一種dna檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明實(shí)施例提供了一種DNA檢測(cè)試劑盒，包括脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA、磁珠修飾的捕捉DNA，所述脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物中，所述脂質(zhì)體包裹多個(gè)單顆粒量子點(diǎn)，檢測(cè)DNA通過酰胺鍵結(jié)合在所述脂質(zhì)體表面，所述磁珠修飾的捕捉DNA中，捕捉DNA通過酰胺鍵結(jié)合在所述磁珠表面，所述檢測(cè)DNA的序列與所述捕捉DNA的序列可分別與目標(biāo)DNA兩端的序列互補(bǔ)。該試劑盒檢測(cè)靈敏度高，達(dá)到10-18mol/L，且可用于多組分DNA的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明實(shí)施例還提供了上述DNA檢測(cè)試劑盒的制備方法和應(yīng)用。
【專利說明】—種DNA檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及DNA檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種DNA檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]在現(xiàn)有的DNA檢測(cè)技術(shù)中，基于PCR的目標(biāo)擴(kuò)增技術(shù)最為常用，但它需要多種引物，特殊的DNA聚合酶，以及精確控制的循環(huán)溫度來分離DNA雙鏈。目前，已逐步發(fā)展了一些恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如滾環(huán)擴(kuò)增，鏈置換擴(kuò)增和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等，這些恒溫?cái)U(kuò)增法提高了目標(biāo)分子擴(kuò)增效率，但仍需要一些特殊的處理方法和反應(yīng)條件，如預(yù)先熱處理變性，鎖式探針連接，多種引物和特殊的DNA聚合酶等，因而這類方法都較為復(fù)雜且花費(fèi)較高。
[0003]而基于單顆粒量子點(diǎn)的DNA探針，結(jié)合單分子檢測(cè)技術(shù)，目標(biāo)DNA的檢測(cè)對(duì)應(yīng)于量子點(diǎn)的熒光亮點(diǎn)數(shù)，該方法較簡(jiǎn)單，具有高的信躁比，并可進(jìn)行痕量檢測(cè)，但其靈敏度的提高主要受限制于量子點(diǎn)數(shù)目與所組裝的目標(biāo)DNA分子數(shù)目，檢測(cè)靈敏度只能達(dá)到10_15mol/L0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于此，本發(fā)明實(shí) 施例第一方面提供了一種DNA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒檢測(cè)靈敏度高，達(dá)到10_18mol/L，且可用于多組分DNA的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明實(shí)施例第二方面提供了一種DNA檢測(cè)試劑盒的制備方法，該方法操作簡(jiǎn)便。本發(fā)明實(shí)施例第三方面提供了 DNA檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)DNA中的應(yīng)用。
[0005]第一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種DNA檢測(cè)試劑盒，包括脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA、磁珠修飾的捕捉DNA,所述脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物中，所述脂質(zhì)體包裹多個(gè)單顆粒量子點(diǎn)，檢測(cè)DNA通過酰胺鍵結(jié)合在所述脂質(zhì)體表面，所述磁珠修飾的捕捉DNA中，捕捉DNA通過酰胺鍵結(jié)合在所述磁珠表面，所述檢測(cè)DNA的序列與所述捕捉DNA的序列可分別與目標(biāo)DNA兩端的序列互補(bǔ)。
[0006]本發(fā)明中，所述脂質(zhì)體的種類不做特殊限制，脂質(zhì)體可以為在特定條件下可以有效破碎并釋放出量子點(diǎn)的其它脂質(zhì)體類似結(jié)構(gòu)的材料。所述特定條件可為有機(jī)溶劑溶解、超聲、熱處理等破碎方法。
[0007]優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體可被氯仿溶劑有效破碎，使所述被包裹的多個(gè)單顆粒量子點(diǎn)釋放出來。
[0008]所述脂質(zhì)體由二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)，羧基化的二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE-PEG-C00H)和膽固醇形成。
[0009]本發(fā)明第一方面提供的DNA檢測(cè)試劑盒，以脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物為目標(biāo)DNA分子的熒光標(biāo)記物，旨在增加量子點(diǎn)的數(shù)目，使得一個(gè)目標(biāo)DNA分子對(duì)應(yīng)多個(gè)量子點(diǎn)熒光信號(hào)，從而提高了該試劑盒的檢測(cè)靈敏度，達(dá)到10_18mol/L，且可用于多組分DNA的同時(shí)檢測(cè)。
[0010]第二方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種DNA檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括:
[0011](I)脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA的制備方法,包括如下步驟:[0012](Ia)將脂質(zhì)體的原料與量子點(diǎn)加入到反應(yīng)器中，加入氯仿，在35~45°C均勻混合后，蒸干氯仿，氮?dú)饣驓鍤獯蹈?，再加入磷酸鹽緩沖溶液，超聲震蕩4~6min后，采用微孔過濾膜來回?cái)D壓過濾多次，得到脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物；
[0013](Ib)將表面羧基功能化的脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物，采用1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(EDC)活化10~15min，然后采用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化15~30min，再加入氨基封端的檢測(cè)DNA，室溫反應(yīng)1.5~2.5h，得到脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA ；
[0014](2)磁珠修飾的捕捉DNA的制備方法，包括如下步驟:
[0015]以1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為活化劑，將氨基封端的捕捉DNA與羧基功能化的磁珠混合反應(yīng)1.5~2.5h，磁性分離，離心純化，除去未反應(yīng)的捕捉DNA，得到磁珠修飾的捕捉DNA，所述檢測(cè)DNA的序列與所述捕捉DNA的序列可分別與目標(biāo)DNA兩端的序列互補(bǔ)。
[0016]本發(fā)明中，所述脂質(zhì)體的種類不做特殊限制，脂質(zhì)體可以為在特定條件下可以有效破碎并釋放出量子點(diǎn)的其它脂質(zhì)體類似結(jié)構(gòu)的材料。所述特定條件可為有機(jī)溶劑溶解、超聲、熱處理等破碎方法。
[0017]優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體的原料為形成的脂質(zhì)體可將多個(gè)單顆粒量子點(diǎn)包裹，并可被氯仿溶劑有效破碎，使所述被包裹的多個(gè)單顆粒量子點(diǎn)釋放出來。
[0018]優(yōu)選地，所述脂 質(zhì)體的原料為二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)，羧基化的二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE-PEG-C00H)和膽固醇。
[0019]優(yōu)選地，所述微孔過濾膜為聚碳酸酯膜或聚醚砜膜。
[0020]優(yōu)選地，所述磁性分離的具體操作為:將得到的產(chǎn)物置于磁力架上利用外磁場(chǎng)分離I~2min。
[0021 ] 第三方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了上述的DNA檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)DNA中的應(yīng)用，應(yīng)用的具體方法包括如下步驟:
[0022]按檢測(cè)DNA和捕捉DNA的摩爾比例為1:1，將脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA與磁珠修飾的捕捉DNA混合，加入到含有目標(biāo)DNA的溶液中，再向混合體系中加入緩沖液，所述緩沖液的組成為 IOOmmol, pH8.0 的 Tris-HCl, IOmmol (NH2)2SO4 和 3mmol MgCl2,控制溫度為40~45°C進(jìn)行雜化反應(yīng)30min后,置于磁力架上分離I~2min,得到純化后的雜交產(chǎn)物；所述檢測(cè)DNA的序列與所述捕捉DNA的序列可分別與目標(biāo)DNA兩端的序列互補(bǔ)；
[0023]將得到的所述雜交產(chǎn)物用超純水洗滌，蒸干水汽，氮?dú)饣驓鍤獯蹈珊?，加入I~3倍體積的氯仿，所述雜交產(chǎn)物分散于氯仿中，得到均相溶液，脂質(zhì)體破碎，單顆粒量子點(diǎn)釋放到溶液中，磁性分離后，取上層溶液進(jìn)行單分子檢測(cè)。
[0024]優(yōu)選地，所述含有目標(biāo)DNA的溶液中，所述目標(biāo)DNA為一種或多種。
[0025]優(yōu)選地，所述目標(biāo)DNA為多種時(shí)，采用不同顏色的量子點(diǎn)對(duì)不同目標(biāo)DNA進(jìn)行標(biāo)記。這樣操作，利用單分子檢測(cè)技術(shù)計(jì)數(shù)，各組分的檢測(cè)結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生相互干擾。
[0026]本發(fā)明提供的DNA檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用具有如下有益效果:
[0027](I)本發(fā)明將單顆粒量子點(diǎn)包裹于生物相容的脂質(zhì)體中，從而顯著增多量子點(diǎn)的數(shù)目，以形成的脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物來標(biāo)記檢測(cè)DNA，以磁珠修飾捕捉DNA，有利于進(jìn)行簡(jiǎn)單的磁性分離和純化，當(dāng)脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA和以磁珠修飾的捕捉DNA，與目標(biāo)DNA雜交結(jié)合時(shí)，形成經(jīng)典的“三明治”雜交結(jié)構(gòu)，從而建立了一個(gè)目標(biāo)DNA分子與多個(gè)單顆粒量子點(diǎn)熒光信號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，結(jié)合單分子檢測(cè)技術(shù)，因而能夠顯著提高檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)超靈敏的DNA檢測(cè)，其檢測(cè)限達(dá)到10_18mol/L ；
[0028] (2)本發(fā)明采用氯仿將脂質(zhì)體有效破碎，量子點(diǎn)能夠完全釋放出來且對(duì)熒光性能無影響，操作過程簡(jiǎn)便；
[0029](3)本發(fā)明提供的DNA檢測(cè)試劑盒，可進(jìn)行多組分DNA的同時(shí)檢測(cè)；
[0030](4)本發(fā)明提供的超靈敏的檢測(cè)DNA的方法，對(duì)于生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷以及基因表達(dá)研究具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明提供的DNA檢測(cè)試劑盒結(jié)合單分子檢測(cè)技術(shù)用于DNA檢測(cè)的整體方案設(shè)計(jì)圖；
[0032]圖2為實(shí)施例1中制備的綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)的TEM照片；
[0033]圖3為實(shí)施例1中綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)的紫外光譜圖；
[0034]圖4為實(shí)施例1中綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)的熒光光譜圖；
[0035]圖5為實(shí)施例1中脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物和脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物的熒光顯微鏡照片；
[0036]圖6為實(shí)施例1中脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物和脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物的尺寸分布圖；
[0037]圖7為實(shí)施例1脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物和脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物的熒光光譜圖；
[0038]圖8為實(shí)施例1脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物和脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物的TEM照片；
[0039]圖9為實(shí)施例1中從脂質(zhì)體中釋放出的綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)的尺寸分布圖；
[0040]圖10為實(shí)施例1中各階段量子點(diǎn)的熒光譜圖；
[0041]圖11為實(shí)施例1中各階段量子點(diǎn)的紫外光譜圖；
[0042]圖12、圖13、圖14為實(shí)施例1的單分子檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]以下所述是本發(fā)明實(shí)施例的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明實(shí)施例原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明實(shí)施例的保護(hù)范圍。
[0044]本發(fā)明提供一種DNA檢測(cè)試劑盒，包括脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA、磁珠修飾的捕捉DNA,所述脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物中，所述脂質(zhì)體包裹多個(gè)單顆粒量子點(diǎn),檢測(cè)DNA通過酰胺鍵結(jié)合在所述脂質(zhì)體表面，所述磁珠修飾的捕捉DNA中，捕捉DNA通過酰胺鍵結(jié)合在所述磁珠表面，所述檢測(cè)DNA的序列與所述捕捉DNA的序列可分別與目標(biāo)DNA兩端的序列互補(bǔ)。
[0045]本發(fā)明的DNA檢測(cè)試劑盒可根據(jù)待測(cè)目標(biāo)DNA溶液的具體組成而進(jìn)行設(shè)
[0046]計(jì)。圖1為本發(fā)明提供的DNA檢測(cè)試劑盒結(jié)合單分子檢測(cè)技術(shù)用于DNA檢測(cè)的整體方案設(shè)計(jì)圖。圖1中，α)合成脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物，合成脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA，以及合成磁珠修飾的捕捉DNA ; (ii)目標(biāo)DNA誘導(dǎo)的“三明治”雜交結(jié)構(gòu)的形成及磁性分離；(iii )脂質(zhì)體破碎，單顆粒檢測(cè)量子點(diǎn)數(shù)目。
[0047]實(shí)施例1
[0048]目標(biāo)DNA包括目標(biāo)DNAl和目標(biāo)DNA2,其序列分別為:
[0049]目標(biāo) DNAl (HIV-1):5’ -GCT ATA CAT TCT TAC TAT TTT ATT TAA TCC CAG-3’
[0050]目標(biāo) DNA2 (HIV-2):5，-TAG ATTT AGT TGC GCCT GGT CCT TT-3’
[0051 ] 根據(jù)上述的目標(biāo)DNAl和目標(biāo)DNA2設(shè)計(jì)DNA檢測(cè)試劑盒，具體地，在本實(shí)施例中，DNA檢測(cè)試劑盒包括脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNAl，脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA2，磁珠修飾的捕捉DNAl，磁珠修飾的捕捉DNA2 ；
[0052]其中，檢測(cè)DNAl、檢測(cè)DNA2、捕捉DNAl和捕捉DNA2的序列號(hào)為:
[0053]檢測(cè)DNAl: 5，-CTG GGA TTA AAT AAA A-A10_3，
[0054]檢測(cè)DNA2:5，-AAA GGA CCA GGC-A1(l-3，
[0055]捕捉DNAl: 5，-A10-TAG TAA GAA TGT ATA GC-3，
[0056]捕捉DNA2:5，-A10-GCA ACT AAA TTC A_3’
[0057]在本實(shí)施例中， 脂質(zhì)體由DSPC、DSPE-PEG-C00H、以及膽固醇形成，在其他實(shí)施方式中，脂質(zhì)體可以為在有機(jī)溶劑、超聲、熱處理等破碎條件下可以有效破碎并釋放出量子點(diǎn)的其它脂質(zhì)體類似結(jié)構(gòu)的材料。
[0058]上述的DNA檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括:
[0059](I)脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA的制備方法,包括如下步驟:
[0060](a)量子點(diǎn)的合成
[0061]硒儲(chǔ)備液的制備:在手套箱中將20mmol硒粉溶于20mL三辛基膦中，并將硒儲(chǔ)備液保存于手套箱中；
[0062]合成十八胺修飾的紅色熒光量子點(diǎn):0.2mmol氧化鎘和0.8mmol硬脂酸置于25mL三頸瓶中，在氬氣保護(hù)下升溫到120°C至氧化鎘溶解，再升溫至220°C生成白色硬脂酸鎘，然后冷卻至室溫,加入1.6g十八胺和7mL十八碳烯,升溫至100°C維持20min,然后進(jìn)一步升溫到270°C得到無色透明溶液，在此溫度下，迅速注入2mL硒儲(chǔ)備液，將反應(yīng)溫度降低至2500C，維持5min后停止反應(yīng)。待體系溫度降至80°C左右用甲醇和正己烷萃取純化處理三次，將得到的紅色熒光量子點(diǎn)保存于冰箱中；
[0063]合成十六胺修飾的綠色熒光量子點(diǎn):0.2mmol氧化鎘和0.8mmol硬脂酸置于25mL三頸瓶中，在氬氣保護(hù)下升溫到120°C至氧化鎘溶解，再升溫至220°C生成白色硬脂酸鎘，然后冷卻至室溫，加入0.7g十六胺和SmL十八碳烯，升溫至100°C維持20min得到無色透明溶液，繼續(xù)升高溫度至300°C，后撤去熱源，再迅速注入2mL硒儲(chǔ)備液和2mL十八碳烯。待體系溫度降至80°C左右用甲醇和正己烷萃取純化處理三次，將得到的綠色熒光量子點(diǎn)保存于冰箱中。
[0064](b)脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物的制備
[0065]將上述得到的量子點(diǎn)離心并溶于氯仿中，通過紫外、熒光光譜確定其濃度，將24 μ L, 0.lmol/L DSPC ；4 μ L, 1.0mmoI/L DSPE-PEG-COOH ;以及 15 μ L, 50mmol/L 膽固醇和1.211|1量子點(diǎn)加入圓底燒瓶中，再加入31^氯仿，在35-451:均勻混合。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)氯仿，三頸瓶?jī)?nèi)壁形成一層薄膜，通氬氣吹干。再向三頸瓶中加入2mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)，約30°C超聲振蕩至薄膜溶解。通過聚碳酸酯膜來回過濾三次，將得到的脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物室保存。采用上述方法分別制得脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物和脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物；
[0066](C)脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記檢測(cè)DNAl的制備:將表面羧基功能化的脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物用0.1mmol EDC活化15min,后加入25 μ mo I NHS活化30min。再加入24nmol氨基封端的檢測(cè)DNA1,室溫反應(yīng)2h后,離心純化lOmin。
[0067]脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記檢測(cè)DNA2的制備:將表面羧基功能化的脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物用0.1mmol EDC活化15min,后加入25 μ mo I NHS活化30min。再加入24nmol氨基封端的檢測(cè)DNA2,室溫反應(yīng)2h后,離心純化lOmin。
[0068]其中，氨基封端的檢測(cè)DNAl: 5 ’ -CTG GGA TTA AAT AAA A-A10-NH2-3 ’，氨基封端的檢測(cè) DNA2:5’ -AAA GGA CCA GGC-A1(l-NH2-3’。
[0069](2)磁珠修飾的捕捉DNA的制備方法，包括如下步驟:
[0070]以1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為活化劑，將25nmol氨基封端的捕捉DNAl與0.1mmol活化的羧基功能化的磁珠混合反應(yīng)2h，得到的產(chǎn)物置于磁力架上約lmin，進(jìn)行磁力分離并離心純化，除去未反應(yīng)的捕捉DNA1，得到磁珠修飾的捕捉DNAl ；
[0071]以1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為活化劑，將25nmol氨基封端的捕捉DNA2與0.1mmol活化的羧基功能化的磁珠混合反應(yīng)2h，得到的產(chǎn)物置于磁力架上約lmin，進(jìn)行磁力分離并離心純化，除去未反應(yīng)的捕捉DNA2，除去未反應(yīng)的捕捉DNA2，得到磁珠修飾的捕捉DNA2 ；
[0072]氨基封端的捕捉DNAl: 5’ -NH2-A10-TAG TAA GAA TGT ATA GC-3’
[0073]氨基封端的捕捉DNA2:5’ -NH2-A10-GCA ACT AAA TTC A_3’。
[0074]上述制得的DNA檢測(cè)試劑盒的具體應(yīng)用方法，包括:
[0075](1) “三明治”雜交結(jié)構(gòu)的形成:
[0076]配制緩沖液組成為IOOmM Tris-HCl, ρΗ8.0, IOmM(NH2)2SO4, 3mMMgCl2,加入目標(biāo)DNAl和目標(biāo)DNA2，控制檢測(cè)DNAl和捕捉DNAl的摩爾比例為1:1，檢測(cè)DNA2和捕捉DNA2的摩爾比例為1:1，將脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA1、磁珠修飾的捕捉DNAlJg質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA2、磁珠修飾的捕捉DNA2，加入到在緩沖液中，控制溫度為45°C，雜交反應(yīng)30min。將得到的產(chǎn)物置于磁力架上約lmin，利用外磁場(chǎng)進(jìn)行分離和純化。
[0077](2)脂質(zhì)體破碎:
[0078]將得到的“三明治”雜交產(chǎn)物用超純水洗兩次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將水份揮發(fā)，通入氬氣吹干至水份完全揮發(fā)。加入2倍體積氯仿，產(chǎn)物迅速分散得到均相溶液，脂質(zhì)體破碎，單顆粒量子點(diǎn)從中釋放出來，利用磁性分離取出上層溶液，進(jìn)行單分子檢測(cè)。
[0079](3)單分子檢測(cè)
[0080]單分子檢測(cè)裝置包括激光系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、光路系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)。其中，激光系統(tǒng)包括第一激光器、第二激光器和校準(zhǔn)器；進(jìn)樣系統(tǒng)包括動(dòng)載物臺(tái)和微流泵；光路系統(tǒng)包括第一分光片、第二分光片、通光孔、顯微物鏡、第一濾光片、第二濾光片、第一聚焦鏡、第二聚焦鏡；數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)包括第一檢測(cè)器、第二檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集器和計(jì)算機(jī)終端。利用單分子檢測(cè)裝置對(duì)從脂質(zhì)體中釋放出的綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。以488nm的氬激光器為激發(fā)光源，通過一個(gè)二向色鏡反射后經(jīng)油浸型物鏡的倒置顯微鏡聚焦，顯微物鏡的數(shù)值孔徑為1.3，最后在通光孔內(nèi)徑為50μπι的通道中激發(fā)樣品。綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)爆發(fā)的光子經(jīng)過第一分色鏡，然后經(jīng)過50 μ m的孔道，再由第二分色鏡進(jìn)行分離。綠色量子點(diǎn)爆發(fā)的信號(hào)經(jīng)帶通濾波器過濾后，通過雪崩光電二極管在綠色通道中檢出，同時(shí)，紅色量子點(diǎn)爆發(fā)的信號(hào)經(jīng)另一帶通濾波器過濾后，通過雪崩光電二極管在紅色通道中檢出，最后由數(shù)據(jù)采集器和計(jì)算機(jī)終端對(duì)第一檢測(cè)器和第二檢測(cè)器的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行采集處理。
[0081]圖2為本實(shí)施例制備的綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)的TEM照片，其中a為綠色量子點(diǎn)的TEM照片，b為紅色量子點(diǎn)的TEM照片。照片說明已成功合成了高質(zhì)量的綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)。從TEM照片可以看出所得到綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)高度分散且尺寸均一。
[0082]圖3中，a、b分別為本實(shí)施例的綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)的紫外光譜圖。圖4中，a、b分別為本實(shí)施例的綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)的熒光光譜圖。通過紫外，熒光光譜測(cè)定，計(jì)算出綠色量子點(diǎn)的平均尺寸為2.8±0.25nm，紅色量子點(diǎn)的平均尺寸為4.6±0.34nm。圖4的熒光光譜圖顯示綠色量子點(diǎn)熒光發(fā)射位置在537nm，紅色量子點(diǎn)熒光發(fā)射位置在612nm。
[0083]圖5的a和b分別為本實(shí)施例脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物和脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物的熒光顯微鏡照片。由此看出脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物具有極強(qiáng)的熒光性能且尺寸較均一。
[0084]圖6的a和b分別為本實(shí)施例脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物和脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物的尺寸分布圖。圖6的尺寸分布柱形圖通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量得到，表明脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物的平均尺寸為82±3.8nm，脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物的平均尺寸為90 ±3.5nm。
[0085]圖7為本實(shí)施例脂質(zhì)體 -綠色量子點(diǎn)復(fù)合物和脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物的熒光光譜圖。其中曲線I代表脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物，曲線2代表脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物。與原始綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)(圖4所示)相比，熒光發(fā)射峰位有5~7nm的紅移現(xiàn)象。表面電位測(cè)試表明脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物的表面電位為-32.7mV,脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物的表面電位為-37.2mV。
[0086]上述表征說明量子點(diǎn)已成功包覆于脂質(zhì)體中，且脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物由于表面負(fù)電荷的靜電斥力作用而具有良好穩(wěn)定性。另外，對(duì)脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物進(jìn)行了 TEM表征，如圖8所示，其中，a為脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物TEM照片，c為脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物TEM照片，b和d分別為脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物和脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物的高分辨TEM照片，TEM照片可以看出成百上千的單顆粒量子點(diǎn)已被包覆于脂質(zhì)體中，結(jié)合理論模型計(jì)算，證明一個(gè)脂質(zhì)體可包裹約1063個(gè)綠色量子點(diǎn)，648個(gè)紅色量子點(diǎn)。
[0087]圖9的a和b分別為本實(shí)施例從脂質(zhì)體中釋放出的綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)的尺寸分布圖。脂質(zhì)體破碎后，量子點(diǎn)由水相轉(zhuǎn)移至氯仿相中，表現(xiàn)出良好的單分散性和極強(qiáng)的熒光。對(duì)破碎后的量子點(diǎn)進(jìn)行尺寸分析，尺寸分布圖表明釋放出的綠色量子點(diǎn)平均尺寸為
2.5±0.28nm，紅色量子點(diǎn)平均尺寸為4.3±0.45nm，分別與原始的單顆粒綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)相近。[0088]另外，如圖10所示，其中，a圖中曲線I為原始綠色量子點(diǎn)熒光譜圖，曲線2為脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物熒光譜圖，曲線3為從脂質(zhì)體中釋放出的綠色量子點(diǎn)熒光譜圖；b圖中曲線I為原始紅色量子點(diǎn)熒光譜圖，曲線2為脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)熒光譜圖，曲線3為從脂質(zhì)體中釋放出的紅色量子點(diǎn)熒光譜圖。
[0089]如圖11所示，a圖中曲線I為原始綠色量子點(diǎn)紫外光譜圖，曲線2為脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)紫外光譜圖，曲線3為從脂質(zhì)體中釋放出的綠色量子點(diǎn)紫外光譜圖；b圖中曲線I為原始紅色量子點(diǎn)紫外光譜圖，曲線2為脂質(zhì)體/紅色量子點(diǎn)紫外光譜圖，曲線3為從脂質(zhì)體中釋放出的紅色量子點(diǎn)紫外光譜圖。圖10和圖11中的熒光光譜、紫外光譜也表明釋放出的量子點(diǎn)與原始量子點(diǎn)在熒光發(fā)射位置，紫外最大吸收位置上都沒有明顯差別，進(jìn)一步說明量子點(diǎn)的成功釋放。
[0090]為證明本發(fā)明有益效果，提供如下對(duì)照試驗(yàn):當(dāng)僅有目標(biāo)DNAl存在時(shí)，以及當(dāng)僅有目標(biāo)DNA2存在時(shí)，采用本實(shí)施例的DNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0091]圖12為單分子檢測(cè)結(jié)果。如圖12a所示，當(dāng)僅有目標(biāo)DNAl存在時(shí)，只能檢測(cè)到綠色量子點(diǎn)信號(hào)，而沒有檢測(cè)到紅色量子點(diǎn)信號(hào)。如圖12b所示，當(dāng)僅有目標(biāo)DNA2存在時(shí)，只能檢測(cè)到紅色量子點(diǎn)信號(hào)，而并沒有檢測(cè)到綠色量子點(diǎn)信號(hào)。當(dāng)同時(shí)存在目標(biāo)DNAl和目標(biāo)DNA2時(shí)，如圖12c，兩個(gè)通道中可分別檢測(cè)到綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)信號(hào)，且兩者沒有明顯的干擾。圖13為綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)熒光光子爆發(fā)數(shù)隨目標(biāo)DNAl和目標(biāo)DNA2濃度變化的關(guān)系。從對(duì)照實(shí)驗(yàn)中可以看出，當(dāng)加入非互補(bǔ)的DNA時(shí)，綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)的熒光信號(hào)均不能檢測(cè)到，說明單分子檢測(cè)技術(shù)信躁比高，并由此得出脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)用于檢測(cè)目標(biāo)DNAl的檢測(cè)限為1.0X 10_18mOl/L，脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)用于檢測(cè)目標(biāo)DNA2的檢測(cè)限為2.5X 10_18mol/L。另外，由于綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)間不會(huì)發(fā)生明顯的光譜重疊，此技術(shù)可成功用于多組分量子點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)，如圖14所示，為確定濃度下(目標(biāo)DNAl和目標(biāo)DNA2和濃度為0.1fM,脂 質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA和磁珠修飾的捕捉DNA濃度均為1.2 μ m),同時(shí)檢測(cè)目標(biāo)DNAl和目標(biāo)DNA2的柱形圖。圖14顯示，目標(biāo)DNAl和目標(biāo)DNA2同時(shí)存在時(shí)，檢測(cè)到的綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)的數(shù)目與目標(biāo)DNAl和目標(biāo)DNA2分別存在時(shí)的結(jié)果相一致。
[0092]實(shí)施例2
[0093]目標(biāo)DNA只包括目標(biāo)DNAl,其序列為:
[0094]目標(biāo) DNAl (HIV-1):5’ -GCT ATA CAT TCT TAC TAT TTT ATT TAA TCC CAG-3’
[0095]根據(jù)上述的目標(biāo)DNAl設(shè)計(jì)DNA檢測(cè)試劑盒，具體地，在本實(shí)施例中，DNA檢測(cè)試劑盒包括脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA1,磁珠修飾的捕捉DNAl ；
[0096]其中，檢測(cè)DNAl、捕捉DNAl的序列號(hào)為:
[0097]檢測(cè)DNAl: 5，-CTG GGA TTA AAT AAA A-A10_3，
[0098]捕捉DNAl: 5，-A10-TAG TAA GAA TGT ATA GC-3，
[0099]在本實(shí)施例中，脂質(zhì)體由DSPC、DSPE-PEG-C00H、以及膽固醇形成，在其他實(shí)施方式中，脂質(zhì)體可以為在有機(jī)溶劑、超聲、熱處理等破碎條件下可以有效破碎并釋放出量子點(diǎn)的其它脂質(zhì)體類似結(jié)構(gòu)的材料。
[0100]上述的DNA檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括:
[0101](I)脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNAl的制備方法[0102]同實(shí)施例1。
[0103](2)磁珠修飾的捕捉DNAl的制備方法
[0104]同實(shí)施例1。
[0105]上述制得的DNA檢測(cè)試劑盒的具體應(yīng)用方法，包括:
[0106](I) “三明治”雜交結(jié)構(gòu)的形成:
[0107]配制緩沖液組成為IOOmM Tris-HCl, pH8.0, IOmM(NH2)2SO4, 3mM MgCl2,加入目標(biāo)DNAl，控制檢測(cè)DNAl和捕捉DNAl的摩爾比例為1:1，將脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNAl和磁珠修飾的捕捉DNAl，加入到緩沖液中，控制溫度為40°C，雜交反應(yīng)30min。將得到的產(chǎn)物置于磁力架上約lmin，利用外磁場(chǎng)進(jìn)行分離和純化。
[0108](2)脂質(zhì)體破碎:
[0109]將得到的“三明治”雜交產(chǎn)物用超純水洗兩次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將水份揮發(fā)，通入氬氣吹干至水份完全揮發(fā)。加入3倍體積氯仿，產(chǎn)物迅速分散得到均相溶液，脂質(zhì)體破碎，單顆粒量子點(diǎn)從中釋放出來，利用磁性分離取出上層溶液，進(jìn)行單分子檢測(cè)。
[0110]實(shí)施例3
[0111]目標(biāo)DNA只包括目標(biāo)DNA2,其序列為:
[0112]目標(biāo) DNA2 (HIV-2):5，-TAG ATTT AGT TGC GCCT GGT CCT TT-3’
[0113]根據(jù)上述的目標(biāo)DNA2設(shè)計(jì)DNA檢測(cè)試劑盒，具體地，在本實(shí)施例中，DNA檢測(cè)試劑盒包括脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA2,磁珠修飾的捕捉DNA2 ；
[0114]其中，檢測(cè)DNA2、捕捉DNA2的序列號(hào)為:
[0115]檢測(cè)DNA2:5’ -AAA GGA CCA GGC-A1(l-3’
[0116]捕捉DNA2:5’ -A10-GCA ACT AAA TTC A_3’
[0117]在本實(shí)施例中，脂質(zhì)體由DSPC、DSPE-PEG-C00H、以及膽固醇形成，在其他實(shí)施方式中，脂質(zhì)體可以為有機(jī)溶劑、超聲、熱處理等破碎條件下可以有效破碎并釋放出量子點(diǎn)的其它脂質(zhì)體類似結(jié)構(gòu)的材料。
[0118]上述的DNA檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括:
[0119](I)脂質(zhì)體-紅色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA2的制備方法
[0120]同實(shí)施例1。
[0121](2)磁珠修飾的捕捉DNA2的制備方法
[0122]同實(shí)施例1。
[0123]上述制得的DNA檢測(cè)試劑盒的具體應(yīng)用方法，包括:
[0124](I) “三明治”雜交結(jié)構(gòu)的形成:
[0125]配制緩沖液組成為IOOmM Tris-HCl，ρΗ8.0，IOmM(NH2)2SO4, 3mMMgCl2，加入目標(biāo)DNA2，控制檢測(cè)DNA2和捕捉DNA2的摩爾比例為1:1，將脂質(zhì)體-綠色量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA2和磁珠修飾的捕捉DNA2，加入到緩沖液中，控制溫度為45°C，雜交反應(yīng)30min。將得到的產(chǎn)物置于磁力架上約2min，利用外磁場(chǎng)進(jìn)行分離和純化。
[0126](2)脂質(zhì)體破碎:
[0127]將得到的“三明治”雜交產(chǎn)物用超純水洗兩次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將水份揮發(fā)，通入氮?dú)獯蹈芍了萃耆珦]發(fā)。加入I倍體積氯仿，產(chǎn)物迅速分散得到均相溶液，脂質(zhì)體破碎，單顆粒量子點(diǎn)從中釋放出來，利用磁性分離取出上層溶液，進(jìn)行單分子檢測(cè)。[0128]本發(fā)明通過脂質(zhì)體-量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)DNA，磁珠功能化的捕捉DNA，以及目標(biāo)DNA所形成“三明治”雜交結(jié)構(gòu)，利用簡(jiǎn)單外磁場(chǎng)進(jìn)行分離和純化。最后將單顆粒量子點(diǎn)從脂質(zhì)體中釋放出來，用單分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)單顆粒量子點(diǎn)計(jì)數(shù)，建立了一個(gè)目標(biāo)DNA分子與多個(gè)單顆粒量子點(diǎn)熒光信號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，結(jié)合單分子檢測(cè)技術(shù)，顯著提高了檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)超靈敏的DNA檢測(cè)，其檢測(cè)限達(dá)到1 0 _18mOl/L。
【權(quán)利要求】
1.一種DNA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA、磁珠修飾的捕捉DNA,所述脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物中,所述脂質(zhì)體包裹多個(gè)單顆粒量子點(diǎn),檢測(cè)DNA通過酰胺鍵結(jié)合在所述脂質(zhì)體表面，所述磁珠修飾的捕捉DNA中，捕捉DNA通過酰胺鍵結(jié)合在所述磁珠表面，所述檢測(cè)DNA的序列與所述捕捉DNA的序列可分別與目標(biāo)DNA兩端的序列互補(bǔ)。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述脂質(zhì)體可被氯仿溶劑有效破碎，使被包裹的所述多個(gè)單顆粒量子點(diǎn)釋放出來。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述脂質(zhì)體由二硬脂酰磷脂酰膽堿，羧基化的二硬脂?；字Ｒ掖及泛湍懝檀夹纬?。
4.一種DNA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，包括: (1)脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA的制備方法，包括如下步驟: (Ia)將脂質(zhì)體的原料與量子點(diǎn)加入到反應(yīng)器中，加入氯仿，在35~45°C均勻混合后，蒸干氯仿，氮?dú)饣驓鍤獯蹈?，再加入磷酸鹽緩沖溶液，超聲震蕩4~6min后，采用微孔過濾`膜來回?cái)D壓過濾多次，得到脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物； (Ib)將表面羧基功能化的脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物，采用1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺活化10~15min，然后采用N-羥基琥珀酰亞胺活化15~30min，再加入氨基封端的檢測(cè)DNA，室溫反應(yīng)1.5~2.5h，得到脂質(zhì)體-量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA ； (2)磁珠修飾的捕捉DNA的制備方法，包括如下步驟: 以1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺為活化劑，將氨基封端的捕捉DNA與羧基功能化的磁珠混合反應(yīng)1.5~2.5h，磁性分離，離心純化，除去未反應(yīng)的捕捉DNA，得到磁珠修飾的捕捉DNA，所述檢測(cè)DNA的序列與所述捕捉DNA的序列可分別與目標(biāo)DNA兩端的序列互補(bǔ)。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體的原料為形成的脂質(zhì)體可將多個(gè)單顆粒量子點(diǎn)包裹，并可被氯仿溶劑有效破碎，使被包裹的所述多個(gè)單顆粒量子點(diǎn)釋放出來。
6.如權(quán)利要求4所述的DNA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體的原料為二硬脂酰磷脂酰膽堿，羧基化的二硬脂?；字Ｒ掖及泛湍懝檀?。
7.如權(quán)利要求4所述的DNA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述微孔過濾膜為聚碳酸酯膜或聚醚砜膜。
8.如權(quán)利要求1所述的DNA檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)DNA中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用的具體方法包括如下步驟: 按檢測(cè)DNA和捕捉DNA的摩爾比例為I 將脂質(zhì)體_量子點(diǎn)復(fù)合物標(biāo)記的檢測(cè)DNA與磁珠修飾的捕捉DNA混合，加入到含有目標(biāo)DNA的溶液中，再向混合體系中加入緩沖液，所述緩沖液的組成為 IOOmmol，ρΗ8.0 的 Tris-HCl，IOmmol (NH2)2SO4 和 3mmol MgCl2，控制溫度為40~45°C進(jìn)行雜化反應(yīng)30min后,置于磁力架上分離I~2min,得到純化后的雜交產(chǎn)物；所述檢測(cè)DNA的序列與所述捕捉DNA的序列可分別與目標(biāo)DNA兩端的序列互補(bǔ)； 將得到的所述雜交產(chǎn)物用超純水洗滌，蒸干水汽，氮?dú)饣驓鍤獯蹈珊?，加入I~3倍體積的氯仿，所述雜交產(chǎn)物分散于氯仿中，得到均相溶液，脂質(zhì)體破碎，單顆粒量子點(diǎn)釋放到溶液中，磁性分離后，取上層溶液進(jìn)行單分子檢測(cè)。
9.如權(quán)利要求8所述的DNA檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)DNA中的應(yīng)用，其特征在于，所述含有目標(biāo)DNA的溶液中，所述目標(biāo)DNA為一種或多種。
10.如權(quán)利要求9所述的DNA檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)DNA中的應(yīng)用，其特征在于，所述目標(biāo)DNA為多種時(shí)，采用不同顏 色的量子點(diǎn)對(duì)不同目標(biāo)DNA進(jìn)行標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103509857SQ201310253848
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月24日
【發(fā)明者】張春陽, 周娟, 王強(qiáng)心 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院