】
[0010]一、FAD3基因人源化片段的合成
[0011 ] CCGGAATTCttcaaaactgtggctctgcaggaccaaactATGTCCCCTCCCAACTCCATGTCCCCCACCACCAACGGCAACGGTGTGGCTATGAATGGGGCCAAGAAGCAGCTGGATTTTGACCCCTCCGCTGCCCCCCCCTTCAAGATTGCCGACATCCGCGCTGCCATCCCCCCCCACTGCTGGGTGAAGAACCCCTGGCGCTCCCTGTCCTACGTCCTGAGAGACCTGCTGGTCATCCTGTCCTTCGCCGTGGCGGCTGCCAAGCTGGACTCCTGGACTTTCTGGCCCCTGTACTGGGTGGCTCAGGGCACCATGTTCTGGGCCGTCTTTGTGCTGGGCCACGACTGTGGCCATGGCTCCTTCTCCGACATCTGGCTGCTGAACAACGTGATGGGCCACATCCTGCACTCCTCCATCCTGGTGCCC T ACCATGGCTGGAGAATCTCCCACAAGACCCACCACCAGAACCACGGCAATGTGGAGAA G GATGA G TCCTGGGTGCCTCTGCCCGAGAAGGTGTACAAGTCCCTGGACACCTCCACTAA G TTCA T GCGCTTCACCATCCCTCTCCCCATGTTTGCTTATCC T ATCTACCTGTGGACCCGTTCCCCCGG CAAGAAGGGCTCCCACTTCAACCCCTACTCCGACCTGTTCGCCCCCAACGAGCGCGCAGCGGTCCTGATCTCCACCCTGTGCTGGACCGCCATGGCCCTGCTCCTG T GCTACTCCTCCTTCATCTACGGCTTCGCTCCCGTCCTGAAGATCTACGGCGTGCCTTATCTGA TCTTCGTGGC CTGGCTGGGACATGGTGACCT ACCTGCACCACCACGGC T ACGAGCAGAA G CTG C CCTGGTACAGAGGCAAAGAGTG G T C CTAC CTGCGC G G CGGCCTGACCACCGTGGACC GCG ATTACGGCGTCATCAACAACATCCACCACGACATTGGCACCCACGTCATCCACCA C C T CT T CCCTCAGAT G CCCCAC T ATCACCTGGTGGAGGCCACTCAGGCAGCCAAGCA CGT GCTG G G CAA G T ACTACAGAGAGCCCAAGAAATCCGGGCCTTTCCCCTTCCACCTGTTTGGGTAC C TG G TGC G CTC C C T GG G C G AGGATCACTACGTGAGCGACACCGGCGAC G TCG T GTT CTATCAGTCTGA C CC C CACA T T CCCAAGTTCCGCACCAGCTCCGCCACCACCAAGTCCAAGTCCAGCTGAtgatatttggctctgatatatgcaggctgtttatcttgtcctttgttcgtttctttctcccagaaacaaattctctgtttctatgtttctctgtctctcccgcccccagctttctttctgagGGATCCGCG
[0012]其中包括F AD3人源化的序列(下劃線部分)，5UTR和3’UTR，兩端分別加有ECORl和BamHl酶切位點及保護堿基。將此序列送至takara公司，進行人工合成。
[0013]二、表達載體構(gòu)建
[0014]1、質(zhì)粒提取
[0015]將合成的FAD3基因連接到PMDlOT-Simple載體中，挑取穿刺菌加入到LB液體培養(yǎng)基中37°C搖菌14-16h。
[0016]質(zhì)粒提取方法具體步驟如下:[0017]收集菌液于EP管中，5000rpm離心lmin，棄去上清，加入150 U I重懸液，充分震蕩；加入250 u I裂解液，反復(fù)顛倒混勻；加入350 u I中和液，反復(fù)顛倒混勻；14，OOOrpm離心5min ;將上清移至吸附柱中，14，OOOrpm離心lmin,棄去廢液；加入500 U I洗滌液，14，OOOrpm離心lmin，棄去廢液，并重復(fù)I次；再次離心離心柱_收集管組合lmin，以使殘留的清洗液充分揮發(fā)。小心地將小柱轉(zhuǎn)入干凈的1.5ml離心管，加50ul無R N A酶水到小柱中央，室溫孵育Imin后，14，OOOrpm離心lmin。丟棄小柱，將裝有FAD3基因片段的洗脫液保存于_20°C。
[0018]2、FAD3片段回收
[0019]FAD3基因通過ECORl和BamHl雙酶切，酶切體系如下:
【權(quán)利要求】
1.一種能夠在哺乳動物中表達的亞麻脂肪酸脫氫酶基因(FAD3)，所述基因包含SEQ IDN0.1的核苷酸序列或者與其互補的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞麻脂肪酸脫氫酶基因，所述的亞麻脂肪酸脫氫酶基因還包括酶切位點，所述的酶切位點位于SEQ ID N0.1的核苷酸序列或者與其互補的核苷酸序列的兩，優(yōu)選的，所述的酶切位點分別是ECORl和BamHl。
3.含有上述亞麻脂肪酸脫氫酶基因序列的表達載體。
4.上述載體在制備轉(zhuǎn)基因哺乳動物或轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述 的英語，所述的載體用于哺乳動物或哺乳動物細胞中降低《-6與《-3的比值或者促進細胞內(nèi)n-6向n-3脂肪酸的轉(zhuǎn)化。
【文檔編號】C12N15/63GK103451205SQ201310344833
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月3日
【發(fā)明者】李光鵬, 左永春, 魏著英, 扈廷茂 申請人:內(nèi)蒙古大學(xué)