專利名稱：能產(chǎn)生有用種子的油料種子作物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能產(chǎn)生具有改變過的氨基酸組成和脂肪組成的有用種子的油料種子作物，以及一種制備這種作物的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及帶有被引入的種子蛋白的反義基因的油料種子作物以及制備這種作物的方法。
這里所用“油料種子作物”一詞是指用于從其種子中獲取油類(脂肪)的作物。這種作物被廣泛栽培，作為食用油的來源，如油菜子油和芝麻油，或是作為工業(yè)上作用的各種油類的來源。例如，其種子中脂類含量約為60%的蕓苔屬(Brassica)植物在世界上很多地方都有栽培。油料種子餅粉中含有高蛋白，被用作飼料和肥料。
然而，已知油菜子油含有一種對人體有害的芥子酸，還知道蕓苔屬油餅粉中含有對牲畜有毒性作用的glycocynolate。因此，為了通過常規(guī)育種方法來降低這類有害成份的含量而付出了巨大努力。結(jié)果，在加拿大育成了“雙低”變種，該變種的芥子酸含量不到其種子油中種子重量的2%，而且1克餅粉中g(shù)lycocynolate的含量少于30微摩爾。
近來，油類的消費一直在增加，與之相關(guān)的市場也開始需求油類的多樣化。這樣，就需要具有高脂類含量和有價值的脂肪酸成份的油料種子來滿足各種目的。例如，作為食用油，需要含有微量芥子酸和低水平飽和脂肪酸的油料種子，因為這種油有益于人體健康。另一方面，工業(yè)上則需要含有大量芥子酸、中鏈脂肪酸和/或多不飽脂肪酸。作為餅粉，則要求它含有大量的蛋白質(zhì)或必需的氨基酸。
要通過常規(guī)和雜交育方法育成新的理想品種是很麻煩的，而且，以這種方法為特殊目的而改變有價值的成份是很困難的。常規(guī)的雜交育種方法，包括艱苦而費時的過程，以期從各種變種中篩選出所需的品種并建立純系。為了從各種變種中得到理想的品種，還采用了其它方法，如γ-射線輻射和體細(xì)胞克隆變異。但是，通過上述方法得到的品種通常不能用于栽培，因為，除目的基因之外，品種里的其它其因通常也會同時突變。
相反，將有關(guān)基因工程技術(shù)的方法用于特別制備理想的品種是有利的，因為此類方法可以僅改變特定基因并將目的基因引入作物。更具體地說，這種方法包括以下步驟1)分離編碼理想表型的基因;2)修飾該基因，以使其能夠在理想的組織或部位上表達(dá);3)將該基因引入作物使其表達(dá)理想表型。
上述步驟1)中編碼理想表型的基因的例子包括編碼與種子儲存化合物的生物合成有關(guān)的酶的基因和儲存蛋白基因。種子儲存化合物主要是脂類、蛋白質(zhì)類和碳水化合物，其含量隨著植物種類而變化。已經(jīng)知道，這些化合物是在胚發(fā)生期間積累的，而且，這些化合物的生物合成途徑也是密切相關(guān)的。更具體地說，這些化合物是由完全相同的起始物質(zhì)合成的。就蕓苔屬而言，已知脂類和蛋白質(zhì)積累在種子里，但是與儲存脂類生物合成有關(guān)的所有酶類均未分離出來。已經(jīng)從擬南芥層(Arabidopsis)(Plant Phys.，87，859-866，1988;plant Mol.Biol.，11，805-820，1988)、蘿卜(Raphanus Sativus)(Plant Mol.Biol.，20，467-479，1992;Gene，99，77-85，1991)，蕓苔(Brassica napus)(Plant Mol.Biol.，5，191-201，1985;Plant Mol.Biol.，14，633-635，1990)等植物中分離出了編碼蕓苔素(napin)或十字花科素(curuciferin)(儲存蛋白)的基因。
上述步驟2)是篩選和構(gòu)建“DNA部分”，它是一種給定儲存蛋白質(zhì)的反義基因(反義寡核苷酸)，當(dāng)其被引入作物時能夠抑制編碼所述特定蛋白質(zhì)的基因表達(dá)并改變作物的表型。就蕓苔(B.napus)而言，由蕓苔素啟動子驅(qū)動的由DHFR基因和蕓苔素基因組成的嵌合基因表達(dá)的例子已有報導(dǎo)(S.E.Radde，Theor，Appl.Genet.，75，685-694，1988)，但是，引入儲存蛋白的反義基因的例子還未見報導(dǎo)。就引入反義基因而言，有這樣一則報導(dǎo)，當(dāng)把ADP-葡萄糖-焦磷酸化酶的反義基因(馬鈴薯中的一種淀粉合成酶)引入馬鈴薯以后，淀粉數(shù)量減少，而蔗糖和某些蛋白質(zhì)的數(shù)量增加(EMBO J.，11，1229-1238，1992)。
上述步驟3)是一個將理想基因引入作物的過程。就蕓苔而言，已知一種由通過電擊法導(dǎo)入了目的DNA的原生質(zhì)體再生植株的方法(Plant Science，52，111-116，1987)。再生通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入了目的DNA的植株的方法也是已知的(日本公開專利出版號1-500718)。
為了提高油料種子作物，如蕓苔層作物的儲存蛋白質(zhì)含量并改變其氨基酸組成，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究。研究的結(jié)果是，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)通過導(dǎo)入種子儲存蛋白的反義基因，可以改變蕓苔屬作物種子的氨基酸組成。令人驚奇的是，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)通過引入這樣一種反義基因還可改變種子中脂肪酸的組成和必需氨基酸的組成。本發(fā)明就是基于上述發(fā)現(xiàn)。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用種子儲存蛋白的反義基因轉(zhuǎn)化的油料作物，用于制備這種轉(zhuǎn)化的油料種子作物的方法，用于該方法上的重組載體，以及由轉(zhuǎn)化的作物得到的種子。
下面將對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
如上所述，任何可以從其種子里提取油(脂肪)的油料種子作物均可在本發(fā)明中使用。油料種子作物的例子有油菜子、芝麻、Tougoma(hima)、Egoma、花生、橄欖、大豆、玉米、亞麻、向日葵、和油棕。比較理想的油料種子作物有油菜子、大豆和玉米，本發(fā)明中最理想的作物是油菜子。
種子儲存蛋白不受限制，但最好使用蕓苔素和/或十字花科素。這兩種蛋白質(zhì)是蕓苔屬植物種子里的主要蛋白質(zhì)。油菜里的蕓苔的總種子蛋白中分別有20%和60%是蕓苔素和十字花科素。蕓苔素是由蕓苔屬植物合成的1.7S儲存蛋白質(zhì)的總稱，它包括幾個部分不同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。編碼這些蛋白質(zhì)的基因形成由20或更多基因組成的基因族。任意兩種植物之間這些基因的同源性均為90%或更高。十字花科素是蕓苔中12S儲存蛋白的總稱，包括4種亞單位對。編碼這4種亞單位對的基因的同源性比蕓苔素的低，即使同種的兩個基因之間的同源性也只有40%或更低。
在本發(fā)明中，將這種種子儲存蛋白的反義基因?qū)胱魑?。種子儲存蛋白的任何反義基因均可使用。不過，以采用具有與目的植物的一內(nèi)源基因有高同源性的DNA序列為宜，因為當(dāng)它們的同源性高時，由導(dǎo)入的反義DNA轉(zhuǎn)錄的反義RNA可有效地與該內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄子雜交。反義基因可以同目標(biāo)基因CDNA或基因組DNA的全長或局部相一致。當(dāng)把蕓苔來反義基因用于本發(fā)明中時，首先以蕓苔等的基因組DNA為模板通過PCR法分離蕓苔素基因。例如，為了分離蕓苔素基因和十字花科素基因，可以采用蕓苔的基因組DNA通過PCR法將這些基因擴(kuò)增，對蕓苔素基因來說，基于由RaskL.報導(dǎo)的大約為1111-1783 bp的napA堿基序列(J.Biol.Chem.，26212196-12201，1986);對十字花科素基因而言，基于由A.J.Ryan報道的680～1278bp的CruA堿基序列(Nuc.AcidRes.，17，3584，1989)。PCR是擴(kuò)增目的DNA區(qū)域的方法，通過重復(fù)加熱使模板變性、引物和模板退火和采用熱穩(wěn)性聚合酶使DNA延長等步驟來實現(xiàn)(Saiki，Science，239，487-491，1988)。更具體地說，可以按照在Mol.Gen.Genet.(211，27-34，1988)中所述的方法從Westar(B.napus CV.)等的葉子里分離基因組DNA，并可以把約300ng的基因組DNA用作模板。加熱變性模板以分離單股正鏈和單股負(fù)鏈、引物和模板退火、以及采用熱穩(wěn)性聚合酶合成DNA的步驟被重復(fù)20～30次，以擴(kuò)增與蕓苔素基因互補(bǔ)的DNA。擴(kuò)增的DNAs有90%或更多與蕓苔素的轉(zhuǎn)錄區(qū)相符合，25%與十字花科素的轉(zhuǎn)錄區(qū)相符合。
其次，構(gòu)建了一種帶有反義基因的表達(dá)載體。例如，一種表達(dá)載體，必需具備特定的啟動子，以便該反義基因可在蕓苔種子里充分表達(dá)。而且，最好采用能夠在與編碼儲存蛋白的內(nèi)源遺傳基因同一時間、同一地點表達(dá)反義基因的表達(dá)載體，以便有效減少不需要的蛋白質(zhì)數(shù)量。例如，當(dāng)把編碼蕓苔素的反義基因用于轉(zhuǎn)化作物時，可以通過PCR法以蕓苔等的基因組DNA為模板獲得啟動子，而以與napA堿基序列上的約1～1145bp的序列一致的寡核苷酸作為引物。當(dāng)把十字花科素的反義基因用作插入基因時，可以采用十字花科素基因的啟動區(qū)，并把上述cruA序列的大約1～709bp的序列擴(kuò)增，以便使用。在使用之前證實由PCR法擴(kuò)增的啟動子片段的功能是重要的，因為假基因的啟動子是不能用的。
表達(dá)載體可能還包括一個終止子，以便有效地終止基因的轉(zhuǎn)錄，并穩(wěn)定所產(chǎn)生的RNA。任何能夠在植物細(xì)胞中起作用的終止子均可使用。例如，可以使用胭脂堿合成酶基因NOS的終止子(pBI221，Jefferson，EMBOJ.，6，3901-3907，1987)。
轉(zhuǎn)化植物的方法的例子有土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，電擊法，等等。對土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法來說，pLAN系列的質(zhì)粒較適宜(Plant Cell Rep.，10，286-290，1991)，而對電擊法來說，pUC系列的質(zhì)粒較適宜。這種質(zhì)粒含有的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因可作為選擇標(biāo)記。質(zhì)?？赡苓€包括2或多個從下列基因中選擇的外源基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，β-葡萄糖苷酸酶基因等;而且最好把外源基因中的一個用作篩選轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。最理想的選擇標(biāo)記是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。在電擊法中，可使用含有一個選擇標(biāo)記基因或其它外源基因的一個質(zhì)粒，或使用兩個質(zhì)粒，其中的一個含有選擇標(biāo)記基因，另一個含有其它的外源基因。
通過把這種質(zhì)粒導(dǎo)入油料種子作物的下胚軸或原生質(zhì)體可制備出種子儲存蛋白量改變了的油料種子作物。
土壤介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可按照在日本公開(Kohyo)專利出版號1-500718中公開的方法進(jìn)行。
在電擊法中，來自蕓苔屬的原生質(zhì)體可按如下方法制備。將在無菌條件下培養(yǎng)的幼芽用含有一種酶如纖維素酶、果膠酶等的等滲溶液在25～30℃處理5～20小時，使細(xì)胞壁降解。處理之后，過濾處理液以除去未消化的細(xì)胞，將濾液離心以得到提純的原生質(zhì)體(日本專利申請?zhí)?-276069)。在電擊之前，將得自B.napus cv.Westar的6×105細(xì)胞/ml的原生質(zhì)體和包括蕓苔素反義基因或十字花科素反義基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(例如，40-80μg/ml)的DNA表達(dá)載體(如，40-80μg/ml)懸浮于液體介質(zhì)(如緩沖液)中，這種介質(zhì)含有30-200mM KCL，0-50mM Mgcl，以及0.2-0.6M的甘露醇。然后，通過電脈沖把載體導(dǎo)入原生質(zhì)體。電脈沖處理的適宜條件是由100～1000μF的電容器所得到的200-1000V/cm的直流脈沖初級電壓，并施以1-30毫秒的脈沖寬度。可將電擊過的原生質(zhì)體以105細(xì)胞/ml的濃度懸浮于KM培養(yǎng)基(Planta，126，105-110，1975)中，KM培養(yǎng)基含有0.05-0.5mg/l的2，4-D，0.02-0.5mg/l的NAA，0.1-2.0mg/l的BAP，和0.4M的葡萄糖，并在25℃在黑暗中培養(yǎng)該混合物。培養(yǎng)3-4周之后，可形成0.5～1mmΦ的菌落。如果被導(dǎo)入的質(zhì)粒含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因作為選擇標(biāo)記，可在培養(yǎng)1周之后加入10-50μg/ml的卡那霉素，以便有效地篩選轉(zhuǎn)化的菌落。將該菌落轉(zhuǎn)移到含有10-50μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基上，如含有0.5-2mg/l2，4-D，0.1-0.5mg/l BAP，1-5%山梨醇，1-5%蔗糖，0.5-2g/l酪蛋白水解物(CH)和0.5-1%瓊脂糖的MS(Murashige andskoog，1962)固體培養(yǎng)基，在光照(1000-4000Lux)條件下，在25℃培養(yǎng)2-4周以后，得到直徑為3-5mm的綠色愈傷組織。然后，再在不含卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得到的愈傷組織，如在含有0.01-0.1mg/lNAA，0.5-2mg/lBAP，1-5%山梨醇，0.5-2%蔗糖，0.05-0.5mg/lCH和0.5-1%瓊脂糖的MS固體培養(yǎng)基中，在光照(1000-4000Lux)條件下在25℃培養(yǎng)，以得到再生的功芽。然后，把再生的幼芽放在根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如含有0.05-0.2mg/l NAA，0.01-0.05mg/l BAP，1-5%蔗糖和0.2%Gellight(Kelco，Divisionof Merck and Co.，Inc)的MS固體培養(yǎng)基。
可按照在Mol.Gen.Genet.(211，27-34，1988)中公開的方法從再生植株的葉子里提取基因組DNA。所得300ng基因組DNA通過PCR擴(kuò)增，以篩選含有種子儲存蛋白的反義基因的轉(zhuǎn)化子。當(dāng)把蕓苔素反義基因?qū)胧|苔屬植物時，把與napA基因(如上)上從第1-19bp位置之間的序列和NOS終止子上從第1579-1595bp位置之間的序列(5＇-GCATGACGTTATTTATG-3＇，pCaMVNEO;Fromm等，Nature，319，791-793，1986，SEQ ID No5)相一致的引物用于PCR擴(kuò)增。當(dāng)被導(dǎo)入的是十字花科素反義基因時，采用與CruA基因(如上)從第1bp至上游第18bp之間的序列和NOS終止子的一部分相一致的引物。含有種子儲存蛋白的反義基因的再生植株，在馴化以后在溫室里栽培。栽培3-6個月后，轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生種子。采Southern吸印雜交分析(Southern，J.Mol.Biol.，98，503-517，1975)可以證實導(dǎo)入基因的存在。例如，把按照Wolbot等人的方法(Mol.Gen.Gent.，211，27-34，1988)制備的10μg基因組DNA放在100μl反應(yīng)混合物(TOYOBO.Co)中，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦附到?。所得溶液用乙醇沉淀。所得沉淀?0%的乙醇洗滌，干燥，溶于10μl蒸餾水中。向所得溶液中加入2μl染料(Molecular Cloning)。然后，采用0.8%的瓊脂糖凝膠(FMC SEAKEM GTG瓊脂糖，TBE緩沖液)對該溶液電泳。按照在“Direction of AmershamHybond N Mebrane”中所述方法，對分離的片段進(jìn)行部分酸水解和堿變性處理，以便把這些片段轉(zhuǎn)移到hybond硝酸纖維素膜上。該膜在含有50%甲酰胺，4×SSCP(Molecular Cloning)、1% SDS、0.5%脫脂乳，0.25mg/ml牛精液DNA的溶液中，在42℃預(yù)雜交1小時以上。按下述方法可獲得探針。把用于轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的質(zhì)粒按上述方法用適當(dāng)?shù)南拗菩悦附到?。所得溶液用乙醇沉淀。所得沉淀?0%的乙醇洗滌，干燥，在5μl蒸餾水中溶解。向該溶液中加入1μl染料(Molecular Cloning)。然后用0.8%的瓊脂糖凝膠(FMC SEAKEM GTG 瓊脂糖，TBE緩沖液)對該溶液進(jìn)行電泳，以便回收含有反義基因的DNA片段或其部分片段(Moleculovr Cloning)。得到的片段用作探針。采用多引物標(biāo)記試劑盒(Amersham)用[α32P]dCTP標(biāo)記該DNA片段(25ng)。把熱變性DNA片段(探針)加入雜交溶液(0.1g葡聚糖硫酸酯/ml預(yù)雜交溶液)中。將從上述預(yù)雜交溶液中取出的預(yù)雜交膜浸入雜交溶液中，并在42℃靜止過夜。然后，把該膜在100ml2×SSC+0.1%SDS中處理15分鐘，兩次，并振動，用100ml0.1×SSC+0.1%SDS洗滌兩次，每次15分鐘，進(jìn)行放射性自顯影處理以檢測專門與探針雜交的帶。
種子儲存蛋白反義基因的表達(dá)可通過對用標(biāo)準(zhǔn)方法提取的總種子蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)證實。例如，總蛋白質(zhì)首先在100μl種子樣品緩沖液(62.5mMTris-HCL pH6.8，2%SDS，10%甘油，5%2-巰基乙醇，0.0001%溴酚藍(lán))中提取，然后，通過SDS-PAGE(Nature，227，680-685，1970)分離15μg蛋白質(zhì)。所得凝膠用含有0.25%考馬斯亮藍(lán)、45%乙醇和10%乙酸的溶液染色，然后浸泡在含有乙醇、乙酸和水(25∶8∶65)的脫色液中脫色。把蕓苔素反義基因用于轉(zhuǎn)化蕓苔時，可在4KD和9KD處分別檢測到與蕓苔素的α鏈和β鏈相應(yīng)的帶。當(dāng)被導(dǎo)入的是十字花科素反義基因時，可在約20KDa和約30KDa處分別檢測到與十字花科素的亞單位對的3或4條α鏈和3或4條β鏈相應(yīng)的帶。通過比較這些譜帶與未轉(zhuǎn)化植株譜帶的寬度，可推測蕓苔素或十字花科素的含量，并進(jìn)而證實蕓苔素或十字花科素的反義基因的表達(dá)程度。
根據(jù)上述方法，獲得了本發(fā)明的油料種子作物，其氨基酸組成和/或脂肪酸組成在營養(yǎng)方面有所改進(jìn)。例如，可獲得本發(fā)明的營養(yǎng)油料種子作物，其不飽和脂肪酸，如亞油酸或亞麻酸和必需氨基酸、如賴氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸的含量均得以提高。
通過以下實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。這些實例只是象征性的，不應(yīng)將其誤認(rèn)為是對本發(fā)明任何一方面的限定。
附圖中

圖1表示在例1和8中制備的載體的構(gòu)建。
圖2表示總種子蛋白含量，其中，W表示自然存在的種子，B.napus cv.Westar，T表示轉(zhuǎn)化的種子。
圖3表示種子中脂肪酸的組成，其中，○表示自然存在的種子，B.napus cv.Westar，而●表示轉(zhuǎn)化的種子。
例1載體pNAKM的構(gòu)建(圖1)采用以napA基因序列(J.Biol.Chem.，262，12196-12201，1987)為基礎(chǔ)的引物，通過PCR法擴(kuò)增蕓苔素啟動子區(qū)和部分蕓苔素基因。首先，通過CTAB方法(Focus，12，13-15，1989)從B.napusCV.Westar的葉子中提取基因組DNA。具體地說，把適量的液態(tài)氮加進(jìn)裝有大約5g葉子的研缽中，并用研棒把葉子研碎。隨后，加入15mlDNA提取液(2%CTAB，1.4M Nacl，0.2% 2-巰基乙醇，20mMEDTA和100mMTris-HCL(PH8))，并進(jìn)一步研磨。將提取液轉(zhuǎn)移到聚丙烯管中，在65℃放置1小時以上，并偶爾伴以振動。將等體積的含有苯酚(用10mMTris-HCL(PH8)和1mM EDTA)、氯仿和異戊醇(25∶24∶1)的溶液加入上述提取液中并混合。該混合物以15000rpm的速度離心15分鐘(KUBOTA，KR-20000T)。將上清液轉(zhuǎn)移到另一只管中，加入2/3體積的異丙醇。將混合物在室溫下放置30分鐘以上，并以14000rpm的速度離心20分鐘。除去上清液，得到沉淀物。加入適量70%乙醇洗滌沉淀物，然后將沉淀物干燥。再把沉淀物溶于750μl含有1g/ml氯化銫的TE(10mM Tris-HCL(Ph8.0)和1mMEDTA)中。向該溶液中加入一滴10mg/ml的溴化乙錠，并以100000rpm的速度離心過夜(BECKMAN，TL-100)?；馗膸Р糠郑谜〈继幚沓ヤ寤义V，轉(zhuǎn)移到透析膜中(Sanmitsu Pure Chemicals)并在水中脫鹽。在存在30mM乙酸鈉的情況下向透析膜中所得液中加入2.5體積的乙醇，在低溫下以15000rpm的速度將混合物離心15分鐘，回收基因組DNA。將回收的DNA溶于TE溶液中以得到1μg/ml的DNA溶液。
將基因組DNA(300ng)用于由PCR法擴(kuò)增蕓苔素啟動子區(qū)和蕓苔素編碼區(qū)。將napA基因上從第1-19bp的序列(J.Biol.Chem.，262，12196-12201，1987)(5＇-AAGCTTTCTTCATCGGTGA-3＇SEQ ID No.1)和與napA基因上從第1125-1145bp之間的21個bp互補(bǔ)的序列(5＇-CAAGATTAAAAACATACACGA-3＇SEQ ID No.2)用作擴(kuò)增蕓苔素啟動子區(qū)的引物;將napA基因上從第1111-1131bp之間的序列(5＇-CTCATCAATACAAACAAGAT-3＇SEQ ID No.3)和與napA基因上第1763-1783之間的20個bp互補(bǔ)的序列用作獲得蕓苔素編碼區(qū)的引物。PCR用DNA熱循環(huán)器(Perkin Elmer Cetus)、在按上述公司的Gene-Amp-Kit方法制備的混合物中進(jìn)行。
為了獲得蕓苔素啟動子區(qū)，將100μl的反應(yīng)混合物循環(huán)30次，一個循環(huán)包括變性步驟，在94℃持續(xù)1分鐘;退火步驟，在52℃持續(xù)2分鐘;延伸步驟，在72℃由熱穩(wěn)性聚合酶進(jìn)行3分鐘。為了獲得蕓苔編碼區(qū)，循環(huán)30次，一個循環(huán)包括變性步驟，在94℃持續(xù)1分鐘;退火步驟，在50℃持續(xù)2分鐘;延伸步驟，在72℃由熱穩(wěn)性聚合酶進(jìn)行3分鐘。采用瓊脂糖凝膠電泳對反應(yīng)混合物(1/20體積)進(jìn)行分析，檢測譜帶。一條在1.1KD處的帶相當(dāng)于啟動子，在0.7kb處的帶相當(dāng)于蕓苔素編碼區(qū)。
上述DNA片段(1.1kb和0.7kb)用乙醇沉淀，分別克隆在PUC質(zhì)粒的HincⅡ和SmaⅠ位點上(pNap，pNAS)。
然后，把所得到的pNAS(10μg)在緩沖液(100μlTOYOBO)中用XbaI和KpnI在37℃消化3小時，通過1%的Seakem GTG瓊脂糖(FMC)凝膠電泳進(jìn)行分級分離，電泳時采用1XTBE緩沖液(Molecular Cloning，Maniatis)(MUPID，Cosmobio，100V，30分鐘)。然后用0.5μg/l溴化乙錠對凝膠染色，并提取與蕓苔素編碼區(qū)相應(yīng)的條帶。將該條帶轉(zhuǎn)移至一透析膜中，并在4℃、120mA條件下電泳1小時，以回收DNA。將等體積的苯酚加入回收的DNA中，搖動混合物，得到雙相溶液。回收水相，并用氯仿對其做進(jìn)一步處理，以純化DNA片段。然后，用乙醇沉淀該DNA片段，并將沉淀溶于5μl水中。將所得溶液(1μl)和2μl用同樣方法由pNap制備的含有蕓苔素啟動子的溶液放在TAKARA連接試劑盒反應(yīng)混合物(30μl)中，在4℃連接，過夜。
將含有連接質(zhì)粒DNA(10μl)的混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)的感受態(tài)細(xì)胞DH5α(BRL)(Inoue，Gene，96，23-29，1990)。在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂糖培養(yǎng)基上篩選含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞菌落(Molecular Cloning)。通過堿性SDS法(Molecular Cloning)，從含有篩選出的菌落(LB培養(yǎng)基)的培養(yǎng)液(1ml)中制備DNA。制得的DNA(1/50體積)在10μl含有0.5μg/mlRNase的反應(yīng)混合物中，用1U的HindⅢ和KpnⅠ(TOYOBO)在37℃消化30分鐘。在對消化的DNA進(jìn)行凝膠電泳分級分離之后，篩選在凝膠上出現(xiàn)1.8KD片段的克隆。將含有具有部分蕓苔素基因的質(zhì)粒的克隆在反方向上與蕓苔素啟動子接合。
采用來自pBⅠ221(TOYOBO)的NOS區(qū)的終止子。
質(zhì)粒pBⅠ221(10μg)在緩沖液(120μl，TOYOBO)中用SacI在37℃溫度下消化過夜。所得DNA片段用苯酚和氯仿提純，用乙醇沉淀并溶解在20μl水中。所得溶液(8μl)用10μlTAKARA平端試劑盒處理，得到平端DNA片段。將平端DNA片段溶解在5μl水里，并把2μl的該溶液與1μl含有KpnI接頭(TOYOBO)的溶液混合，連接平端DNA片段，接頭使用的是TAKARA連接試劑盒。用KpnⅠ接頭連接的DNA片段波進(jìn)一步純化、回收、并溶于5μl的水中。所得溶液用EcoRⅠ和KpnⅠ處理，以獲得包括載體部分和NOS的末端部分的DNA片段。
由此得到的DNA片段(0.1μg)與具有部分蕓苔素反義基因和蕓苔素啟動子融合的DNA片段連接，得到pNAAS質(zhì)粒。該質(zhì)粒用于通過電擊法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。
按下述方法構(gòu)建了可用于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。通過用一個多克隆位點取代一結(jié)構(gòu)基因(35SP-GUS-NOST)由pLAN421制備出含有四環(huán)素抗性基因和壯觀霉素抗性基因作為大腸桿菌的選擇標(biāo)記，并含有胭脂堿抗性基因作為植物選擇標(biāo)記(Plant Cell Rep.，10，286-290，1991)的質(zhì)粒pKM424，用HindⅢ和EcoRⅠ消化。消化的質(zhì)粒用苯酚處理，并用乙醇沉淀，以提純DNA。用同樣的酶處理pNASS質(zhì)粒，得到含有蕓苔素啟動子和蕓苔素反義基因的DNA片段。將由pLAN421制得的DNA片段和帶有蕓苔素反義基因的DNA片段連接，獲得pNAKM。
將所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌(Agrobacte-rium，tumefaciens)EHAIO菌株。把EHA101的單菌落在YEB培養(yǎng)基(0.1%酵母抽提物、0.5%牛肉膏、0.5%胨和0.5%蔗糖(pH7.0))中培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物(1ml)加入含有25μg/ml卡那霉素(km)，12.5μg/ml氯霉素(cm)，25μg/ml壯觀霉素(Sp)和1μg/ml四環(huán)素(Tc)的新配YEB培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)5-6小時。所得培養(yǎng)物以4000rpm的速度離心5分鐘。所得沉淀加入20ml10mM的Tris-HCL(pH8)洗滌。將沉淀懸浮于400μlYEB培養(yǎng)基中，并將90μl的懸浮液與10μl含有10ngpNAKM的溶液混合，在-110℃放置5分鐘，在37℃放置25分鐘。向所得溶液中加進(jìn)400μl的YEB培養(yǎng)基，將混合物在30℃培養(yǎng)過夜。將所得培養(yǎng)物(50μl)放在含有50μg/mlKm、25μg/ml Cm、50μg/ml Sp和2μg/mlTc的YEB瓊脂糖培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)兩夜，以篩選含有質(zhì)粒的菌落(DNA Cloning)。用堿性SDS法(Molecular Cloning)從含有菌落之一YEB培養(yǎng)基中制備DNA，所得DNA在10μl含0.5μg/mlRNase反應(yīng)混合物中由1U的HindⅢ和EcoRⅠ(TOYOBO)在37℃消化30分鐘。在對該混合物進(jìn)行凝膠電泳之后，篩選在凝膠上出現(xiàn)2.1kb條帶的克隆。
實施例2 帶有蕓苔素反義基因的愈傷組織的轉(zhuǎn)化、篩選和再生。
B.napus cv.Westar的種子用10%的過氧化氫溶液處理25分鐘并干燥。處理過的種子在MS瓊脂糖培養(yǎng)基上在光照(1000-4000lux)下培養(yǎng)2-3周。將消過毒的下胚軸切成2-5mm長度，放在預(yù)培養(yǎng)基上(B5-維生素;Gamborg等Exp.Cell.Res.，50，151-158，1968)，并在有光地方培養(yǎng)過夜。含有MS瓊脂糖培養(yǎng)基的預(yù)培養(yǎng)基中含有1mg/12、4-D，3%蔗糖，以及0.7%瓊脂糖，它由消毒濾紙下面的煙草培養(yǎng)細(xì)胞BY-2覆蓋。將帶有pNAKM質(zhì)粒的土壤桿菌單菌落放在含有抗菌素的YEB液體培養(yǎng)基(5ml)中，在30℃培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物以3000rpm的速度離心10分鐘，沉淀用含有3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基洗滌一次，然后懸浮在同一種MS培養(yǎng)基中。向含有土壤桿菌的懸浮液中加進(jìn)預(yù)先培養(yǎng)的下胚軸，在25℃振蕩培養(yǎng)5-20分鐘。所得溶液用無菌紙巾過濾，除去過量的土壤桿菌并回收下胚軸。將這些下胚軸在上述預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3夜，使下胚軸感染土壤桿菌。然且將被感染的下胚軸轉(zhuǎn)移到消除培養(yǎng)基(含有維生素B5、1mg/l2、4-D，3%蔗糖，0.7%瓊脂糖和500mg/l羧芐青霉素(Cb)的MS瓊脂糖培養(yǎng)基)上并培養(yǎng)3天，抑制土壤桿菌的生長。
然后，把上述下胚軸轉(zhuǎn)移到第一選擇培養(yǎng)基(含維生素B5、3mg/l BAP、1mg/l玉米素、2%蔗糖、0.7%瓊脂糖、30mg/l Km，500mg/l Cb的MS瓊脂糖培養(yǎng)基)上并培養(yǎng)2周。結(jié)果，只有帶有pNAKM質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞生長并形成綠色愈傷組織。
此外，將下胚軸再轉(zhuǎn)移到第二選擇培養(yǎng)基(含有維生素B5、3mg/l BAP、1mg/l玉米素、1%蔗糖、0.7%瓊脂糖、30mg/l Km和500mg/l Cb的MS瓊脂糖培養(yǎng)基)上并培養(yǎng)3周。結(jié)果，轉(zhuǎn)化的愈傷組織進(jìn)一步生長。然后，僅把每個愈傷組織部分轉(zhuǎn)移到一培養(yǎng)基(含有維生素B5、3mg/l BAP、1mg/l玉米素、1%蔗糖、0.7%瓊脂糖和250～500mg/l Cb的MS瓊脂糖培養(yǎng)基)上發(fā)芽。再生的幼芽在用于細(xì)胞伸長的培養(yǎng)基(含有0.1mg/l BAP，250mg/l Cb和0.7%瓊脂糖的B5瓊脂糖培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上并馴化。
由再生植株制備的基因組DNA并以與導(dǎo)入的質(zhì)粒序列相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選含有蕓苔素反義基因的轉(zhuǎn)基因植株?；蚪MDNA是按照Mol.Gen.Genet.(Vol211，27-34，1988)中的方法制備的。將50-100mg卡那霉素抗性植株在緩沖液(15%蔗糖，50mMTris-HCL(pH8)，50mMNaEDTA，500mM Nacl)中研碎，通過離心分離細(xì)胞核部分。沉淀用洗滌劑液(1.5% SDS，20mM Tris-HCL(pH8)，10mMEDTA)處理，溶解的核成份用0.6倍體積的異丙醇沉淀，得到核酸。所得核酸用70%的乙醇洗滌并干燥，獲得基因組DNA。對這些DNA(300ng)進(jìn)行PCR處理。
將蕓苔素啟動子上第1～19bp之間的寡核甙酸(SEQ IDNo.1)和與NOS終止子上第1579-1595bp之間的序列互補(bǔ)的寡核苷酸(SEQIDNo.5pCa-MVNEO;Fromm，Nature，319，791-793，1986)用作引物。PCR反應(yīng)包括一個在94℃變性1分鐘的步驟，在45℃退火2分鐘的步驟，以及在72℃延伸3分鐘的步驟。在PCR擴(kuò)增之后，通過凝膠瓊脂糖電泳分析10μl反應(yīng)混合物，檢測擴(kuò)增帶。通過PCR法證實整合了導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)化植株在花盆中栽培。3-6個月后產(chǎn)生種子。
實例3 蕓苔素反義基因在成熟種子里表達(dá)的測定100μl用于蛋白質(zhì)分離的樣品緩沖液(62.5mMTris-HCL(pH6.8)，2%SDS，10%甘油)中加入半粒成熟的種子。種子在緩沖液中被研碎，對混合物離心。部分上清液(相當(dāng)于15μg蛋白質(zhì))通過SDS-PAGE根據(jù)分子量進(jìn)行分級分離。所得凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，然后脫色檢測蕓苔屬的含量。蕓苔素含量的變化是通過顯影分析(Ⅰmaging analysis system，MKSIPS)測量蕓苔素的帶與另一種蛋白質(zhì)，如十字花科素的帶之間相對值的變化而確定的。如果蕓苔屬的含量降低，則蕓苔素帶的量/十字花科素帶的量的比值降低。剩下的半粒種子放在種子培養(yǎng)基(含3%蔗糖的MS瓊脂糖培養(yǎng)基)上發(fā)芽。由萌發(fā)的籽苗制備基因組DNA，并按照在例2中所述PCR法進(jìn)行分析。證實了導(dǎo)入的基因遺傳到下一代。蕓苔素含量的降低與導(dǎo)入基因的存在有關(guān)。表1表示SDS-PAGE顯影分析結(jié)果與通過PCR法證實的導(dǎo)入基因的存在之間的關(guān)系。Westar 1-8是從未轉(zhuǎn)化的B.napuscv.Westar成熟種子獲得的對照，以處理轉(zhuǎn)化種子的相同方法處理這些種子。
N.C.＝未計數(shù)實例4 成熟種子中總蛋白質(zhì)含量的測定通過采用Bio-Rad蛋白測定試劑盒(Bio-RadLabs.)測定在例3中提取的總種子蛋白質(zhì)。將200μl試劑加進(jìn)799μl的蒸餾水中。然后加入1μl的樣品，并把混合物在室溫下放置30分鐘。測量該溶液在595nm波長處的吸光率。結(jié)果表明，降低的蕓苔素含量與總蛋白質(zhì)含量之間不相關(guān)(圖2)。
實例5 成熟種子蛋白的氨基酸成份分析將7個通過SDS-PAGE法確定的蕓苔素含量下降了的切成兩半的半粒種子放在適量冰凍丙酮中勻漿?；旌衔镫x心并將沉淀物干燥。然后將200μl70%的甲酸加進(jìn)干燥的沉淀中去溶解蛋白質(zhì)。離心之后將50μl的上清液除去、干燥，并在HCL蒸汽和氮氣存在的條件下，在110℃水解24小時。向水解產(chǎn)物中加入100μl檸檬酸緩沖液，并得混合物離心。對上清液(20μl)進(jìn)行氨基酸分析。對來自非轉(zhuǎn)化的B.napus cv.Westar的成熟種子進(jìn)行相同處理，并分析其氨基酸組成作為對照。該試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化種子的蛋白質(zhì)的氨基酸組成改變了，而且接近預(yù)計的結(jié)果，蕓苔素含量的降低被十字花科素含量的增加所補(bǔ)償。表2表示轉(zhuǎn)化種子里蛋白質(zhì)的氨基酸組成，其中，氨基酸用一個字母符號代表。

實例6 成熟種子中總脂肪酸含量和脂肪酸組成的分析將通過SDS-PAGE確定的蕓苔素含量降低了的10個切成兩半的半粒種子在5ml氯仿和甲醇(3∶1)中勻漿。將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中。將這一過程重復(fù)三次，收集所有上清液，在室溫下放置20分鐘。往上清液中加5ml蒸餾水和5ml氯仿，將混合物在4℃以3000rpm速度離心20分鐘。將下層轉(zhuǎn)移到一燒瓶中在30℃蒸發(fā)，同時加進(jìn)適量的乙醇。在蒸發(fā)提取物中加入50nmol甲基十五烷酸(C15∶0)和2ml溶在甲醇中的2.5%的硫酸溶液，甲基化反應(yīng)在80℃進(jìn)行2小時。然后加入2ml已烷，攪拌混合物并靜置。將上層-己烷層轉(zhuǎn)移到另一支試管中進(jìn)行真空干燥(Theor.Appl.Genet.，80，241-245，1990)。然后加入100μl已烷。通過氣相色譜法分析所得混合物(2μl)的脂肪酸(GC-9A，Shimadzu C0.;50m×0.25mmΦ×0.25μm膜Cyanopropy123柱，TOYO KASEI KOGYO C。.185℃，1ml/miknHe;Injector，200℃)。從未轉(zhuǎn)化B.napus cv.Westar的5粒種子中提取脂肪酸用作對照。將轉(zhuǎn)基因種子的脂肪酸組成同對照比較。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因種子的脂肪酸含量與對照的一樣，不過，在轉(zhuǎn)基因種子中油酸的含量下降而亞油酸和亞麻酸的含量增加(圖3)。
實例7 蕓苔素反義基因在后代植株中表達(dá)的檢測將在例2中的再生植株(T0代)所產(chǎn)生的種子(T1代)發(fā)芽并獲得新種子(T2代)。按照例3中所述方法測定新種子中蕓苔素的含量。同樣按照例5中所述方法測定種子脂肪酸的組成。結(jié)果表明，T2代種子中蕓苔素的含量也降低了，油酸的含量降低了，亞油酸和亞麻酸的含量增加了。
實例8 載體(pNACRU)的構(gòu)建(圖1)，導(dǎo)入了十字花科素反義基因的愈傷組織的轉(zhuǎn)化、篩選和表達(dá)。
按照上述PCR法分離出以cruA基因序列(Nuc.AcidRes.，17 3584，1989)為基礎(chǔ)的部分十字花科素基因。為此，重復(fù)在分離部分蕓苔素基因時所用方法，不同的是將cruA基因上從第680-700bp之間的21個堿基序列(5＇-AAAAACCACAACTAAGTA-3＇;SEQ ID No6)和與第1261-1278bp之間的18個堿基互補(bǔ)的序列(5＇-CACTGATGAGTCCTGGAA-3＇;SEQ ID No7)用作十字花科素的編碼區(qū)的引物。十字花科素編碼區(qū)在0.6kb左右有一條譜帶?；厥张c這條帶相應(yīng)的DNA，并將其克隆在質(zhì)粒pUC19的SamI位點(pCAS)上。pCAS(10ng)在做與蕓苔素基因相同的處理之后，切除十字花科素的編碼區(qū)并將其在反義方向上插在蕓苔素啟動子與NOS終止子之間。所得質(zhì)粒在進(jìn)行電擊法轉(zhuǎn)化時采用。用于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒按以下方法制備將得自質(zhì)粒pCRAS的包括蕓苔素啟動子、十字花科素反義基因和NOS終止子的DNA片段連接在pKM24的HindⅢ和EcoRⅠ位點上(pCAKM)。將所得質(zhì)粒按上述方法轉(zhuǎn)化到根瘤土壤桿菌EHA101中。具有導(dǎo)入的十字花科素反義基因的愈傷組織的轉(zhuǎn)化、篩選和再生以與例2相同的方式進(jìn)行，不同的是，把十字花科素編碼區(qū)上從第1個bp到上游第18個bp之間的序列(SEQ ID NO7)和與NOS終止子(如上)第1579-1595bp之間的17個堿基互補(bǔ)的序列用作PCR擴(kuò)增的引物。
實例9 成熟種子中蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析。
以與例5相同的方法，對通過SDS-PAGE測定的十字花科素含量降低了的8個切成兩半的半粒種子進(jìn)行氨基酸分析。分析結(jié)果表明，十字花科素反義基因的導(dǎo)入導(dǎo)致總蛋白質(zhì)的氨基酸組成中必需氨基酸，如半胱氨酸，甲硫氨酸和賴氨酸含量的增加。表3表示進(jìn)行過轉(zhuǎn)化的種子的氨基酸分析結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明，要改變油料種子作物種子里的氨基酸組成和脂肪酸組成是可行的。特別是，本發(fā)明提供的油料種子作物能產(chǎn)生具有理想的脂肪酸組成和/或氨基酸組成的高營養(yǎng)價值的種子，如油酸含量減少而亞油酸和亞麻酸含量增加的種子或必需氨基酸，如賴氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸含量提高了的種子。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人MITSUBISHI公司MITSUBISHI KASEI公司(ⅱ)發(fā)明名稱能產(chǎn)生具有改變過的氨基酸組成和脂肪酸組成的有用種子的油料種子作物(ⅲ)序列數(shù)7(ⅳ)有關(guān)地址(A)收信人(B)街道5-2，Marunouchi 2-chome，Chiyoda-Ku(C)城市東京(E)國家日本(F)郵政編碼100(ⅴ)計算機(jī)閱讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release ＃1.0，Version＃1.25
(ⅵ)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(ⅷ)律師/代理人資料(A)姓名(2)有關(guān)SEQ ID No1的數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型合成DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No1AAGCTTTCTT CATCGGTGA(2)有關(guān)SEQ ID No2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型合成DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No2CAAGATTAAA AACATACACGA(2)有關(guān)SEQ ID No3的資料(ⅰ)序列特征
(A)長度20bp(B)類型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型合成DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No3CTCATCAATA CAAACAAGAT(2)有關(guān)SEQ ID No4的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型合成DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No4TATGTAAGGT TTTATCTAGG(2)有關(guān)SEQ ID No5的資料(ⅰ)序列特征(A)長度17bp(B)類型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型合成DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No5GCATGACGTT ATTTATG(2)有關(guān)SEQ ID No6的資料(ⅰ)序列特征
(A)長度21bp(B)類型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型合成DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No6AAAAACCACA ACAACTAAGT A(2)有關(guān)SEQ ID No7的資料(ⅰ)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型合成DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No7CACTGATGAG TCCTGGAA
權(quán)利要求
1.一種用種子儲存蛋白的反義基因轉(zhuǎn)化的油料種子作物。
2.如權(quán)利要求1所述的油料種子作物，其特征在于所述種子儲存蛋白是蕓苔素(napin)。
3.如權(quán)利要求2所述的油料種子作物，其特征在于所述轉(zhuǎn)化是為了改變種子里的氨基酸組成和脂肪酸組成。
4.如權(quán)利要求3所述的油料種子作物，其特征在于所述改變脂肪酸組成是指改進(jìn)油酸、亞油酸和亞麻酸的含量。
5.如權(quán)利要求3所述的油料種子作物，其特征在于上述脂肪酸組成的改變是指提高亞油酸和亞麻酸的含量。
6.如權(quán)利要求1所述的油料種子作物，其特征在于編碼儲存蛋白的基因由nap A堿基序列表示。
7.如權(quán)利要求1所述的油料種子作物，其特征在于上述反義基因是以序列表中的SEQ ID No3堿基序列和SEQ ID No4堿基序列的互補(bǔ)序列為引物產(chǎn)生的合成DNA。
8.如權(quán)利要求1所述的油料種子作物，其特征在于儲存蛋白質(zhì)是十字花科素(cruciferin)。
9.如權(quán)利要求8所述的油料種子作物，其特征在于轉(zhuǎn)化是為了改變種子里的氨基酸組成。
10.如權(quán)利要求9所述的油料種子作物，其特征在于上述氨基組成的改變是指改進(jìn)賴氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的含量。
11.如權(quán)利要求9所述的油料種子作物，其特征在于上述氨基酸組成的改變是指賴氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸含量的提高。
12.如權(quán)利要求1所述的油料種子作物，其特征在于編碼儲存蛋白的基因由cruA堿基序列表示。
13.如權(quán)利要求1所述的油料種子作物，其特征在于反義DNA是以序列表中的SEQ ID No6堿基序列和與SEQ ID No7的堿基序列互補(bǔ)的序列為引物產(chǎn)生的合成DNA。
14.一種載體包括種子特異啟動子下游的一個油料作物種子儲存蛋白質(zhì)的反義基因。
15.一種制備轉(zhuǎn)化的油料種子作物的方法，其特征在于通過把權(quán)利要求14所述載體和油料種子作物的下胚軸或原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化、愈傷組織發(fā)育并由愈傷組織再生作物。
16.一種改變油料種子作物的氨基酸組成和/或脂肪酸組成的方法，其特征在于通過把權(quán)利要求14所述載體和油料種子作物的下胚軸或原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化油料種子作物。
17.從權(quán)利要求1所述油料種子作物中獲得的種子。
全文摘要
提供了一種氨基酸組成和/或脂肪酸組成改變了的油料種子作物。這種作物是通過把種子儲存蛋白的反義基團(tuán)導(dǎo)入油料種子作物而制備的。
文檔編號C12N15/82GK1105704SQ9410526
公開日1995年7月26日 申請日期1994年3月31日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月31日
發(fā)明者村瀨淳子, 今村順 申請人:三菱商事株式會社, 三菱化學(xué)株式會社