基于顏色的逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測腸道病毒基因組5’-utr的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，手足口病檢測網(wǎng)絡(luò)實驗室，哨點醫(yī)院等用于對手足口病疑似病患咽拭子、肛拭子、腦脊液、皰疹液、糞便等標(biāo)本的腸道病毒感染的檢測和監(jiān)測。具體是應(yīng)用基于顏色的逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)(RT-GEAR)，通過計算機(jī)軟件分析腸道病毒基因組5’-UTR的保守序列，分別設(shè)計出四條引物完全與識別基因靶序列中五個結(jié)合區(qū)匹配，并于反應(yīng)前加入HNB(羥基萘酚藍(lán))染料，只需一步就可完成在63℃等溫環(huán)境中擴(kuò)增1小時，最后用肉眼觀察染料顏色變化和管底的白色沉淀判定檢測結(jié)果，與傳統(tǒng)的病毒分離、血清學(xué)檢測、RT-PCR方法等比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優(yōu)勢。
【專利說明】基于顏色的逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測腸道病毒基因組 5, -UTR 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明是用基于HNB顏色的逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)（Reverse transcription isothermal genome exponential amplification reaction,RT-GEAR)檢測人感染腸道病 毒基因組5'端非翻譯區(qū)（5' -Untranslated region，5' -UTR)。用于各級疾病預(yù)防控制機(jī) 構(gòu)，手足口病檢測網(wǎng)絡(luò)實驗室，哨點醫(yī)院對人感染腸道病毒的檢測和監(jiān)測。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 腸道病毒感染廣泛分布于全球各地，人的一生中往往會經(jīng)歷多次感染。腸道病毒 可直接引多種疾病，如手足口病、脊髓灰質(zhì)炎、無菌性腦膜炎、皰疹性咽峽炎、結(jié)膜炎、流行 性肌痛、甲型肺炎等。2008年以來，由腸道病毒引起的手足口病出現(xiàn)大規(guī)模流行，發(fā)病人數(shù) 呈快速上升趨勢,范圍遍及全國，引起國家和社會的廣泛關(guān)注。
[0004] 手足口病（Hand-foot-mouth Disease，HFMD)是由多種人腸道病毒引起的一種兒 童常見傳染病，是我國法定報告管理的丙類傳染病。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、 口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。少數(shù)患者可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻 痹、神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎等，個別重癥患兒病情進(jìn)展快，可導(dǎo)致死亡。引起手足口病的 病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括柯薩奇病毒A組、柯薩奇病毒B組、腸道病毒71型 (Enterovirus71，EV71)、?？刹《镜?8種腸道病毒血清型。
[0005]為有效阻止疫情的爆發(fā)和發(fā)生疫情后的應(yīng)急處置，根據(jù)衛(wèi)生部應(yīng)對手足口疫情防 控要求，我國已決定在各地增加病毒檢測實驗室和哨點醫(yī)院，擴(kuò)大監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的覆蓋范圍。將 網(wǎng)絡(luò)實驗室擴(kuò)大到整個地市一級，目標(biāo)是使全國300多個地市都具備能夠進(jìn)行病毒檢測的 能力，及早發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)人傳人病例，切實做到早發(fā)現(xiàn)、早報告、早處置。本專利成功建立的 基于HNB顏色的逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測人感染腸道病毒基因組5'-UTR方法，將為提高我 國疾病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室和哨點醫(yī)院的監(jiān)測能力，實現(xiàn)對手足口病人的快速篩查提供了有力 的技術(shù)保障。
[0006]基于HNB顏色的逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)（RT-GEAR)在RNA病毒的檢測方面應(yīng)該有著 傳統(tǒng)基因診斷方法無法比擬的優(yōu)勢，與一些常規(guī)的基因檢測手段相比，該技術(shù)在可操作性 和檢測時間及設(shè)備要求方面具有更大的優(yōu)勢。這主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，它的檢 測時間可以縮短到1小時以內(nèi)，靈敏度可達(dá)到檢測1000個拷貝以上的病毒核酸分子。除了 應(yīng)用一些常用聚合酶外，對硬件設(shè)備基本無特殊要求，在普通的生物實驗室就可完成這項 檢測工作。在試驗實施中只需一步就可完成實驗操作,減少了污染機(jī)會并方便了實驗過程 中的質(zhì)控工作。第二，該技術(shù)省略了單獨的逆轉(zhuǎn)錄和巢式PCR的二次擴(kuò)增步驟，加之?dāng)U增反 應(yīng)在 63°C等溫條件下進(jìn)行，沒有核酸的變復(fù)性過程，不但節(jié)省了大量的時間又減少了 RNA 酶和擴(kuò)增核酸的污染機(jī)會。第三，擴(kuò)增反應(yīng)只有在四條引物完全與識別的靶序列中五個結(jié) 合區(qū)匹配的情況下才能順利進(jìn)行，所有這些特性都在很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)的背景， 從而使檢測特異性得到改善。第四，RT-GEAR的擴(kuò)增反應(yīng)中可以形成可視的焦磷酸鎂白色 沉淀，HNB染料在擴(kuò)增前加入，因此肉眼也可觀察到陽性反應(yīng)管中的白色混濁物和反應(yīng)管內(nèi) 顏色的變化，可以直接判定檢測結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 1.本發(fā)明是對目前對RNA病毒檢測技術(shù)手段的改進(jìn)和補充，它具有安全、特異、靈 敏、便捷的優(yōu)勢。這主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，檢測時間短靈敏度高。整個檢測時間 可縮短至1小時內(nèi)，靈敏度可與實時熒光定量PCR媲美。其次，特異性高。所設(shè)計的四條特 異性引物，只在其與識別靶序列中五個結(jié)合區(qū)完全匹配的情況下擴(kuò)增才能順利進(jìn)行。然后， 所有的擴(kuò)增過程都可在63°C等溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬件的要求。最后，污 染機(jī)會低和結(jié)果可視化。。
[0008] 2.選擇腸道病毒基因組5'-UTR(Untranslated region，非翻譯區(qū)）的相對保守區(qū) 設(shè)計相應(yīng)的RT-GEAR引物，針對每個基因分別包括兩條嵌合引物（FT、BT)和兩條加速引物 (IF、IR)。所有引物的具體序列見表1。
[0009] 表1 :逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測腸道病毒基因組5' -UTR的引物序列
[0010]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于腸道病毒感染的檢測，基于HNB(羥基萘酚藍(lán)）顏色的逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù) (RT-GEAR)，其中包括：用于腸道病毒基因組5' -UTR(Untranslated Region，非翻譯區(qū)）檢 測的4條寡核苷酸引物和HNB(羥基萘酚藍(lán)）染料。所述引物序列為： panEV-FT ：5, -GTTAGGATTAGCCGCATTCAGGGGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCT-3; panEV-BT ：5, -CCCTGAATGCGGCTAATCCTAACGAAACACGGACACCCAAA-3; panEV-IF :5' -GCCGGAGGACTACTAACT-3' panEV-IR:5' -GCAGCGGAACCGACTAC-3'。
2. 權(quán)利要求1所述的腸道病毒感染的檢測的逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)（RT-GEAR)的引物所 列的基因序列及其每種序列的互補序列或變體。
3. 權(quán)利要求1所述的腸道病毒感染的檢測的逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)（RT-GEAR)包括人感 染各型別腸道病毒及其變異株。
4. 權(quán)利要求3所述的本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，手足口病檢測網(wǎng) 絡(luò)實驗室，哨點醫(yī)院用于人感染腸道病毒基因組5' -UTR的檢測和監(jiān)測。
5. 權(quán)利要求1所述的人感染腸道病毒基因組5' -UTR的檢測，基于HNB顏色的逆轉(zhuǎn)錄 等溫擴(kuò)增技術(shù)（RT-GEAR)的反應(yīng)程序和檢測程序。
【文檔編號】C12Q1/70GK104232788SQ201310248493
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月21日
【發(fā)明者】馬學(xué)軍, 聶凱, 許文波, 張勇 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所